·综 述·

3D生物打印技术在骨及软骨再生修复中的研究进展

秦黎黎, 潘蕾宇, 崔柠薪, 卢天凤

(同济大学体育教学部运动与健康研究中心,上海 200092)

【摘要】 3D生物打印是一种将活细胞、生物材料、药物、生长因子和基因逐层进行空间排列的技术。该技术在骨及软骨修复领域的应用取得了显著的进展,可以解决传统手术方法存在的问题,如创伤大、周期长、难度高、并发症多、生物活性和生物相容性不足等,潜力巨大。本文概述了3D生物打印技术如何通过使用生物可降解材料和细胞制造出具有生物活性和生物相容性的骨和软骨组织,旨在为后续研究提供理论基础。

【关键词】 3D生物打印; 骨缺损; 软骨缺损; 再生; 组织修复

3D打印也被称为增材制造,是一种逐层制造的技术,并已在许多领域中得到应用。3D生物打印技术是一门跨学科的科学,与医学生物学、机械工程、材料科学密切相关[1]。广义地说,3D生物打印是指利用3D打印技术实现生物医学应用,如打印医疗辅助设备、聚合物、陶瓷或金属支架等;狭义上,这个概念被定义为细胞通过3D打印进行重组整合,因此它也可以被称为细胞打印或器官打印[2]。而3D生物打印是一种将活细胞、生物材料、药物、生长因子和基因逐层进行空间排列的技术,近年来得到了迅速发展,并被广泛应用于各种生物医学应用中制造活组织和器官构造。

骨缺损及软骨缺损是临床常见的骨科疾病,因其致病因素的不同而导致损伤部位、大小、严重程度各有差异,给临床工作带来了较大的挑战。由于手术创伤大、治疗周期长、难度高、花费大、损伤部位无法直接愈合及并发症多等特点,寻求更优的骨及软骨缺损治疗策略引起了广泛关注。近年来,3D 打印技术的兴起为治疗骨及软骨缺损提供了新思路。本研究通过归纳总结近年来3D生物打印在此领域的发展和应用,以期为临床治疗提供参考。

1 3D生物打印技术的发展

1984年,Charles Hull发明了用于打印3D物体的立体光刻印刷术,3D打印从此诞生。生物打印技术最早出现于1988年,Klebe公司使用标准的HP喷墨打印机通过细胞刻字技术来沉积细胞。1999年,Odde和Renn首次利用激光辅助生物技术打印来沉积活细胞,以开发具有复杂解剖结构的类似物。2002年,第一项基于挤压的生物打印技术被称为“3D-Bioplotter”。2003年,通过改进HP标准喷墨打印机开发了第一台喷墨生物打印机。一年后,使用立体光刻打印机实现了细胞负载生物打印[3]。2006年,应用电流体射流沉积活细胞的技术被开发出来[4]。Norotte等[5]于2009年通过生物打印技术设计了无支架血管组织。2012年,Skardal等[6]在小鼠模型上进行原位生物打印。接下来的几年,许多新的生物打印产品陆续出现,如2012年的关节软骨和人工肝,2014年的组织整合与循环系统等[7]。2016年,Pyo等[8]应用了基于数字光处理的快速连续光学3D打印技术制备出兼有出色力学性能和生物相容性的聚氨酯,AnthonyAtala的研究小组使用整合组织器官打印机制造了一个软骨模型。2019年,Noor等[9]成功制造了一种可灌注的缩小型心脏,Lee等[10]则基于自由形式可逆嵌入悬浮水凝胶技术实现了不同规模的胶原蛋白人类心脏生物打印。

2 3D生物打印方法

在制作支架时,3D生物打印分四步进行,如图1所示。首先,利用潜在的生物医学成像技术,包括计算机断层扫描、磁共振成像、超声成像和核医学成像,建立了缺陷组织的数字化三维支架模型。通过计算机辅助设计,在缺陷组织的三维模型中反映出支架的内外结构,如孔隙几何形状、孔径大小、孔隙率等。根据缺陷组织的类型、位置和要求,选择合适的生物材料、细胞类型和生物活性分子,制备用于打印的生物油墨。其次,与传统的3D打印类似,模型被导入生物打印机,一层一层地添加有或没有细胞的生物材料,也被称为生物墨水,生成组织工程支架。最后,通过体外培养形成具有生理功能的组织或器官,植入体内。最常用和相对成熟的3D生物打印方法主要包括喷墨打印、挤出式生物打印和激光辅助的生物打印,见表1。

表1 主要3D生物打印技术
Tab.1 Main 3D bioprinting techniques

打印方法生物墨水孔隙率细胞存活率细胞密度打印速度靶组织喷墨打印胶原蛋白、聚乙二醇、二甲基丙烯酸酯、纤维蛋白原、海藻酸盐、甲基丙烯酸酐化明胶50~50μm85%~98%5×106/mL1000~5000droplets/s皮肤、软骨、骨骼、肿瘤、肝脏挤出式打印明胶、聚己内酯、聚乙二醇、海藻酸盐、透明质酸、聚酰胺、聚二甲基硅氧烷、纳米纤维素>50μm80%~96%细胞球体5~20mm/s皮肤、软骨、血管、骨骼、肌肉、肿瘤、心脏激光辅助打印纤维蛋白原、胶原蛋白、甲基丙烯酸酐化明胶1~50μm97%108/mL100~1600mm/s皮肤、血管

图1 通过3D生物打印技术制造人工组织的流程图
Fig.1 Process diagram for manufacturing artificial tissue through 3D bio-printing technique

2.1 喷墨打印

喷墨生物打印是一种基于液滴的3D生物打印技术,在这种技术中,细胞负载的液滴被用作构建复杂的3D结构的基本构件。由于该技术可以精确控制沉积生物墨水的体积和位置,因此已广泛应用于组织工程中,用各种细胞墨水制造空间异细胞构建物。

在喷墨生物打印技术中,细胞生物墨水被挤压通过一个微型喷嘴,产生充满细胞的液滴。通过利用重力、表面张力和生物墨水的流体力学等多种因素,液滴从喷嘴喷射出来,并落在接收基板上。由于其独特的优点,如简单、灵活、高打印效率和按需沉积活细胞的良好可控性,喷墨生物打印已被广泛应用于制造充满细胞的活组织结构。尽管不同的喷墨生物打印技术能够以可复制的方式制造异细胞组织结构,但仍存在一些局限性,例如: 由于使用低黏度生物墨水以及生物材料选择的有限性,打印的组织或器官的机械性能较弱。

2.2 挤出式打印

挤出式生物打印是最常用的3D生物打印策略。典型的挤压式3D生物打印系统有许多组件,温度控制模块控制打印期间和打印后的生物油墨、周围环境的温度,运动控制模块根据所设计的轨迹沿xyz轴移动打印头和基板。生物墨水在不同的驱动机构下通过喷嘴挤出,形成连续的圆柱形细丝。这些细丝是构建复杂三维结构的基本单位。目前,有两种主要的挤压生物打印策略,即直接墨水书写(direct ink writing, DIW)和液体浴辅助打印,均被开发并广泛用于制造复杂的3D结构。DIW的核心是如何匹配印刷速度和交联速度,使挤出的长丝迅速从液态过渡到固态或类固态。因此,沉积层应具有机械刚度来保持其印刷后的形状,并为随后沉积的层提供支撑[11]。因其易于实现,可打印材料范围广泛,打印效率高,挤出生物打印成为主流的细胞打印方法,已被广泛用于制造复杂的3D细胞结构。未来挤出式生物打印的研究可能集中在三个方向: 基于挤压的生物打印技术的创新、新型可挤压生物墨水的开发、全尺寸器官或组织的3D生物打印。

2.3 激光辅助打印

激光辅助生物打印的基本机制是基于激光诱导正向转移,即利用激光脉冲直接将金属从金属涂层玻璃载玻片中喷射出来。激光辅助3D生物打印因其高分辨率、良好的细胞活力和高制造效率而成为一种有前途的细胞打印方法。这种方法有快速和有效地打印出具有优异机械性能的全尺寸人体器官/组织的潜力。然而,有限的材料选择是激光3D生物打印的主要挑战。因此,未来的研究可能集中于开发更多的光固化生物材料和生物相容性光引发剂。

3 骨及软骨修复的3D生物打印材料应用策略

3.1 打印材料的生物相容性

3D生物打印领域的一大挑战在于找到合适的生物墨水,它同时反映了可再生添加剂制造和生物需求之间的权衡,也被称为生物制造窗口[12]。要解决这一问题,就需要提高生物相容性材料的打印性能或提高具有优良打印性能的材料的生物相容性。由于其固有的生物相容性和高水分含量,大多数水凝胶能够在3D培养中支持细胞;然而,它们的前驱体溶液通常表现出较差的流变性能,低黏度和低剪切率,这妨碍了打印结构物的形状保真度的保留。这个问题可以通过添加黏度改性剂来解决,例如纳米纤维素或纳米黏土,这些改进剂可以增加前驱体溶液的黏度,并给它们一个良好的屈服点。

各种聚合物的打印性都可以满足生物打印,但其生物相容性较差,无法满足高细胞存活率的要求。例如,普兰尼克是一种具有反热胶化特性的热敏性聚合物,它在低温下的低黏度允许细胞和生物信号的均匀混合。在凝胶态下,它表现出剪切变稀行为,并可通过光交联材料进行改性,制备出机械稳定、坚硬的凝胶。尽管普兰尼克凝胶具有如上所述的优良的打印性能,但当细胞在5%普兰尼克存在的情况下体外培养时,其长期生存能力较低。有研究者提出了一种称为纳米结构的方法,用于在可打印浓度下增加普兰尼克凝胶的生物相容性[13]。通过将丙烯酸与未改性的聚氧乙烯聚氧丙烯醚混合,然后将未改性的普兰尼克从紫外线交联网络中洗脱,制备出纳米结构的水凝胶,在第14天将被包裹的软骨细胞的细胞活力从62%提高到86%。在这种情况下,细胞接触到的聚氧乙烯聚氧丙烯醚含量越低,纳米结构所允许的营养和氧气扩散能力就越强,这可能会提高细胞的生存能力。

3.2 打印材料的功能复合性

只使用一种材料往往不能再生复杂的骨软骨基质,但混合材料可能是一个解决方案,从而打印出令人满意的结构。3D生物打印中材料混合设计用于骨及软骨修复的主要目的包括增强机械性能、增强可打印性、改善生物相容性等。一个很好的例子证明了这种巧妙设计,即热响应和光交联的杂化支架。当3D生物打印关节软骨时,热响应聚合物是封装细胞和生物活性因子的完美候选,因为液体状态适合均匀混合物质,而凝胶状态有利于保持保真度。此外,相变与温度变化有关,而这一过程可以在体温(37 ℃)下进行,这表明它是细胞友好的。光交联材料的凝胶作用是通过紫外光处理引起的,其机械强度较强。因此,当这两种方法结合在一起时,就能够构建机械强度稳定的3D打印关节软骨。例如,热响应聚N-异丙基丙烯酰胺透明质酸与光可交联的甲基丙烯酸透明质酸混合,在沉积到加热的基板上后迅速形成凝胶;而甲基丙烯酸透明质酸具有良好的生物相容性,并改善了其机械性能[14]。使用这种方法,可以打印出具有良好生存能力的高机械强度支架。此外,可以通过改变温度来洗脱聚N-异丙基丙烯酰胺透明质酸,最大限度地减少人工聚合物的不利影响,并改善细胞间的相互作用。

Amini等[15]设计了一种水凝胶系统,该系统基于可光交联的甲基丙烯酸化硫酸软骨素和一种热敏性聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-单/双乳酸盐]-聚乙二醇三嵌段共聚物,作为一种合适的材料用于增材制造支架。它获得了与上述类似的性能,如良好的剪切稀释、细胞友好的环境和理想的力学特性。然而,在打印过程中,聚合物溶液在37 ℃加载到打印头,每个结构的第一层是通过将水凝胶分配到固定在40 ℃平衡的底板上的玻璃载玻片上产生的,这高于正常的体温。因此,这种凝胶温度可能对负载细胞产生有害影响,从而限制了其应用。然而,不同材料的组合在3D生物打印领域是一个相对较新的课题,材料混合方式和比例还需要进一步探索。

3D生物打印中材料混合设计用于骨及软骨修复的主要目的包括增强机械性能,例如聚丙烯酰胺/藻酸盐/热塑性弹性体[16]、聚己内酯/透明质酸[17]、聚己内酯/胶原蛋白/纤维蛋白/普兰尼克[18]、聚己内酯/甲基丙烯酸[19]、聚乙二醇二丙烯酸酯/藻酸盐[20]、聚乙二醇二丙烯酸酯/甲基丙烯酸[21]、聚乙二醇二丙烯酸酯/聚氨酯[22];增强可打印性,例如藻酸盐/纳米原纤化纤维素[23-24]、聚氨酯/聚氧化乙烯[25];区域设计,例如胶原蛋白/透明质酸[26]、明胶/羧甲基壳聚糖/甲基丙烯酸缩水甘油酯[27]、壳聚糖/丝素蛋白/羟基磷灰石[28]、聚乙二醇二丙烯酸酯/羟基磷灰石[29];改善生物学相容性,例如甲基丙烯酰化透明质酸/甲基丙烯酸/硫酸软骨素氨基甲基丙烯酸乙酯[30]、聚己内酯/藻酸盐[31];增强异体骨/软骨细胞的黏附性,例如壳聚糖/脱矿骨基质[32]、甲基丙烯酰化透明质酸/甲基丙烯酸[33]

4 3D生物打印在骨再生修复中的应用研究

虽然骨以其自我修复能力而闻名,但在大面积骨缺损的情况下,自愈所需时间可能被延长或者几乎无法自愈。骨组织工程已成为骨折修复的一种替代方法,以满足目前尚未满足的骨移植需求,并缓解自体骨移植和同种异体骨移植相关的问题,重点是在体内合成和再生骨以恢复、维持或改善其功能。根据Amini和Laurencin的一项综述[15],美国每年有超过50万人接受骨缺损修复,估计花费25亿美元。在美国,骨是仅次于血液的第二大移植组织。组织工程通常始于三维支架的开发,骨支架通常由多孔可生物降解材料制成,在修复过程中提供机械支撑。

不同类型的3D打印骨组织工程支架材料的区别如下: 磷酸钙生物活性陶瓷支架的材料有羟基磷灰石、双相磷酸钙、磷酸三钙、磷酸四钙,磷酸二钙和磷酸三钙、磷酸四钙/硫酸钙脱水、二水磷酸二钙、介孔生物活性玻璃改性磷酸三钙;聚合物支架的材料包括高密度聚乙烯、聚乳酸、聚富马酸丙二醇酯、淀粉/丙交酯PCL、聚乙烯或高密度聚乙烯;复合支架的材料包括5%羟丙基甲基纤维素改性a/b-磷酸三钙、羟基磷灰石/ε-聚己酸内酯、羟基磷灰石/麦芽糊精、聚己内酯/聚乙丙交酯/β-磷酸三钙。

4.1 磷酸钙生物活性陶瓷支架

磷酸钙陶瓷因其生物相容性、优良的生物活性、骨导电性、可用性和成本效益而被广泛应用于骨组织工程。纳米羟基磷灰石、磷酸三钙、磷酸钙等仿生磷酸钙纳米材料的引入处于3D打印研究的前沿。由于其优良的细胞相容性、骨传导性和生物活性,纳米羟基磷灰石已成为未来3D打印系统中考虑的骨纳米材料的目标,甚至被用作主要成分。除了纳米羟基磷灰石,磷酸三钙也被用于3D打印。采用一种新颖的三维烧结法,将细粉形态的纳米羟基磷灰石-磷酸三钙用于纳米支架的制备。烧结磷酸三钙支架具有较高的抗压强度和更优的微孔率和大孔率比,从而促进了体内新骨的形成。可控的生物降解性是骨支架的一个基本特征,因为它可以在再生过程中逐步为新组织的生长创造空间。在这方面,磷酸钙支架,特别是磷酸三钙支架能够调节生物吸收。磷酸钙支架降解产物还参与生物矿化,促进骨形成和生物活性。然而,与孔隙有关的弱脆性特性限制了它们仅在非承重骨修复中使用。此外,磷酸钙支架缺乏骨诱导活性,而骨诱导活性对骨愈合至关重要[18]。双相磷酸钙和b-磷酸三钙羟基磷灰石不同浓度稳定相的支架被推荐使用,因为其生物活性可控,吸收和增溶之间的平衡更好,在促进骨生长的同时可以保持生物材料的稳定性。3D打印的具有微观和宏观孔隙度的磷酸三钙样本也能促进大鼠股骨模型的成骨。为了进一步改善支架的力学性能,Khalyfa等采用了两种后处理工艺: 烧结和聚合物浸润磷酸四钙/b-磷酸三钙和磷酸四钙/硫酸钙脱水骨水泥,并在小鼠胚胎成骨细胞前体细胞模型上显示了细胞相容性。根据他们的报告,当用作黏结剂时,柠檬酸获得的最短硬化时间为20%40%,乳酸为30%40%。也有报道称,在磷酸氢钠和磷酸存在的情况下,降低黏结剂浓度可以延长水泥的硬化时间。3D打印介孔生物活性玻璃修饰的b-磷酸三钙支架具有分层的孔隙结构和功能支柱表面,与生物活性玻璃修饰的b-磷酸三钙支架和b-磷酸三钙支架相比,其抗压强度和磷灰石矿化能力更好,体内新骨形成增强。

4.2 聚合物基3D打印骨支架

Meesuk等[34]的一项研究表明,孔隙率为22.3%49.7%的3D打印聚乙烯支架具有高达4 Mpa的拉伸强度,且对人体成骨细胞无毒性。牛津性能材料公司也使用选择性激光烧结技术和一种专利的聚(醚-酮-酮)仿生聚合物来创造一种颜面缺损的骨替代品。该产品于2013年获FDA批准,是首批3D打印聚合物植入物之一,具有导骨性,机械强度强,表面有纹理,并且能够在不耗尽细胞代谢需求的情况下维持细胞增殖。同样,Wang等[35]制备了适合骨组织再造的聚(富马酸丙烯)多孔支架,其特征降解时间超过224 d。Kao等[36]制备的带有贝类表面涂层的3D打印聚乳酸支架在人类脂肪源性干细胞上也表现出了明显更好的细胞黏附、增殖和更高的碱性磷酸酶活性。

4.3 复合材料3D打印骨支架

尽管包括陶瓷、聚合物和水凝胶在内的各种材料在制造骨骼和组织支架方面显示出了很有前景的结果,但每种材料都有局限性,不能提供所有所需的材料属性,也不能单独使用时模拟骨骼生长的自然过程。三维复合支架形式的材料组合已被广泛应用以解决所述的局限性。复合材料是由物理或化学性质存在显著差异的两种或两种以上组分制成的材料,当组合时比单独组分具有更好的特性。生物可降解复合材料应具有适当的断裂强度和弹性模量值,以及控制强度和模量降解,为细胞附着和增殖提供必要的支持的力学性能。理想情况下,复合材料支架的抗压强度要求接近100230 MPa;弹性模量接近730 GPa;抗拉强度50151 MPa;孔隙率60%90%;平均孔径为150 mm。此外,生物可降解聚合物与生物活性陶瓷的巧妙结合,能够通过缓冲周围溶液的pH值,控制部分聚合物链水解产生的酸性端基的快速自催化降解效果。

聚合物与生物陶瓷或生物玻璃结合作为复合支架在骨组织工程中得到了广泛的应用。研究者通过3D打印制作了一种生物可降解聚合物陶瓷支架,并在纤维蛋白胶中使用人间质干细胞进行了体外测试。结果表明,细胞能够在仿生支架内黏附、迁移和成骨分化。3D打印三氧化物矿物集料/聚己内酯复合支架尺寸可控、高孔隙率(70%)、抗压强度4.5 MPa,对人牙髓细胞具有良好的黏附、增殖和分化作用,具有优良的物理化学性能,适用于骨组织工程。这些支架不仅具有优良的理化性质,而且具有促进成骨分化的作用,可用于骨组织工程。同样,Yao等[18]通过体外和体内试验证明,3D聚己内酯-羟基磷灰石支架改善了细胞黏附、增殖和软骨分化。3D打印的聚己内酯/聚乙丙交酯/b-磷酸三钙支架在人鼻下鼻甲组织来源间充质基质细胞上也显示出了增强的成骨潜能。3D打印生物牙本质/聚己内酯复合支架采用挤压技术制备,可控制大孔尺寸和结构,用于骨科和牙科应用,经人体牙髓细胞测试,证明其具有良好的磷灰石形成能力,并能促进细胞增殖和分化。3D打印支架由硫酸钙半水粉末在磷酸二氢铵溶液中通过水热反应转化为羟基磷灰石,并涂覆ε-聚己内酯聚合物溶液制成(5、10 g/mL)液体,抗压强度显著提高约2倍和4倍。分别与未涂层支架进行比较。在另一项研究中,PCL涂层的3D支架改善了骨肉瘤MG-63细胞的黏附和增殖,促进了成骨细胞的分化。由此可见,复合支架成为骨软骨修复或再生治疗的理想材料。

5 3D生物打印在软骨再生修复中的应用研究

关节软骨具有无血管和无神经的特点。这种特殊的结构使得关节软骨在维持关节稳定性和运动功能方面发挥着至关重要的作用。然而,一旦出现软骨缺损,由于其内在自我修复能力有限,软骨缺损的修复仍然是一个巨大的挑战[37]

目前,临床上常用的软骨缺损修复方法包括自体软骨移植、异体软骨移植、人工软骨植入等。这些方法虽然可以有效地恢复关节功能和稳定性,但也存在一定的风险和局限性。例如,自体软骨移植需要获取患者自身的软骨组织,手术创伤较大;异体软骨移植可能会引起免疫反应和排斥反应;人工软骨植入则需要使用大量的材料,增加了治疗成本和手术难度。因此,研究和发展更加有效的软骨缺损修复方法仍然是临床医学的重要课题。近年来,一些新型的生物材料和干细胞技术被应用于软骨缺损修复的研究中。这些新技术可以通过促进软骨细胞增殖和分化,以增强软骨组织的力学性能和耐久性,来提高软骨缺损的修复效果和长期稳定性。

为了使软骨组织再生,需要一个支架来培养软骨细胞或干细胞。因此,可以采用3D生物打印制造支架[38]。就成分和机械性能而言,研究具有快速交联能力的新颖、合适的生物墨水对于开发可行的软骨替代品至关重要。需要研究更多种类的3D打印材料,以及更好的打印分辨率(特别是在纳米级范围内)、速度和生物材料兼容性。

5.1 合成聚合物3D打印软骨支架

一些具有优异机械性能、生物相容性和可降解性合成聚合物在3D生物打印中发挥关键作用。这些聚合物通过化学合成制造,以精确定制各种特性,满足不同生物打印应用需求[39]

半月板是关键软骨组织,修复或替换具有类似结构和强度的半月板仍具挑战。Xu等[40]通过基于热辅助挤出的3D打印开发了自强化超分子聚N-丙烯酰基甘氨酰胺(poly N-acryloyl glycinamide, PNAGA)支架的人工半月板。将N-丙烯酰基甘氨酰胺(N-acryloyl glycinamide, NAGA)单体负载到PNAGA水凝胶中,直接3D打印潜伏氢键增强水凝胶。低强度PNAGA用于增稠浓缩的NAGA单体,为软PNAGA水凝胶提供适当的黏度,最终产生高强度和抗溶胀水凝胶。通过掺入柔软、热可逆和可印刷的PNAGA支架,制造了高强度和抗膨胀的半月板结构。这种自强化方法有效缓解了兔半月板切除术模型中的软骨表面磨损。

Zhang等[41]开发了一种基于高强度超分子聚合物水凝胶缓冲仿生结构半月板置换方法。他们使用聚ε-己内酯纤维来模仿天然半月板中的胶原纤维,从而提供必要的机械支撑和圆周拉伸阻力。随后,NAGA单体渗透到聚己内酯支架中形成互锁的PCL-PNAGA半月板替代品,增强了支架的力学性能,径向和圆周方向上的杨氏模量分别为(10.43±1.54) MPa和(20.15±1.37) MPa,压缩模量为(1.11±0.14) MPa,撕裂能量为(1.70±2.01) kJ/m2。体内试验表明,混合支架能有效抵抗压缩负荷,保护软骨免受磨损,改善骨关节炎的进展。

Chen等[17]的研究采用新颖方法设计了一种3D多孔静电纺丝聚乳酸基支架,并通过硫酸软骨素(chondroitin sulfate, CS)的交联进一步功能化,以促进软骨再生和调节炎症。CS是一种主要见于软骨、骨骼和皮肤的细胞-细胞外基质类型。该研究确认CS支架不仅具有适当的机械性能,还具有适当的生物相容性,表明CS支架在软骨再生方面具有较好的特性及其在免疫调节方面的潜力。

5.2 天然聚合物3D打印软骨支架

明胶是一种由动物骨骼、皮肤和软骨提取的胶原蛋白水解产物,主要成分包括胶原蛋白、蛋白多糖和部分氨基酸序列。经过甲基丙烯酸修饰后,明胶的活性和热稳定性得到提高,形成的衍生物甲基丙烯酰化明胶结合了天然细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的生物相容性和合成生物材料的稳定性、可重复性和模块化。在关节透明软骨的3D打印中,甲基丙烯酰化明胶被广泛应用于促进软骨细胞的黏附和重塑。此外,明胶作为软骨中ECM的主要成分还含有大量的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列,这些序列可以增强软骨细胞与基质之间的相互作用,从而促进软骨细胞增殖和分化。同时,明胶中还包含有基质金属蛋白酶水解序列,这些序列可以调控软骨细胞外基质的重塑过程[42]

Antich等[43]通过加入藻酸盐来设计一种新的基于透明质酸的生物墨水,来3D生物打印用于关节软骨再生的混合结构,其黏度水平有望保持在100 MPa以下,为软骨细胞的生长和维持以及支持施加在天然组织中的负载力所需的机械性能提供了最佳生态位。基于组织来源的脱细胞外基质的水凝胶已被用作基于细胞的3D生物打印的生物墨水,因为它们含有组织特异性ECM成分,在细胞黏附、生长和分化中起着至关重要的作用。Visscher等[44]对猪耳软骨组织进行分离和去细胞化,再通过甲基丙烯酸酯反应对软骨衍生的脱细胞ECM进行化学修饰,并与软骨细胞混合以创建可打印的生物墨水。打印出的水凝胶结构中的耳软骨细胞保持了活力和增殖能力,并最终产生软骨ECM成分,包括胶原蛋白和糖胺聚糖。

Shokri等[45]3D打印了弹性蛋白-明胶-透明质酸支架,这是一种由弹性蛋白、明胶和透明质酸组成的支架,可促进自体软骨细胞的渗透和增殖。明胶作为支架材料具有低成本和高细胞引诱性的特点,透明质酸钠则增强了细胞之间的化学信号,弹性蛋白具有生物活性、弹性和长期稳定性。弹性蛋白-明胶-透明质酸支架单独使用或与同源软骨细胞或自体软骨细胞结合使用,都可以增强鼻中隔软骨缺损的软骨再生。

5.3 复合材料3D打印软骨支架

在3D打印软骨支架中,天然大分子和合成生物材料的结合可以同时满足生物活性和机械性能的要求。这种结合方式可以提高软骨支架的生物相容性、生物活性和力学性能,从而更好地支持软骨细胞的生长和分化,促进软骨修复。例如,采用天然骨基质和合成生物材料的复合物可以提高软骨支架的力学性能和耐久性,同时保持良好的生物学活性。这种复合物可以通过3D打印技术制备出具有复杂结构的软骨支架,以适应不同部位的软骨修复需求。此外,还可以利用天然纤维素纳米纤维作为支架材料,促进细胞的黏附和生长,同时提供良好的力学支持;而采用聚合物材料作为表面修饰剂,可以增加材料的生物相容性和生物活性。

Chen等[46]采用脱细胞软骨ECM和水性聚氨酯(waterborne polyurethane, WPU)构建WPU和WPU-ECM支架,采用低温沉积制造系统水性3D打印出互连的微孔支架(WPU-ECM),协同促进透明软骨的再生。支架成功实现分层大微孔结构,添加ECM后,在孔隙率、亲水性和生物活性成分方面表现明显优化。此外,优化的WPU-ECM支架比WPU支架更适合细胞分布、黏附和增殖。最重要的是,WPU-ECM支架可以促进糖胺聚糖和胶原蛋白的产生以及软骨特异性基因的上调。这些结果表明,具有分层大微孔结构的WPU-ECM支架可以为细胞黏附、增殖、分化和ECM生产创造有利的微环境。体内研究表明,分层大微孔WPU-ECM支架结合微骨折程序成功地在兔模型中再生了透明软骨。

Martin等[47]3D打印了一种用于软骨缺损修复的支架,并在大型动物模型中做了验证。该研究选择静电纺丝透明质酸作为支架材料,是因为其天然存在于软骨细胞外基质中,常用于治疗性关节内注射,以及增强源自骨髓的间充质干细胞的软骨形成的能力;选择基质细胞衍生因子-1α和生长因子β3分别是因为其趋化性和成软骨特性。

Xia等[48]开发了一种纤维支架系统,该系统由生物活性成分(聚e-己内酯)材料中的脱细胞半月板细胞外基质组成,通过静电纺丝形成仿生形态,以支持和增强半月板细胞功能和基质生产。脱细胞半月板细胞外基质被掺入合成纳米纤维中增加了支架的亲水性,导致半月板细胞扩散,增殖和纤维化软骨生成基因表达增强。

6 展 望

3D生物打印是现代医学领域的一场技术革命。它是3D打印技术在生物医学领域的交叉应用,定义为以计算机三维模型为基础,以活细胞为原料,结合细胞外基质材料和活性因子,在无菌条件下打印活组织和器官的技术,它可以解决传统组织工程难以解决的问题。3D打印在医疗行业的应用不仅仅是医疗设备或假肢。随着组织工程技术的不断发展,具有仿生结构的活体组织植入物已成为再生医学的一部分,如骨骼、软骨、皮肤、角膜、血管、心脏组织、牙科和整形外科。由于其精度高、施工速度快、结构和孔隙可控性好、机械稳定性好以及复合多种材料的能力,引起了研究人员的广泛关注。

随着3D打印技术越来越广泛地应用于康复治疗和临床医学[49],将进一步评估其远期治疗效果,相应的法律法规、治疗规范等文件也应当尽快出台。关于3D打印骨修复植入物的材料方面,也尚无统一标准,寻找一种高质量、高性能、低价格的植入物材料,将成为3D打印技术应用于骨及软骨缺损的重要研究方向。总之,虽然3D打印技术在骨软骨缺损修复领域的应用仍存在一些因素的限制,但随着临床医师熟练度的增加以及各种高性能低价格新材料的发明,3D打印技术在骨及软骨缺损修复领域的应用将有更为广阔的前景。

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Research Progress of 3D bio-printing technique in osteochondral regeneration and repair

QIN Lili, PAN Leiyu, CUI Ningxin, LU Tianfeng

(Sports And Health Research Center, Faculty of Physical education, Tongji University, Shanghai 200092, China)

【Abstract】 The 3D bio-printing is a technique that spatially arranges living cells, biomaterials, drugs, growth factors and genes by layer. The application of 3D bio-printing has made remarkable progress in the field of bone and cartilage repair. Compared to traditional surgical treatment, it has great advantages of less tissue trauma, shorter time consuming and fewer complications, as well as higher bioactivity and higher biocompatibility. This article gives an account of how 3D bioprinting technique produces bioactive and biocompatible bone and cartilage tissue by using biodegradable materials and cells, to provide reference for its clinical application.

【Key words】 three-dimensional bioprinting; bone defect; cartilage defect; regeneration; tissue repair

DOI:10.12289/j.issn.2097-4345.23121

收稿日期:2023-04-16

基金项目:国家自然科学基金(31771313)

作者简介:秦黎黎(1983—),女,教授,博士,E-mail: qinlili@tongji.edu.cn

通信作者:卢天凤, E-mail: sytyltf@126.com

【中图分类号】 R684

【文献标志码】 A

【文章编号】 2097-4345(2024)02-0281-09