子宫内膜异位症(endometriosis, EMT)是指子宫内膜腺体和间质细胞出现在子宫腔以外的其他部位，发病率高达10%～15%，并有逐渐增加的趋势。盆腹腔粘连是EMT最重要的特征之一，也是其慢性盆腔疼痛、不孕等的常见病因。明确EMT盆腹腔粘连的分子调控机制可为减轻患者盆腹腔疼痛、提高患者受孕概率、降低术后复发等提供新的治疗靶点。
TGF-β1是公认的参与纤维化形成的主要细胞因子,Relaxin除了是妊娠和分娩激素外，还在多个非生殖系统器官中通过促进胶原降解而抑制甚至逆转器官的纤维化。本研究通过检测EMT组及非EMT组、EMT不同粘连程度组以及治疗前后EMT及非EMT组中Relaxin及TGF-β1的水平，并分析两者水平与EMT盆腔粘连相关性，探讨两者在EMT盆腔粘连中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2017年9月—2019年9月于同济大学第一妇婴保健院妇科住院行卵巢囊肿剥除术，术后经病理确诊为卵巢内膜异位囊肿185例(EMT组),根据术中盆腔粘连程度分为EMT-A组(无或仅有轻度盆腔粘连，子宫内膜异位症r-AFS Ⅰ～Ⅱ期88例)和EMT-B组(中重度盆腔粘连,子宫内膜异位症r-AFS Ⅲ～Ⅳ期，97例)。选取同期于该院手术，术后经病理确诊为非EMT(非EMT组)患者135例。本研究已通过同济大学附属第一妇婴保健院医学伦理委员会批准，伦理审查号为KS20278。
1.2 诊断标准
中华医学会妇产学分会子宫内膜异位协作组2007年制定《子宫内异位诊断与治疗》作为本次中EMT组患者诊断标准[1]。
1.3 纳入和排除标准
1.3.1 纳入标准 (1) 愿意参与此次研究，已书面签署知情同意书;(2) EMT组均符合EMT盆腔粘连诊断标准;(3) 未并发严重心、肺、肝、肾等功能障碍;(4) 患者经检查均无妇科内分泌疾病及其他系统并发症;(5) 患者在行手术治疗前半年内未使用过类固醇激素;(6) 患者术前影像学子宫及双侧输卵管未见异常，术中其外观亦未见异常。
1.3.2 排除标准 (1) 拒绝参与此次研究;(2) EMT组 不符合子宫内异位症盆腔粘连诊断标准;(3) 伴有自身免疫性疾病、恶性肿瘤、肾病、肝功能异常、甲状腺功能异常等;(4) 伴有妇科内分泌疾病及其他系统并发症;(5) 患者在行手术治疗前半年内未使用过类固醇激素;(6) 既往盆腔手术史;(7) 术 前超声或病理提示合并子宫腺肌病或子宫肌瘤等子宫疾病。
1.4 研究方法
1.4.1 盆腔粘连评分 术中全面探查盆腔情况，专人记录盆腔粘连的部位、范围、粘连的紧密程度、子宫直肠窝的封闭程度、卵巢有无粘连、输卵管有无粘连并进行量化评分。评分标准参照文献[2]。(1) 盆腔粘连范围: 粘连面积<25%为1分；粘连面积26%～50%为2分;粘连面积>50%为3分。(2) 盆腔粘连程度: 疏松粘连和/或无血管性粘连为1分;致密粘连和微血管性粘连为2分;非常致密，无组织界面的粘连为3分。(3) 子宫直肠凹陷封闭程度: 无封闭0分，部分封闭1分，完全封闭2分。(4) 卵巢粘连: 无粘连0分，单侧粘连1分，双侧粘连2分。(5) 输卵管粘连: 无粘连0分，单侧粘连1分，双侧粘连2分。(6) 输卵管闭锁: 无闭锁0分，单侧闭锁1分，双侧闭锁2分。将上述各项指标得分相加,总分0～1分为无粘连,2～5分为轻度粘连,6～9分为中度粘连，总分>9分为重度粘连。
1.4.2 ELISA及PCR 腹腔镜手术开始时抽取未被血液污染的腹腔液5 mL(若有血液污染则剔除入组)，1 700×g，离心5 min，留取上层腹腔液，-70 ℃保存待测。另抽取研究对象术后1个月空腹外周血6 mL，1 248×g,离心8 min，取上层血清，-70 ℃冰箱保存待检。采用ELISA及PCR分别测定腹腔液及血清Relaxin、TGF-β1及其相对mRNA水平。TGF-β1及Relaxin试剂盒均购自深圳晶美生物工程公司，板内、板间变异系数均<10.5%。采用TRIzol试剂(Gibco公司)严格按照说明书提取血清总RNA，定量PCR仪(Applied Biosystems公司，7700型)进行检测。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成。取1 μg总RNA，在25 μL体系中进行逆转录。PCR反应体系为50 μL，扩增条件为95 ℃ 5 min 预变性后，按95 ℃ 30 s、62 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，共40个循环，然后72 ℃延伸10 min。以GAPDH mRNA为内参。电泳条带图像经计算机成像及灰度扫描系统分析，以同一样本Relaxin、TGF-β1 mRNA表达量与内参表达量的比值进行半定量分析。Relaxin引物序列(5′-3′): CCACTGCA-GAAGTTGTGCCATC(正向)、ACAACGGAATC-GCTCAACGC(反向)；TGF-β1引物序列(5′-3′): AAATGACAGCAGCAGGGACAC(正向)、GAGG-TAGGACCCACAGTAGAGC(反向)；GAPDH引物序列(5′-3′): CCTGCACCACCAACTGCTTAG(正向)、CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGA(反向)。
1.4.3 子宫内膜组织基质细胞增殖试验 将EMT组患者在位内膜组织培养于含15%小牛血清和100 U/mL 青霉素,100 U/mL链霉素的DMEM/F12培养液，漂洗2次，剪成小于1 mm以下的碎块，加入胰酶消化后用筛孔为250 m的筛网过滤后，培养箱内培养，将细胞种人培养瓶及6孔培养板培养，培养细胞覆盖30%以上加入TGF-β1(0.1、1、5、10 ng/mL)。同法加入Relaxin(10、20、50、100 ng/mL)。采用抗波形蛋白抗体鉴定基质细胞纯度，MTT法测定细胞增殖生长率。
1.5 统计学方法
实验数据用SPSS 25.0软件包分析,计量资料的正态性检验采用K-S检验，正态分布数据以
表示，差异性比较采用t检验。偏态性分布数据以M(P25，P75)表示，差异性比较采用Mann-Whitney U检验。两变量的相关性分析采用Spearman相关。诊断的准确性判断采用受试者工作曲线(ROC)。与r-AFS分期的关系采用二分类Logistics回归分析检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 185例EMT患者和135例非EMT患者基本资料
EMT组和非EMT组患者年龄、BMI、孕次、流产次、合并症(糖尿病，自身免疫性疾病)、月经量及子宫体积差异均无统计学意义(P均>0.05)。EMT-A组和EMT-B组，EMT组及非EMT组这4组患者年龄、BMI、孕次、流产次、合并症(糖尿病，自身免疫性等疾病)、月经量及子宫体积差异均无统计学意义(P均>0.05)。EMT组痛经程度明显高于非EMT组(P<0.001)。EMT-A组痛经程度显著低于EMT-B组(P=0.005)。见表1。
表1 患者一般情况
Tab.1 General information of patients
指标非EMT组(n=135)EMT组(n=185)PEMT-A组(n=88)EMT-B组(n=97)P年龄/岁43.45±5.8642.78±5.750.14343.14±5.7843.35±5.650.265BMI/(kg·m-2)23.35±2.8723.56±2.260.83223.41±2.9123.61±2.130.741孕次1(0,7)2(0,8)0.1121(0,8)1(0,8)0.117流产次1(0,8)1(0,8)0.1231(0,8)2(0,8)0.102合并症8(12.1%)19(11.5%)0.8734(10.8%)15(11.7%)0.915子宫体积234.5±190.2245.1±156.30.345226.1±175.2244±145.20.467痛经程度<0.0010.005 无和轻88(65.19%)59(31.89%)25(28.41%)13(13.40%) 中37(27.41%)85(45.96%)30(34.09%)26(26.81%) 重10(7.40%)41(22.15%)33(37.50%)58(59.79%)月经量>0.999>0.999 正常71(52.59%)98(52.97%)46(52.27%)50(51.55%) 过多64(47.41%)87(47.03%)42(47.72%)47(49.45%)
年龄、BMI及子宫体积的数据均为正态分布，数值以
表示；孕次、流产次数据均为偏态分布，数值以M(P25，P75)表示；合并症、痛经程度、月经量均为计数资料，数值以n(%)表示
2.2 腹腔积液中Relaxin及TGF-β1不同组别中的表达水平
ELISA测定结果显示，EMT组腹腔积液中TGF-β1水平高于非EMT组[(75.42±1.774)vs(61.63±1.802) μg/L,P<0.01]，而Relaxin水平低于非EMT组[(14.55±1.191)vs(24.30±1.081) μg/L P<0.01]。EMT组中随着盆腔粘连程度的加重，TGF-β1水平明显升高，而Relaxin水平明显降低(均P<0.01)；随着子宫直肠陷凹粘连严重程度增加，EMT组腹腔积液中TGF-β1水平明显增加，而Relaxin水平明显降低(均P<0.01)；EMT组腹腔积液中增生期及分泌期TGF-β1及Relaxin水平差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。
表2 EMT组患者腹腔积液中Relaxin及TGF-β1表达水平比较
Tab.2 Comparison of expression levels of Relaxin and TGF-β1 in EMT group of peritoneum fluid
特征nTGF-β1/(μg·L-1)PRelaxin/(μg·L-1)P粘连程度<0.0001<0.0001 A组8864.10±2.40425.90±1.683 B组9775.80±2.16714.00±1.298子宫直肠陷凹<0.0001a<0.0001b 无5257.75±1.61829.00±1.947 部分封闭8470.40±2.70320.05±2.395 完全封闭4977.60±1.31415.40±1.231月经周期0.07140.4967 增生期12566.95±1.35617.90±1.294 分泌期6067.75±1.37217.60±1.485
腹腔积液中Relaxin水平在后陷凹(子宫直肠陷凹)无封闭组，部分封闭组及完全封闭组比较，差异有统计学意义(F=520.1，P<0.000 1)，三组间两两比较，差异均有统计学意义(P均<0.000 1)，子宫直肠陷凹完全封闭组中腹腔中Relaxin水平最高；腹腔积液中TGF-β1水平在子宫直肠陷凹无封闭组，部分封闭组及完全封闭组比较，差异有统计学意义(F=259.7，P<0.000 1)，三组间两两比较，差异均有统计学意义(均P<0.000 1)，子宫直肠陷凹完全封闭组中腹腔中TGF-β1水平最低
2.3 Relaxin及TGF-β1在盆腔粘连中诊断的准确性及相关性分析
2.3.1 Relaxin水平与EMT盆腔粘连相关性 EMT患者腹腔积液中Relaxin水平与盆腔粘连评分呈负相关(r=-0.656，P<0.01)；随着Relaxin的降低，EMT盆腔粘连评分呈上升趋势，见图1(腹腔积液中Relaxin水平采用ELISA测定)。
图1 Relaxin与盆腔粘连相关性
Fig.1 The correlation of Relaxin and Pelvic adhesion
2.3.2 TGF-β1与EMT盆腔粘连的相关性 EMT患者腹腔积液中TGF-β1水平与盆腔粘连评分呈正相关(r=0.695，P<0.01)；且随着TGF-β1的升高，EMT盆腔粘连评分呈上升趋势，见图2(腹腔积液中TGF-β1水平采用ELISA测定)。
图2 TGF-β1与盆腔粘连相关性
Fig.2 The correlation of TGF-β1 and Pelvic adhesion
2.3.3 TGF-β1与Relaxin水平在EMT盆腔粘连诊断的准确性 腹腔积液中Relaxin水平鉴别EMT-A及EMT-B组的ROC曲线下面积为0.786 5(95%CI: 0.713 4～0.859 6),诊断界值为19.0 μg/L；腹腔积液中TGF-β1水平鉴别EMT-A及EMT-B组的ROC曲线下面积为0.777 9(95%CI: 0.697 3～0.858 5),其诊断EMT盆腔粘连界值为71.5 μg/L；TGF-B1与Relaxin联合鉴别EMT-A及EMT-B组的ROC曲线下面积为0.850 5(95%CI: 0.783 3～0.917 6)，见图3(腹腔积液中Relaxin及TGF-β1水平采用ELISA测定)。
图3 鉴别EMT-A组及EMT-B组的ROC曲线
Fig.3 The ROC courve of distinguish experimental group EMT-A and EMT-B
2.3.4 Relaxin与TGF-β1的相关性 ELISA检测结果显示，EMT组子宫内膜异位症患者腹腔积液中的Relaxin及TGF-β1水平，结果显示Relaxin与TGF-β1呈负相关(r=-0.677 8，P<0.000 1)，见图4。
图4 TGF-β1与Relaxin的相关性
Fig.4 The correlation of TGF-β1 and Relaxin
2.4 外周血Relaxin与TGF-β1 mRNA相对表达水平
因卵巢EMT术后较高复发率，部分患者术后根据年龄、生育要求等不同情况采取了不同药物的巩固治疗，为避免药物对血清Relaxin及TGF-β1 mRNA表达的可能影响，此次外周血检测剔除了这些患者入组。EMT组治疗前外周血TGF-β1 mRNA相对表达显著高于治疗后1个月(t=15.44，P<0.000 1)；治疗后1个月，EMT组外周血TGF-β1mRNA相对表达与非EMT组差异无统计学意义(t=1.003,P=0.332)。EMT组治疗前外周血Relaxin mRNA相对表达显著低于治疗后1个月(t=33.39，P<0.000 1)；治疗后1个月，EMT组外周血Relaxin mRNA相对表达较非EMT组差异无统计学意义(t=1.282，P=0.208)。非EMT组中外周血TGF-β1及Relaxin mRNA相对表达治疗前后差异均无统计学意义(P分别为0.679、0.187)，见表3。
表3 外周血Relaxin及TGF-β1 mRNA不同组别相对表达水平比较
Tab.3 Comparison of relative expression levels of Relaxin and TGF-β1 mRNA in different groups of peripheral blood
组别nTGF-β1 mRNARelaxin mRNA治疗前治疗后治疗前治疗后EMT组1381.729±0.3150.626±0.257ab0.561±0.1701.175±0.365ab非EMT组1350.625±0.2500.609±0.218a1.203±0.4801.200±0.311a
a与同组治疗前相比，b与非EMT组相比
2.5 Relaxin与TGF-β1对EMT患者在位子宫内膜基质细胞增殖的影响
TGF-β1对EMT患者子宫内膜基质细胞有明显促增殖作用(r=0.316，P<0.05)，并呈剂量依赖关系，当TGF-β1达到10 ng/mL以上，作用到达平台，见表4。Relaxin对EMT患者子宫内膜基质细胞有明显抑制作用，呈剂量依赖关系(r=-0.285,P<0.05)，最低有效抑制浓度为20 ng/mL，最大抑制浓度为60 ng/mL，见表4。
表4 Relaxin与TGF-β1对EMT患者在位子宫内膜基质细胞增殖的影响
Tab.4 The impact of Relaxin and TGF-β1 on the proliferation of Eutopic endomentrium stromal cell
指标剂量/(ng·mL-1)细胞存活率(%)TGF-β101000.1100112151351016515163Relaxin0100101002080506060458055
2.6 腹腔积液中Relaxin与TGF-β1对EMT盆腔粘连r-AFS分期的影响
二分类Logistics回归分析显示，EMT分期为因变量(Ⅲ～Ⅳ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0)，纳入腹腔积液中Relaxin、TGF-β1水平为自变量(均按连续变量赋值)，另纳入患者年龄(≥35=1，<35=0)、BMI(≥24=1，<24=0)、孕次(≥2=1，<2=0)、流产史(≥1=1，<1=0)为协变量，经二分类Logistics回归分析显示，年龄、TGF-β1是EMT盆腔粘连r-AFS分期的危险因素，Relaxin是EMT盆腔粘连r-AFS分期的保护因素，见表5及图5。
表5 二分类Logistics回归分析结果
Tab.5 The results of binary Logistics regression analysis
变量BPOR95%CI年龄0.3360.0421.0400.610～1.663BMI0.4110.6150.6650.139～2.195孕次0.5660.5050.5710.110～1.937流产史0.7650.3760.4670.089～2.483Relaxin-0.1600.0030.8260.381～1.074TGF-β10.2870.0001.4910.818～1.802
图5 森林图
Fig.5 Forest plots
3 讨 论
本研究结果显示，EMT患者腹腔积液及血清TGF-β1 mRNA水平的升高，腹腔积液及血清Rela-xin mRNA水平的降低与盆腔粘连的程度相关与月经周期无关，这与李成龙等[3]的研究结果一致。为避免既往手术史而形成的盆腹腔粘连影响r-AFS评分,本研究剔除了有盆腹腔手术史的EMT患者入组。考虑到子宫腺肌症盆腔粘连概率明显低于卵巢EMT，为避免实验对象选择性偏倚，入组时排除了子宫腺肌症患者及术后1个月加用药物巩固治疗的患者。本研究进一步发现，腹腔积液TGF-β1水平与EMT患者盆腔粘连呈正相关，随着其水平的升高，盆腔粘连的评分呈逐渐上升趋势，而腹腔积液Relaxin水平与EMT患者盆腔粘连呈负相关；二分类Logistics回归分析显示，TGF-β1是EMT盆腔粘连r-AFS分期的危险因素，Relaxin是EMT盆腔粘连r-AFS分期的保护因素。
据文献报道，90%以上的中重度EMT患者存在不同程度的盆腔粘连[2]。但EMT粘连形成机制不明，普遍认为是一种慢性炎症所致的腹膜重塑[4]。TGF-β1是转化生长因子β家族中最为常见的亚型，对细胞增殖调节、细胞外基质聚集、炎性细胞浸润等具有重要作用[5]。当腹膜受到异位内膜持续性侵袭，腹膜间皮细胞受损，组织缺血缺氧，促使炎性细胞，成纤维细胞，巨嗜细胞合成和分泌TGF-β，使其表达升高。翁玉雷等[6]发现，TGF-β1刺激后成纤维细胞增殖明显增加，成纤维细胞α-SMA表达增多,纤维化相关的基因转录明显增加[6]。周围等[7]发现，EMT患者外周血TGF-β1水平明显高于健康对照组和非EMT患者疾病对照组，并且随着疾病分期和痛经评分的升高，其水平逐渐升高。李田田等[8]通过动物学实验发现EMT可导致大鼠严重、广泛的盆腔粘连;活血消异方能过调控TGF-β/Smads信号传导通路相关因子的表达,改善EMT盆腔粘连程度。本研究发现，腹腔积液TGF-β1与EMT患者盆腔粘连呈正相关,腹腔积液TGF-β1在判断EMT盆腔粘连的ROC曲线下面积为0.777 9，诊断界值为71.5 g/L，还发现EMT组治疗后1个月血清TGF-β1 mRNA相对表达水平显著低于治疗前，可以认为TGF-β1表达的高低不仅能较好地反映盆腔的粘连程度，还能预测EMT盆腔粘连预后情况。
目前，有许多研究表明,Relaxin在心、肺等非生殖系统器官中具有抑制胶原合成和促进细胞外基质降解的作用,与器官的抗纤维化密切相关[9-12]。女性Relaxin主要由卵巢合成、分泌及释放，也可由子宫内膜产生。目前国内外尚无Relaxin在EMT相关报道。本研究是首次检测Relaxin在EMT盆腔粘连腹腔积液及外周血的表达水平，发现Relaxin水平与EMT盆腔粘连存在明显负相关，腹腔积液Relaxin表达水平在判断EMT盆腔粘连的ROC曲线下面积为0.786 5,诊断界值为19.0 g/L；还发现EMT组治疗后1个月血清Relaxin mRNA相对表达水平显著高于治疗前，这提示Relaxin表达的高低能较好地反映盆腔的粘连程度及EMT盆腔粘连预后情况。
在本研究中，Logistics二分类回归分析显示，TGF-β1是盆腔粘连r-AFS分期严重程度危险因素，而Relaxin是保护因素，不受体内激素影响。通过检测腹腔积液Relaxin与TGF-β1水平,显示两者相关系数为-0.677 8。本研究还发现腹腔积液TGF-B1与Relaxin联合诊断EMT盆腔粘连的ROC曲线下面积为0.850 5。二者联合诊断EMT盆腔粘连较单因子明显提高EMT盆腔粘连诊断准确性，也进一步说明两者在EMT盆腔粘连的发生发展上起着相互抑制作用。Tseng等[13]发现Relaxin在子宫内膜腺上皮细胞中可以使cAMP快速累积。相关研究显示细胞内增加的cAMP浓度可抑制TGF-β1对结缔组织生长因子(connetive tissue growth factor, CTGF)的诱导，RLX还可通过抑制Smad2磷酸化而发挥抑制TGF-β1对CTGF的诱导作用[14]，进而使CTGF表达降低。CTGF作为器官纤维化病变相关的关键新星因子，可以特异性介导TGF-β1促纤维化作用。这与本研究的结果吻合。有研究表明，Relaxin可抑制由TGF-β1诱导的成纤维细胞的增生、分化[15-16]。TGF-β1发挥其生物学作用的信号转导通路主要为TGF-β1/Smad通路。近期报道TGF-β1通过SMAD3/3通路及CTGF的表达介导子宫内膜来源的成纤维细胞蛋白的生成[17]。有研究发现，Relaxin可抑制SMAD3的磷酸化及其与Smad4形成复合物，从而阻止TGF-β1对基因的调控,也就阻断了TGF-β1调控的生物学作用[18]。这些研究在人类机体不同细胞不同通路上均揭示了Relaxin与TGF-β1之间的相互抑制作用，也为未来研究Relaxin与TGF-β1在EMT盆腔粘连发现机制提供了一定的基础。
本研究发现，TGF-β1与Relaxin联合检测可明显提高预判EMT盆腔粘连严重程度及预后的敏感性，还通过体外将EMT在位子宫内膜细胞分离纯化为基质细胞，并观察TGF-β1与Relaxin对基质细胞增殖的影响，结果显示TGF-β1与Relaxin均以剂量依赖方式分别促进及抑制子宫内膜基质细胞的增殖。这为后期EMT盆腔粘连的发生机制提供了一定的理论依据，也给临床上EMT盆腔粘连的诊断提供了新的思路，而且TGF-β1与Relaxin联合诊断降低了单因子在预测的随机及复杂性，大大地提高了临床预测时的准确性，对EMT盆腔粘连术前手术难度的预测具有很好的临床指导意义。虽然本实验在研究对象的选择上剔除了盆腔手术史患者，同时也比较了EMT及非EMT患者，但盆腔粘连发生的原因比较复杂，所以TGF-β1与Relaxin在EMT盆腔粘连的形成机制探讨是未来研究的着重点，有待后续进一步补充。且本研究样本量不够多，为单中心研究，存在着样本的区域性选择性偏倚。随着分子生物学的发展和新的实验构思的出现，可以进一步为临床诊断、治疗EMT提供理论基础。
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