胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一[1]，其中多数患者初诊时为进展期胃癌。这些患者即使接受手术治疗，其预后仍不理想[2]。研究表明，术前新辅助化疗可有效缩小肿瘤、降期降级、增加R0切除率，从而显著改善患者预后。但肿瘤分期不准确、部分患者对化疗不敏感、肿瘤异质性等可能会使新辅助化疗失败，肿瘤进展并延误手术时机[3]。因此，如何筛选新辅助治疗从而使患者获益，是临床常见问题之一。但现阶段仍缺乏有效预测进展期胃癌患者新辅助化疗疗效的手段。
长链非编码RNA WT1-AS是前期研究筛选出来的候选胃癌抑癌基因[4]。研究表明，WT1-AS在胃癌中表达下调，过表达则显著抑制体内、外胃癌细胞增殖、侵袭、转移。本研究探索WT1-AS预测胃癌患者新辅助化疗之疗效。
1 资料与方法
1.1 一般资料
回顾分析2018年1月—2020年12月同济大学附属东方医院胃肠外科收治的63例行新辅助化疗的进展期胃癌患者的临床资料。所有患者均经内镜活检确诊为胃癌。纳入标准： (1) 年龄>18岁，病理学诊断为胃癌；(2) 符合2018CSCO胃癌指南新辅助治疗原则；(3) 既往未接受任何放化疗；(4) 无明显远处转移；(5) 预计生存时间>1年。排除标准： (1) 合并严重的心、肝和肾等器质性疾病；(2) 合 并远处转移；(3) 既往接受过放化疗、免疫治疗等其他措施。所有患者及其亲属均签署知情同意书，研究符合世界医学会《赫尔辛基宣言》相关要求。
1.2 方法
1.2.1 化疗方案 所有患者术前接受4个周期FLOT方案化疗： 多西他赛50 mg/m2(d1)、奥沙利铂85 mg/m2(d1)，亚叶酸钙200 mg/m2(d1)，氟尿嘧啶2 600 mg/m2(d1，维持24 h)，每2周1次(d1是指第1天用药)。
1.2.2 新辅助疗效评价标准 采用2020年NCCN指南推荐的TRG评分： 0分(完全缓解)，1分(接近完全缓解)，2分(部分缓解)，3分(缓解差或无缓解)。本研究将0～2分定义为有效，3分定义为无效。
1.2.3 细胞培养 胃癌细胞系SGC7901及过表达WT1-AS胃癌细胞SGC7901细胞为实验室保存。使用100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素以及10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液(Gibco公司)，于37 ℃、含5%CO2饱和湿度培养。
1.2.4 qPCR 取术后新鲜胃癌标本组织，使用Trizol(Invitrogen)抽提总RNA，依据说明书使用反转录试剂盒(Promega公司)合成cDNA。按说明使用SBGREEN PCRmaster mix(ABI)进行qRT-PCR，以GAPDH作为内参照。采用相对Ct(threshold cycle)值评估基因的相对表达，2-ΔCt计算mRNA相对表达水平。WT1-AS引物： 5′-GCCTCTCTGTC-CTCTTCTTTGT-3′(正义链), 5′-GCTGTGAGTC-CTGGTGCTTAG-3′(反义链)。GAPDH引物： 5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3′(正义链),5′-CAG-TGGGAACACGGAAAGC-3′(反义链)。
1.2.5 细胞凋亡检测 使用Annexin Ⅴ/PI double staining kit(BD biosciences)试剂盒检测细胞凋亡，细胞消化后离心(500×g，5 min)，Binding buffer洗脱，加入PI 5 μL、Annexin V 2.5 μL孵育15 min，上机检测。
1.2.6 Western印迹法 采用高效RIPA加蛋白酶抑制剂(北京康为生物科技公司)及磷酸酶抑制剂(CST公司)裂解蛋白，试剂盒测定其浓度(Pierce公司)。蛋白电泳结束后，转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉的TBST封闭，一抗孵育过夜，HRP标记二抗孵育2 h(CST公司)，超敏发光液(Thermo公司)显影，Tannon机器发光(Tanon公司)。Cleavted caspase3抗体购自CST公司(CST公司)，GAPDH抗体购自上海康成公司，兔、鼠二抗购自CST公司。
1.3 统计学方法
采用SPSS 21.0软件进行统计分析。数据以
表示，均数的比较采用t检验，率的比较采用χ2检验，使用多因素Logistic回归分析新辅助疗效的影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 新辅助疗效与临床特征相关性
63例纳入患者男34例，女29例，平均年龄(60.7±8.3)岁；Ⅱ期24例，Ⅲ期39例；其中，新辅助治疗有效44例，无效19例。按WT1-AS qPCR中位CT比值(5.26)属WT1-AS高表达26例、低表达37例。如表1所示，新辅助化疗有、无疗效与患者年龄、性别、BMI、肿瘤大小、CEA和淋巴结转移无差异，但与分化程度(χ2=5.377，P=0.020)、TNM分期(χ2=5.740，P=0.017)、WT1-AS表达(χ2=7.287，P=0.007)相关。
表1 胃癌患者新辅助疗效与临床特征相关性
Tab.1 Correlation between neoadjuvant efficacy and clinical characteristics in patients with gastric cancer
临床资料有效组(n=44)无效组(n=19)χ2/tP年龄/岁61.9±8.258.1±8.41.6920.096性别0.1690.681 男2311 女218BMI/(kg·m-2)22.5±2.33.1±0.71.2920.295肿瘤大小/cm4.1±0.73.9±0.50.9710.335分化程度5.3770.020 高中分化307 低/未分化1412CEA/(ng·mL-1)0.2200.639 >52512 ≤5197TNM分期5.7400.017 Ⅱ213 Ⅲ2316淋巴结转移0.0030.957 有3515 无94WT1-AS7.2870.007 高表达233 低表达2116
2.2 影响胃癌患者新辅助疗效的相关因素
将表1单因素分析有显著意义的变量纳入多因素Logistic回归分析，结果如表2所示，肿瘤分化程度、TNM分期、WT1-AS表达均为化疗有效的独立预测因子)。WT1-AS对应的ROC曲线下面积为0.67(95%CI： 0.529～0.806,P=0.036)，灵敏度、特异度分别为52.3%和84.2%，见图1。
表2 影响胃癌患者新辅助疗效的相关因素Logistic回归分析
Tab.2 Logistic regression analysis of related factors affecting neoadjuvant efficacy in patients with gastric cancer
协变量BS.E.WaldOR95%CIP分化程度2.620.918.3113.672.3180.93<0.01TNM分期2.941.028.3118.972.56140.22<0.01WT1-AS表达2.040.895.257.661.3443.750.02
图1 WT1-AS预测新辅助疗效的ROC曲线分析
Fig.1 ROC curve analysis of WT1-AS predicting neoadjuvant efficacy
2.3 WT1-AS促进5-Fu致胃癌细胞凋亡
将不同浓度5-Fu处理48 h的WT1-AS正常表达和过表达的胃癌细胞系SGC7901作凋亡分析，结果如图2所示，随5-Fu(2、4、8 μg/mL)浓度增加，细胞凋亡逐渐增加(P<0.05)；WT1-AS过表达组胃癌细胞凋亡百分比高于WT1-AS正常表达组，Western印迹法结果显示过表达组cleaved-3蛋白表达升高。这表明，WT1-AS可促进5-Fu致胃癌细胞凋亡。
图2 WT1-AS过表达促进5-Fu致胃癌细胞凋亡
Fig.2 Overexpression of WT1-AS promotes apoptosis of gastric cancer cells induced by 5-FU
A： 不同浓度5-Fu处理的WT1-AS正常表达和过表达胃癌细胞凋亡百分比；B： 流式细胞分析凋亡分布图；C： Western印迹法检测凋亡标志物cleaved caspase3表达变化
3 讨 论
胃癌新辅助化疗已被全世界认可，但其疗效仍受诸多因素制约，如术前T分期准确性、化疗药物的选择及敏感性。研究表明，T分期有助于评估新辅助化疗敏感性，并与5年总生存率相关[5]。但增强CT、超声内镜等对术前判断T分期的准确性有限，如CT不易区分肿瘤和化疗后瘢痕，准确率仅为50%左右[6]；超声内镜结果易受操作者影响，且难以鉴别T2、T3期肿瘤[7]。据报道，新辅助治疗前患者血清CEA<2.5 g/L可获较高pCR率和肿瘤降期率[8]；CEA表达与高pCR率有关，CEA水平是影响pCR的独立因素(OR=2.775，P=0.022)[9]。但这些标志物缺少敏感性、特异度。
近年研究表明，LncRNA可预测肿瘤化疗反应[10-11]；生物信息学分析显示BC032585等3个LncRNA与乳腺癌新辅助化疗疗效有关，RAN干扰敲低其表达可上调乳腺癌细胞MDR1表达促进细胞对多种抗癌药物的耐药性[12]。本研究分析了WT-AS表达与胃癌新辅助化疗敏感性的关系，结果表明WT1-AS是新辅助化疗疗效的独立预测因子，WT1-AS高表达预示有较好的化疗反应，提示WT1-AS在进展期胃癌新辅助化疗疗效预测方面可能有潜在价值。
化疗抵抗是胃癌患者化疗治疗失败的主要原因之一，这涉及多种抵抗机制，如肿瘤微环境、药物代谢、DNA修复改变及凋亡基因产物失活等[13]。WT1-AS是一种长链非编码RNA，既往研究表明WT1-AS可抑制胃癌细胞的增殖、迁移，但在化疗中的作用不详。本研究显示，经不同浓度5-Fu处理的WT1-AS过表达胃癌细胞凋亡百分比较高，表明WT1-AS可促进5-Fu致胃癌细胞凋亡，或许提示WT1-AS参与胃癌细胞化疗抵抗是WT1-AS预测进展期胃癌化疗敏感性的可能机制之一。
鉴于本研究上述结果以及研究存在样本量偏小、属回顾性等局限型，如后续能展开大样本、前瞻性深入研究，或许有望使WT1-AS在预测胃癌新辅助化疗疗效方面发挥潜在的临床价值。
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