随着国家经济的发展，人民生活水平得到提高，不健康的生活方式和日益加剧的人口老龄化问题，使得心脑血管疾病的危险因素不断发生暴露，心脑血管疾病在我国人群中的发病率和死亡率逐年升高并敖占首位，造成极大的家庭、社会负担[1]。其实，相当一部分的心脑血管事件在发病前都是有多种先兆症状的。长期以来，国内外多采用传统危险因素，如高血压，糖尿病，高血脂等来评估心脑血管疾病的发病风险，使一部分高危人群通过积极临床干预，从而避免了不良事件的发生，取得了一部分成效[2]。但临床上常发现，部分无传统危险因素的个体也发生心脑血管不良事件，这表明仅利用传统危险因素来预测心脑血管事件风险的敏感性及特异性严重不够[3]。研究表明，脂蛋白相关磷脂酶A2(lipoprotein-asso-ciated phospholipase A2, Lp-PLA2)与髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)是高度敏感及特异的血管炎症介质指标，已成为心脑血管事件风险预测的两个重要指标，而备受关注[4]。
目前国内众多体检中心及部分医院已逐步开展这两个指标的检测及预警。然而，迄今国内采用的这两个指标的参考值都是参考美国推荐的数据。所以，建立国人的LP-PLA2和MPO的参考区间是迫在眉睫的研究任务。本研究通过对中国健康成人血浆Lp-PLA2及MPO的检测，来建立二者的参考区间。
1 资料与方法
1.1 研究对象
选择深圳市坪山区社区参与惠民计划的各年龄段的居民，接受Lp-PLA2、MPO水平检测，随后在萨米医疗中心及深圳市坪山区中心医院完成健康体检。纳入标准：(1)血压正常；(2)血糖正常：糖化血红蛋白、空腹血糖正常；(3)血脂正常；(4)白细胞、超敏CRP、肝肾功能、甲状腺功能、尿常规、心电图、胸片正常；排除标准：(1)急慢性感染；(2)近期手术、哺乳、妊娠；(3)既往有冠心病、脑卒中、TIA、心肌病、哮喘、慢性支气管炎，器官功能不全、恶性肿瘤、血液病，风湿免疫性疾病、外周血管疾病患者；(4)过量吸烟饮酒。最终纳入本研究5 367例(男2 534例，女2 833例)，年龄20～80岁。将男女两组分别按不同年龄分为6组：20～29、30～39、40～49、50～59、60～69、≥70岁组。所有入选者均签署知情同意书，本研究经上海交通大学医学院附属新华医院医学伦理委员会通过伦理审查(编号：XHCE-D-2021-029)。
1.2 试剂与仪器
Bio Tek酶标仪(uQuant)购自美国伯腾仪器有限公司，试剂盒采用海格德生物科技(深圳)有限公司的人Lp-PLA2酶联免疫法检测试剂盒和人MPO酶联免疫检测试剂盒。
1.3 方法
1.3.1 样本的采集和保存 受检者空腹状态下抽取静脉血2～5 mL，用肝素抗凝管收集，混匀，室温静置1～2 h，以3 000 r/min,离心10 min，收集分离出的血浆。分离出来的血浆样储存于-20 ℃进行冻存，2周内集中检测。
1.3.2 检测方法 采用酶联免疫法检测Lp-PLA2和MPO质量浓度，使用前将试剂盒和待检样品在20～25 ℃室温环境下平衡30 min以上，避免直接使用加热方式。将校准品或待检样品加入微板孔，进一步加入经辣根过氧化物酶标记的抗体进行温育，形成“包被抗体-抗原-酶标抗体”复合物，辣根过氧化物酶催化显色剂反应，生成蓝色产物，终止反应后变为黄色。通过酶标仪检测450 nm吸光度(A450)，以校准品浓度值为横坐标、校准品OD值为纵坐标绘制标准曲线，计算样品中含量。
1.4 参考区间的建立
依据美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute, CLSI)C28-A2标准剔除离群值，若某检测值的D值≥1/3R值，须将该值剔除。D=最大值-第二大值或第二小值-最小值)，R=最大值-最小值。有2到3个离群值在分布同一侧，将最极端离散值当作唯一离散值对待。分析是否需要按不同性别、年龄来建立各自参考区间。计算Z值和Z的危急值，若Z>Z危急值，或者较大的标准差超出1.5倍的较小的标准差，须计算出每组的参考区间。参考区间按照95%分布范围确定。
1.5 统计学处理
采用SPSS 24.0软件进行统计学分析。K-S检验进行正态性验证。正态分布的计量资料以
描述，组间比较采用t检验；偏态分布计量资料采用M(Q1-Q3)描述，两组间比较采用曼-惠特尼U检验，多组间比较采用克鲁斯卡尔-沃利斯H检验。绘制折线图。统计分析采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 ELISA检测Lp-PLA2、MPO试剂盒性能评价
试剂盒校准品均一性：瓶间重复性CV值≤10%。准确度：检测浓度与理论浓度偏差在±10%内。精密度：批内变异系数≤10%，批间变异系数≤15%
2.2 LP-PLA2和MPO正态性检验
健康者总体、男性、女性Lp-PLA2水平K-S检验(Z值分别为48.198、32.602、30.708，均P<0.001)；健康者总体、男性、女性MPO水平K-S检验：(Z值分别为58.040、32.602、41.832，均P<0.001)。均属于偏态分布。
2.3 LP-PLA2和MPO水平分布特征
2.3.1 男女两组Lp-PLA2和MPO水平的比较 男性组Lp-PLA2水平明显高于女性组，差异有统计学意义(U=7.648，P<0.001)，男女两组MPO水平比较，差异无统计学意义(U=0.444，P=0.657)，见表1。
表1 男女两组Lp-PLA2和MPO质量浓度的比较
Tab.1 Comparison of Lp-PLA2 and MPO quality concentrations between male and female groups
性别n(%)年龄/岁Lp-PLA2/(ng·mL-1)MPO/(ng·mL-1)男性2534(47.2%)52(45～62)119.01(97.64～144.63)26.32(13.79～44.73)女性2833(52.8%)53(45～63)112.63(90.84～135.46)∗26.11(13.82～48.02)
与男性组比较*P<0.05
2.3.2 不同年龄人群Lp-PLA2和MPO质量水平的比较 随着年龄增加，男女两组Lp-PLA2水平均有升高的趋势(图1)。女性各年龄段组Lp-PLA2水平差异有统计学意义(H=24.654，P<0.001)；但男性各年龄组Lp-PLA2水平差异无统计学意义(H=6.747，P=0.240)。进一步分析表明：女性60～69岁及≥70岁组Lp-PLA2水平高于60岁以下各年龄组，差异有统计学意义(P均<0.05)；女性≥70岁组Lp-PLA2水平高于60～69岁组，但差异无统计学意义(P>0.05)；因此将女性60岁以下各组合并成<60岁组，将60～69组和≥70岁组合并成≥60岁组，结果显示：女性≥60岁组Lp-PLA2水平高于<60岁组，差异有统计学意义(U=4.570，P<0.001)；MPO水平在男性和女性各年龄亚组之间比较，差异均无统计学意义(男性：H=2.188，P=0.823；女性：H=4.641，P=0.461)，见表2。
图1 Lp-PLA2水平变化趋势折线图
Fig.1 Broken line diagram of change trend of Lp-PLA2 concentration
与60～69岁组女性比较，*P<0.05；与≥70岁组女性比较，#P<0.05
表2 不同年龄人群Lp-PLA2和MPO质量浓度的比较
Tab.2 Comparison of Lp-PLA2 qualityconcentrations in different age groups
性别分组nLP-PLA2/(ng·mL-1)MPO/(ng·mL-1)男性 20～29岁124116.35(92.24～134.59)27.05(19.63～45.31)30～39岁201117.00(92.11～146.38)27.54(14.66～55.49)40～49岁686120.29(99.12～142.73)25.40(13.38～42.29)50～59岁763118.09(98.10～143.75)26.49(13.60～44.70)60～69岁535120.13(97.73～149.64)26.30(13.09～47.55)≥70岁244124.52(97.43～154.32)26.86(15.16～38.02)
续表
性别分组nLP-PLA2/(ng·mL-1)MPO/(ng·mL-1)女性 20～29岁120106.12(88.69～115.52)∗△26.29(13.30～47.47)30～39岁279110.83(89.93～130.88)∗△25.94(15.01～57.26)40～49岁696110.32(90.31～134.67)∗△25.10(13.00～47.28)50～59岁786112.04(89.17～132.35)∗△27.26(14.29～47.36)60～69岁549116.67(94.85～139.82)26.17(12.94～49.69)≥70岁384119.08(88.32～148.29)24.90(14.28～48.31)合并女性组<60岁1900110.49(90.17～131.65)#≥60岁933117.49(93.39143.13)
与60～69岁组女性相比，*P<0.05；与≥70岁组女性相比，△P<0.05；与≥60岁女性组相比，#P<0.05
2.4 中国健康成人血浆Lp-PLA2与MPO质量水平参考区间的建立
MPO在男女两组及各年龄亚组之间差异无统计学意义，不需要单独设立参考区间。计算男女两组及女性<60岁与≥60岁组Lp-PLA2的Z值及Z危急值，结果显示Z<Z危急值且较大标准差<1.5倍的较小标准差，见表3，故不需要单独设立参考区间。因5 367名健康成人Lp-PLA2与MPO水平呈非正态分布，对于Lp-PLA2及MPO只有高值才是临床关注的，故采取单侧95%置信区间即为(0～P95)，去除离散值后，得出健康者Lp-PLA2及MPO参考区间分别为≤190.70 ng/mL、≤98.68 ng/mL。
表3 Lp-PLA2独立亚组参考区间分析
Tab.3 Analysis of reference interval of independent subgroup of Lp-PLA2
组间比较ZZ危急值两组中较小的标准差两组中较大的标准差男性vs女性组7.0714.1941.4245.07女性<60岁vs≥60岁组3.8310.3039.7544.32
3 讨 论
Lp-PLA2属于磷脂酶A2超家族成员，由巨噬细胞、T淋巴细胞及肥大细胞分泌[5]。在人体内，约80%的Lp-PLA2与低密度脂蛋白结合，20%与高密度脂蛋白及超低密度脂蛋白结合。Lp-PLA2可水解氧化型低密度脂蛋白，产生溶血卵磷脂和氧化游离脂肪酸，进一步促进冠状动脉粥样斑块形成，并与斑块不稳定密切相关[6]。另一方面，MPO是血红素过氧化物酶超家族成员，主要存在于中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞中。这些活化的白细胞在动脉粥样硬化局灶部位释放MPO[7]。MPO通过将低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)转化为致动脉硬化的氧化型低密度脂蛋白形式，也能氧化修饰高密度脂蛋白使其丧失抗动脉粥样硬化作用，从而通过损伤局部细胞外间质及血管内皮细胞等途径参与动脉粥样斑块发生及发展，并影响斑块的稳定性[8]。目前多项研究已证实Lp-PLA2与MPO水平升高与动脉粥样硬化灶内的炎症的严重程度密切相关[9-10]。因此，高危人群血浆中这两个指标的异常增加，预示着心脑血管疾病的发病风险增加。而且，在不良事件发病后，两个指标的增高水平与心脑血管事件的严重程度密切相关[11-14]。
Lp-PLA2和MPO在国内无明确的参考区间，多数借鉴美国的数据。美国推荐的用ELISA法测定的Lp-PLA2≤200 ng/mL及MPO≤75 ng/mL作为正常参考区间[15]，且两者联合使用对心脑血管疾病危险分层的准确性远超过单独使用一种[16]。但已有研究表明Lp-PLA2和MPO水平与种族密切相关。Lee等[17]发现，美国白人Lp-PLA2水平最高，其次是西班牙人，美国黑人和亚洲人的Lp-PLA2水平最低(P<0.05)。另一个研究[18]发现美国黑人的MPO水平高于美国白人(P<0.05)。因种族的差异，所以国人直接使用美国推荐的参考区间来评估风险会产生偏差。目前国内关于健康成人Lp-PLA2和MPO参考区间的研究规模均较小，本研究对5 367名健康成人血浆Lp-PLA2及MPO进行检测，建立了中国成人Lp-PLA2和MPO质量浓度参考区间(分别为≤190.70 ng/mL、≤98.68 ng/mL)。对比发现，本研究建立的中国人Lp-PLA2参考值低于美国国内推荐的正常标准，这与Lee等[17]的研究结果相似。目前，尚无亚洲人与美国人群中的多种族间的MPO水平差异的研究。另一方面，本研究建立的MPO参考值高于美国国内推荐的标准，这种差异是否与种族有关，仍需后期研究来进一步证实。
本研究还发现Lp-PLA2水平与性别和年龄相关。男性Lp-PLA2水平显著高于女性，且男女两组Lp-PLA2水平随着年龄增加均有升高趋势：男性人群中的这种升高趋势不明显，各年龄段Lp-PLA2水平差异无统计学意义；而女性人群表现明显，女性≥60岁人群Lp-PLA2水平明显高于<60岁人群。由此可见Lp-PLA2水平与性别和年龄相关。分析原因可能与女性雌激素介导了Lp-PLA2水平下调有关[19]，绝经后女性体内雌激素水平明显下降，导致Lp-PLA2水平上调。与Lp-PLA2分布特征截然不同的是，本研究未发现MPO与性别和年龄之间存在相关性，这一结果也与达拉斯心脏病研究中心的报道一致[18]。
本研究对中国人群Lp-PLA2和MPO参考区间进行了较大规模的研究，为心脑血管疾病的管控奠定了基础。对临床筛选的易感人群、高危患者需定期检测Lp-PLA2、MPO水平，高于正常值的人群，应积极治疗原发病，健康生活，定期复查指标；明显增高的人群应密切随访这二项指标，并积极就医，家人陪同，及早干预，从而有效的避免心梗脑梗的发生。
本研究也存在一定的局限性，首先本研究为单中心研究，研究对象为中国南方沿海发达城市生活的人群。下一步将继续扩大研究范围，进行多中心、多地区、多民族的研究，以保证研究结果的普便适用性。其次，本研究未对入选者进行相关血管检查，部分入组人群可能存在稳定性动脉粥样硬化性疾病。但已有研究表明稳定性动脉粥样硬化患者中这两个指标无明显增高[20-21]。所以，本课题组认为这种影响即使存在，也是非常有限的。同时，也将进行长期的前瞻性心脑血管不良事件的预测研究，从而更加准确的获得中国人群Lp-PLA2和MPO水平的最佳风险截断值。
致谢 本试验在检测技术方面得到了海格德生物科技(深圳)有限公司仇家舟、陈雪、韩京平的协助，在此表示感谢。
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