实体肿瘤因其较高的发病率与死亡率,是严重危害人类健康的原因之一[1]。肿瘤检测技术可以应用于肿瘤治疗前的早期诊断、筛查、肿瘤的治疗以及治疗后的预后评价,是恶性肿瘤诊疗的前提和基础。目前常用的检测技术有传统的组织穿刺活检和影像学检查等,但是传统的检测方法由于存在结果不准确、检查过程中易产生损伤、检查成本高等缺点,严重制约了恶性肿瘤的治疗和肿瘤学科的发展。
而液体活检是利用人体体液(血液、尿液,胸腹水,脑脊液,唾液等)作为标本来源检测获取肿瘤相关信息的技术,它是一种简单且非侵入性的组织活检替代方法[2],可以监测原位肿瘤或转移灶释放到体液中的异常分子,相比于有创的肿瘤组织活检,前者可避免发生感染、减轻患者疼痛和减少手术并发症的发生,并可重复连续地监测肿瘤标志物的变化,综合评判患者的整体状况[3-4]。在肿瘤检测方面有较高的准确性和安全性,决定了其在肿瘤筛查与治疗领域具有重大的作用和意义。
1 基于循环肿瘤DNA的微小残留病检测
微小残留病(minimal residual disease, MRD)是指经过治疗后在患者体内发现的肿瘤来源的异常分子,包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)和外泌体DNA(exosome DNA)[5]。MRD是癌症进展的一个隐蔽阶段,目前传统的医学成像方式或实验室检查无法检测到其存在,其检出可能代表了肿瘤的持续存在并且发生临床进展。
MRD检测和监测早已在血液系统肿瘤中广泛应用[6-8],而实体瘤的一大特点是从癌细胞脱落并进入血液中的异常分子在血液中浓度极低,因此MRD检测在实体瘤患者中普遍应用仍具有一定挑战。然而,在过去的几年里,由于实时、高灵敏度液体活检的出现,检测ctDNA的技术取得较大进展,使MRD在实体瘤患者中得以识别[9-14]。ctDNA片段由肿瘤细胞释放入血,原则上包含与肿瘤细胞起源相同的遗传缺陷,如点突变、重排、扩增,甚至基因拷贝变异,在肿瘤学领域中具有重要的意义,可以为肿瘤的早期诊断、疾病监测、治疗选择和个性化治疗提供重要支持[15-17]。基于此,这篇综述概述了基于ctDNA的检测和表征实体瘤MRD的方法,重点讨论了ctDNA的MRD检测以及其在实体肿瘤疾病中的应用,并提出未来ctDNA MRD的应用前景及目前研究仍存在的不足。
2 MRD的检测方法及特点
目前常用的MRD检测技术有流式细胞术、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)、二代测序(next-generation sequencing, NGS)[18]。
2.1 流式细胞术
流式细胞术是一种基于免疫表型的检测方法,通过检测癌细胞表面的特定抗原来判断MRD是否存在。这种方法主要应用于血液系统恶性肿瘤的MRD检测,如急性白血病和淋巴瘤等。而对于实体瘤,如乳腺癌、膀胱癌等,这些疾病的癌细胞通常具有特定的基因或基因组变异,PCR和NGS等基于DNA或RNA的方法更为常用。
2.2 PCR
PCR[包括定量PCR(quantitative PCR, qPCR)、数字PCR(digital PCR, ddPCR)]是一种基于DNA扩增的方法,通过检测癌细胞的特定基因或基因组区域来判断MRD是否存在。但是,PCR检测存在一些局限性,如扩增引物设计受到目标序列限制,对不同样本的适用性差异较大,难以同时检测多个位点,同时其检测结果易受到污染、样本稀释和检测门限的影响。
2.3 NGS
NGS作为一种高通量测序技术,通过检测癌细胞基因组或转录组来判断MRD是否存在,相较于PCR,它可以同时检测多个目标区域的DNA序列,检测到更低水平的MRD,并能够检测出更多的变异类型,提供更为全面的信息,如基因突变、基因重排等,因此在某些情况下比PCR方法更为灵敏和特异,结果可靠性更高。此外,NGS检测还可以进行无损组织检测,不需要侵入性的组织采样。但是,NGS检测的操作复杂,需要高端设备和技术人员,成本较高,样本处理和分析时间较长。
MRD检测需要从大量的正常细胞群中检测出残存肿瘤细胞,因此检测技术要具备特异性和敏感性。随着基因测序技术和生物信息学的发展,目前在各种恶性肿瘤患者中基于检测微量ctDNA的方法进行实时、高灵敏度的液体活检成为检测MRD的主要方法[2,19]。
NGS作为一种新兴的MRD检测技术,可以对ctDNA进行定量和定性分析,使用超深测序和靶向面板甚至可以寻找患者特异性的等位基因以观测到早期癌症中的低频变异[20-21]。其中,循环肿瘤DNA个性化深度检测(cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq)是一种基于深度测序的癌症个性化分析技术。它的主要原理是通过捕获和测序肿瘤DNA中的突变位点,从而获得肿瘤基因组的突变谱。相比传统的基因突变检测方法,CAPP-Seq能够检测到低频突变,具有更高的灵敏度和特异度。此外,CAPP-Seq还可以检测肿瘤中的基因拷贝数变异和结构变异等信息,提供更全面的肿瘤基因组特征[22]。
总的来说,不同的MRD检测方法各有优劣,选择合适的方法需要考虑多种因素,如样本来源、检测灵敏度和特异度、成本等。
3 ctDNA MRD在肿瘤中的应用
3.1 预测复发、判断预后
目前MRD检测主要在血液系统肿瘤中用于疾病的复发预测和预后判断[23]。近年来,基于ctDNA检测的MRD在多种实体肿瘤中均被证实可作为有效监测复发、判断预后的标志物[24-28]。研究者大多通过在术后(或放化疗后)测量患者ctDNA水平,以监测术后ctDNA MRD清除的情况从而得出上述结论。
在肺癌的TracerX研究中,研究者通过检测根治术后的肺癌患者ctDNA突变情况,发现疾病复发较影像学平均提前约70 d,证明ctDNA作为MRD检测具有可行性并肯定了MRD检测对预测NSCLC术后复发具有预测价值[29];Chaudhuri等[27]定义ctDNA水平≥0.003%突变等位基因分数表示存在MRD,发现在治疗结束后4个月内检测到的ctDNA MRD能够有效识别最终高风险局部肺癌复发的患者,而在相同MRD标志点的计算机体层成像却无法预测,此外在72%复发的患者中,治疗后ctDNA MRD阳性比影像学进展提前发现疾病复发早5.2个月。结肠癌研究中,Tie等[30-31]发现230例Ⅱ期患者术后4
10周的ctDNA MRD预示了最终影像学复发(HR: 18;95%CI: 7.940),其阳性先于影像学复发的中位时间为5.5个月,并且先于CEA蛋白生物标志物检测3.5个月的中位时间,此外,结肠癌新辅助放化疗后检测的ctDNA MRD也能有效预测复发(P<0.001)。近年来,在乳腺癌[25]、胰腺癌[32]和膀胱癌[33]的相关研究中也能得到类似的结论。
上述研究说明了使用ctDNA MRD预测复发风险不仅有利于有复发风险的高风险患者,而且可能使低风险患者避免与辅助全身治疗相关的潜在严重疾病。此外,上述研究结果均显示治疗后ctDNA MRD阴性的患者与阳性患者相比,无进展生存期显著改善,可以看出ctDNA MRD分析在判断预后方面具有显著优势。总之,MRD具有优越的预示疾病复发的作用,相比于传统的临床检查、影像学检查和有创组织活检,其检出能更早提示临床医生疾病发生进展,从而指导临床医生进行早期干预。
3.2 指导治疗、评估疗效
除了预测疾病复发、判断预后外,使用ctDNA检测MRD还可以参与指导临床决策。治疗后ctDNA MRD的由阳转阴说明了手术或辅助治疗等临床手段可以清除MRD,对疾病的进展产生影响。同时,来自ctDNA分析的基因组信息可以为肿瘤进展过程中MRD的分子进化提供线索,通过进行基于分子治疗反应的患者风险分层,达到治疗临床获益的最大化: 一方面,对低风险患者实施治疗降级,从而免受辅助治疗的毒性;另一方面,对高风险患者加强积极辅助治疗,使疾病负担和克隆异质性达到最小[20]。
在治疗过程中动态监测与获得性治疗耐药和克隆进化相关的突变,从而指导临床医生选择适当的靶向治疗,并可根据ctDNA分析结果调整辅助治疗的强度和持续时间[18]。肿瘤耐药是目前治疗恶性肿瘤过程中面临的主要问题之一,原发肿瘤标本仍然是最广泛用于寻找治疗靶点的来源。然而治疗诱导的转移起始克隆选择可能导致原发肿瘤和转移性病变之间产生实质性差异,某些肿瘤的转移性复发可在原发肿瘤切除十余年后发生,为播散肿瘤细胞的遗传进化创造了相当大的空间[34],因此,通过分析原发肿瘤获得的信息可能不能反映转移性肿瘤细胞的实际特征。此时,ctDNA MRD的分析作为一种微创、实时监测治疗诱导肿瘤进化的新工具存在极大优势,靶向治疗往往依赖于编码治疗靶点或靶点上游或下游信号蛋白的基因突变,这些预测性生物标志物通常是ctDNA分析的主要目标。在全基因组扩增后,对单个ctDNA进行评估可以提供关于这些突变的额外背景信息,从而得知关于肿瘤DNA起源的更全面的信息[35-36]。
近年来,已开展不少关于实体肿瘤如乳腺癌[37-38]、前列腺癌[39]、结肠癌[40,51]、胃癌[41-42]和肺癌[27]的相关研究,通过ctDNA MRD监测新产生的肿瘤耐药突变基因或拷贝数来得知肿瘤对新辅助化疗的反应,对患者进行风险分层,从而指导早期干预,改善患者预后;或是术后利用特定基因突变(如乳腺癌TP53、PIK3CA和ESR1突变;前列腺癌AR通路相关基因突变;胃癌HER2突变;结肠癌、肺癌EGFR突变等)来检测辅助治疗或新辅助治疗前ctDNA MRD,精准指导临床医生应用靶向药进行干预,并监测ctDNA水平变化分析疗效。
有研究以三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)患者为研究对象,在他们接受新辅助化疗期间检测ctDNA[37-38]。他们采用了一种名为患者异质性突变检测(patient-specific mutation detection, PSMD)的方法,该方法可以根据每个患者的个体突变情况,设计出针对特定患者的ctDNA检测方法,从而实现高灵敏度和高特异度的检测。在接受新辅助化疗的TNBC患者中,ctDNA阳性率为64%,其中ctDNA阳性患者的无病生存率和总生存率明显低于ctDNA阴性患者。此外,ctDNA的动态变化也可以作为治疗反应和预后的指标,ctDNA消失或持续下降的患者在治疗后的生存率明显高于ctDNA持续升高或波动的患者。该研究结果表明,ctDNA检测可以成为一种非侵入性的TNBC患者治疗反应和预后监测的方法,为个体化治疗和指导治疗策略的制定提供了重要的支持。
总体而言,ctDNA MRD检测可能会从根本上改变癌症辅助治疗过程,在精准医疗时代提供临床决策支持和改善患者生存结局方面有深刻的影响。
4 ctDNA MRD的临床应用前景与不足
目前有越来越多研究作为证据支持ctDNA可以作为实体肿瘤MRD生物标志物,具有指导治疗决策的潜力。c-TRAK-TN是第一项前瞻性评估ctDNA用于乳腺癌MRD检测的研究,这一研究具有重要的临床意义,它首次使用ctDNA MRD检测动态监控来确定中高危三阴性乳腺癌患者,并前瞻性地以强化治疗进行干预,再次力证ctDNA MRD检测在临床上的预后判断价值[43]。ctDNA MRD检测有助于癌症所有阶段的管理,包括筛查、指导辅助治疗、早期预测复发、启动全身治疗和监测反应及耐药基因分型。未来是个性化精准医疗的时代,今后的研究需要将来自基于ctDNA检测的MRD信息与来自实体肿瘤活检、临床检查和医学影像的信息有效整合,利用ctDNA MRD分析指导临床决策,改善患者预后。
尽管已有多项研究表明基于ctDNA的MRD检测对实体瘤的检测和监测具有高灵敏度和高特异度,在临床应用的初步数据成果显示是有希望的,在最近发表在JAMA Oncology的一篇临床研究中[44],研究者们通过检测循环肿瘤DNA甲基化从而早期检测ⅠⅢ期结直肠癌分子残留病灶和风险分层,最终证实,基于ctDNA的MRD检测是ⅠⅢ期结直肠癌术后复发的最重要的独立风险因素,可用以协助指导治疗决策,包括辅助治疗的“升级“和“降级”,实现精准治疗。该研究是国际上首个应用基于PCR的血液ctDNA多基因甲基化技术于结直肠癌复发预测和复发监测的多中心研究,有望提高结直肠癌复发预测和监测的临床使用普及率,并显著改善患者的生存期和生存质量。
然而,目前的研究规模大多是小型的,样本量少,缺乏临床有效性的证据[37-43,45]。未来仍需要通过更多大样本、多中心、前瞻性的临床试验验证MRD的临床效用,只有通过进一步的研究,才能确定早期干预ctDNA MRD阳性患者治疗是否可以改善临床结局,或者ctDNA MRD是否可以用于精确指导辅助治疗。
此外,还需要关注以下问题。(1) 由于与MRD相关的ctDNA浓度较低,临床工作中的检测技术必须持续检测血浆中突变等位基因分数<0.1%的突变,并排除如瘤种、疾病分期、其他来源DNA如正常细胞和白细胞来源的DNA干扰等因素带来的干扰[46-47]。目前的解决策略包括多突变检测和监测等,需要特异度和灵敏度极高的检测技术来实现,但随之检测成本要求也大幅提升,如何平衡成本与收益是今后研究的方向之一[18]。(2) 还需要进一步地研究来探索ctDNA检测的分析前变量,包括标本类型和数量、采样时间点、处理过程变量、存储条件和持续时间以及与患者相关的生物学因素[48]。基于ctDNA的MRD检测是全新的个性化技术应用领域,需要在应用于临床之前对ctDNA MRD检测进行更多的临床前研究,完善和丰富相关数据以供参考[49-50]。(3) 检测方法的可变性是一个值得关注的问题,不同ctDNA MRD的检测方法的准确性、灵敏度和特异度不同,突变等位基因分数的计算在不同方法中可能会增加或减少,因此,不同交叉检测的方法比较和标准化的需求越来越大。非小细胞肺癌国家综合癌症网络2021版指南[51]指出:“ctDNA分析及其检测性能的标准还未确立,与基于组织的检测相比,没有关于此类检测性能特征的指南”,使用标准化样本在不同平台上进行交叉验证研究有助于跨平台解读分析结果,因此ctDNA提取和检测标准亟待统一[3]。
5 展 望
在近年来的研究中,随着NGS技术的不断进步,基于ctDNA的MRD检测的灵敏度和特异度得到了极大提升,已广泛应用于乳腺癌、结直肠癌和肺癌等实体瘤的诊断和治疗中,成为了指导治疗和评估患者预后的重要手段。此外,除了临床应用,基于ctDNA的MRD研究也涉及到了许多基础科学领域,如癌症的发生机制、肿瘤细胞的特征和逃逸机制等。同时,MRD检测也成为了许多临床试验和新药研发的重要终点指标。总之,基于ctDNA的MRD检测可以帮助评估实体瘤患者的治疗效果、预测患者的预后和指导后续治疗方案,在实体瘤诊断和治疗中具有广泛应用前景,并且将为深入研究实体瘤的发生和发展提供重要的线索和理论基础,但仍需要进一步研究和发展以解决现有技术的局限性,推动其在临床实践中的广泛应用。
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