骨髓增生异常综合征患者基因突变及临床特征分析

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndro-mes,MDS)是一组起源于骨髓造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病，其特征是骨髓的一系或多系病态造血，外周血细胞减少及急性髓系白血病(acute mye-loid leukemia,AML)转化等[1]。随着二代测序(next generation sequencing,NGS)技术的发展，越来越多在MDS中具有病理意义的基因突变被确定[2]。这些分子指标对患者的疾病诊断、危险分层、预后评估和指导个体化治疗等具有重要的临床意义。然而，不同中心关于MDS基因的突变特征及其与临床特征关系的报道不尽相同。本研究分析了同济大学附属同济医院血液科62例MDS患者的基因突变谱及染色体核型、临床特征、实验室检查结果、MDS亚型、IPSS-R积分等指标，并探讨了基因突变对上述指标的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

依据《骨髓增生异常综合征中国诊断与治疗指南》(2019年版)标准，经骨髓形态学、免疫分型、细胞遗传学、分子生物学和骨髓活检等检查明确诊断的62例初发MDS患者纳入本研究。其中MDS伴单系病态造血(MDS with single lineage dysplasia,MDS-SLD)3例，MDS伴多系病态造血(MDS with multilineage dysplasia,MDS-MLD)32例，MDS伴环形铁粒幼细胞(MDS with ring sideroblasts,MDS-RS)7例，MDS伴单纯5q-1例，MDS伴原始细胞增多 Ⅰ 型(MDS with excess blasts subtype 1,MDS-EB-1)10例，MDS伴原始细胞增多 Ⅱ 型(MDS with excess blasts subtype 2,MDS-EB-2)9例，无MDS不能分类型(unclassifiable MDS,MDS-U)。

1.2 方法

1.2.1 标本收集抽取初诊MDS患者的骨髓血5 mL，EDTA抗凝，采用Ficoll密度梯度离心法获得单个核细胞，应用Qiagen公司DNA提取试剂盒提取基因组DNA，置-70 ℃冰箱备用。

1.2.2 NGS测序所测基因均为与MDS相关、突变率高、较为热门的34种基因。构建34个MDS相关的基因文库。通过Ion Ampliseq多重PCR扩展技术，一次性抓取待检测的所有基因，并将构建好的文库用Life Technologies平台Ion Proton半导体测序仪进行检测。NGS扩增子平均基因覆盖率达99%，平均测序深度1 000X，90%以上的序列可以与靶标区目的序列比对上，靶标区碱基覆盖度较均一。致病性突变位点选择主要根据美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)指南、专家共识、单核苷酸形态性数据库(database of Single Nucleotide Polymorphism,dbSNP)、肿瘤中体细胞突变目录(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer,COSMIC)等数据库及参考文献报道确定，均为已明确与MDS发病及预后相关的基因。34个高频基因为ASXL1，BCOR，BCORL1，CALR，CBL，CEBPA，CSF3R，DNMT3A，ETNK1，ETV6，EZH2，FLT3，IDH1，IDH2，JAK2，KIT，KRAS，MPL，NF1，NPM1，NRAS，PHF6，PIGA，PTPN11，RUNX1，SETBP1，SF3B1，SRSF2，STAG2，TET2，TP53，U2AF1，WT1，ZRSR2。

1.2.3 染色体核型分析采用常规G显带技术进行染色体核型分析。取患者初诊时骨髓悬液2～4 mL，常规无菌细胞培养24～72 h，加入秋水仙碱在37 ℃培养箱孵育20～30 min，使细胞分裂静止在中期，使用固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定，滴片并烘干玻片，常规G显带，染色体核型分析参考《人类细胞基因组学国际命名体制(ISCN2016)》进行描述。

1.3 统计学处理

所有数据均采用SPSS 21软件进行统计分析。计数资料采用卡方检验或Fisher确切概率法分析，计量资料采用秩和检验或t检验分析，基因型频率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NGS测序结果

本研究的62例初诊MDS患者中，共有52例患者至少携带1种基因突变，阳性率为83.87%，最多的同时携带6种基因突变。其中仅携带1种基因突变的有27.42%(17/62)，同时携带2种、3种、4种、5种、6种基因突变的患者分别为27.42%(17/62)、14.52%(9/62)、8.06%(5/62)、3.23%(2/62)、3.23%(2/62)。34种检测基因中各基因突变发生率见图1，其中IDH2、MPL、NF1、NPM1、CSF3R、FLT3、ETNK1、PIGA未检测到突变，突变率最高的是TET2和DNMT3A基因，分别为19.35%和17.74%，其次为ASXL1基因(突变率16.13%)。突变率大于10%的基因还包括EZH2、SF3B1、U2AF1和TP53基因。从突变基因类型看表观遗传相关基因突变是MDS中最易受累的，有59.68%(37/62)的患者具有一种或多种表观遗传相关基因突变。其他如RNA剪接因子相关基因的突变发生率也较高。

2.2 临床特征与基因突变的相关性分析

62例患者中男性40例，女性22例，年龄跨度为28～88岁，平均年龄为64.56±14.82岁，中位年龄为67.50岁，其中≥60岁47例，占75.81%。62例患者的MDS亚型分布见图2，有32例患者核型异常。各亚型中，MDS-EB型基因突变最高，为(2.21±1.47)个。进一步根据NGS测序情况把62例患者分为NGS突变阳性组和NGS突变阴性组，比较两组间的临床特征，包括MDS亚型、血常规、核型、铁蛋白、LDH、血清铁、骨髓原始细胞比例、国际预后评分(IPSS-R)等指标，见表1。统计结果显示，NGS突变阴性组的白细胞总数及中性粒细胞数均明显高于NGS突变阳性组，差异有统计学意义(P=0.022 4、P=0.043 8)，而在其他方面的差异均无统计学意义。

2.3 DNMT3A基因突变与临床特征的相关性分析

62例MDS患者中共检测到11例患者发生DNMT3A突变，阳性检出率为17.7%(11/62)。所有患者均为杂合型突变，突变类型主要为移码突变(1例，c.2193_2195del，p.Phe732del)和点突变(10例)。DNMT3A突变组和DNMT3A非突变组之间的年龄、性别、MDS亚型、血常规、血清铁、铁蛋白以及核型方面无显著差异。但DNMT3A突变组骨髓原始细胞比例、IPSS-R评分均低于DNMT3A非突变组，差异有统计学意义(P=0.018、P=0.016 9)，见表2。本研究进一步比较了DNMT3A突变组和NGS阴性组在上述临床指标的差异，统计分析显示，DNMT3A突变组在LDH>250 U/L的发生率及IPSS-R评分方面均明显低于NGS阴性组，差异有统计学意义(P=0.038 3、P=0.022 7)。这11例患者中有7例患者均合并其他基因突变，从合并突变类型看，仍然是表观遗传调控因子的比例最高。合并突变阳性的患者的平均年龄明显低于合并突变阴性的患者，差异有统计学意义(P=0.036)。

2.4 TET2基因突变与临床特征的相关性分析

62例MDS患者中共检测到12例患者发生TET2突变，阳性检出率为19.4%(12/62)，是本研究中突变比率最高的基因。所有患者均为杂合型突变，突变类型主要为:移码突变1例[c.4105_4108 del TCAG(p.Ser1369GlyfsTer78)]；点突变11例。12例TET2突变患者中有10例患者均合并其他基因突变，从合并突变类型看，仍然是表观遗传调控因子的比例最高。

TET2突变组和TET2非突变组之间在年龄、性别、亚型、白细胞计数、血小板计数、血清铁、铁蛋白、LDH、骨髓原始细胞数方面无明显差别，但TET2突变组的血红蛋白计数要明显高于TET2非突变组(P=0.035 7)，TET2突变组异常核型发生率和IPSS-R评分要显著低于TET2非突变组(P=0.040、P=0.044),见表3。进一步比较TET2突变组和NGS阴性组在上述临床指标的差异，统计分析显示TET2突变组的血红蛋白计数同样要明显高于NGS阴性组(P=0.035)，而TET2突变组的异常核型发生率要显著低于NGS阴性组(P=0.035)。

2.5 TP53基因突变与临床特征的相关性分析

62例MDS患者中共检测到9例患者发生TP53突变，突变率为14.5%(9/62)。除1例患者为纯合突变，其他均为杂合型突变，此纯合突变为移码突变[214_215 del CCinsGG(p.Pro72Gly)]，其他均为点突变。9例TP53突变阳性患者有6例合并其他基因突变，合并突变主要涉及表观遗传调控基因。

TP53突变组和TP53非突变组患者在年龄、性别、亚型、白细胞计数、血红蛋白、血清铁、铁蛋白、LDH、骨髓原始细胞数、IPSS-R等方面差异无统计学意义(P>0.05)。TP53突变组血小板计数及血清铁水平明显低于TP53非突变组(P=0.023、P=0.003)，而LDH水平和IPSS-R明显高于TP53非突变组(P=0.001、P=0.002)，见表4。进一步比较了TP53突变组和NGS阴性组在上述临床指标的差异，统计分析显示TP53突变组血小板计数、白细胞计数及血清铁水平均明显低于NGS阴性组(P=0.026、P=0.046、P=0.023)。

3 讨论

MDS是一组高度异质性疾病。原发性MDS中基因突变的检出率近90%，对MDS的治疗及预后评估有重要价值。在本研究中，83.87%的患者可检测到至少一种基因突变，29.03%(18例)的患者可检测到3种以上基因突变，突变频率最高的基因是表观遗传相关基因，突变组的白细胞总数及中性粒细胞数均明显低于非突变组，说明基因突变加重了骨髓衰竭的程度，与国内外报道一致。

TET2基因和DNMT3A基因都是表观遗传相关的重要基因。TET2突变与正常核型相关，但TET2基因突变的预后意义尚存在一定争议。TET2基因突变在本研究的样本中发生率最高，TET2突变组的血红蛋白水平明显高于TET2非突变组及NGS阴性组，而异常核型发生率显著低于TET2非突变组及NGS阴性组。有研究表明，在MDS发生的较早阶段，基因突变率低，表观遗传基因较RNA剪切因子较早发生[1]。Kosmider等[3]观察到TET2突变是MDS中的常见分子事件，并且是预后良好的独立预测因子，各种分化谱系亦提示TET2突变发生在疾病发展的早期[4]。本研究结果证实了这些观点，TET2基因突变组具有更良性的临床特征。本样本中TET2突变位点均不相同，其中33.3%突变位点位于TET2基因的BOX1保守结构域，包括错义突变和移码突变，导致正常的氨基酸编码提前终止。DNA甲基化特异性抑制剂在MDS治疗中，TET2突变阳性组疗效较无基因突变组显著[5-6]。另一项研究鉴定了213例接受阿扎胞苷或地西他滨治疗的MDS患者中40个基因的突变[6]，当排除ASXL1突变和TET2低频率突变的患者时，这种改善反应更加明显(P=0.009)。这些研究均证实了DNA甲基化特异性抑制剂在该类基因突变阳性患者中的疗效。而TET2基因BOX1保守结构域的高频突变也提示此结构域有可能成为新的治疗靶点。

越来越多的研究[7-10]证实了DNMT3A在MDS发病中的作用，但是不同研究对DNMT3A基因突变发生频率的报道差异较大(2.6%～20.2%)。在本研究中，DNMT3A突变发生率仅次于TET2，为17.7%。1例患者检测到的移码突变致使第732位编码氨基酸发生丢失，与不良预后相关，该突变既往在MDS患者有过报道[11]。1例患者检测到错义突变c.2645G>A(p.Arg882His)，为DNMT3A基因的热点突变，该突变可降低酶的催化活性及其与DNA的亲和力，可能与髓系恶性转化有一定的相关性[12]。部分突变(c.1978T>Cp.Tyr660His，c.1969G>Ap.Val657Met，c.2146G>Ap.Val716Ile，c.1916T>G p.Leu639Arg)在淋巴瘤、AML患者有报道，但未见在MDS患者的报道，临床意义不明确[13-15]。DNMT3A基因突变是急性髓系白血病的不良预后因素[12]，但其在MDS中DNMT3A突变与临床表现的相关性报道不一[7，16]。尚无研究揭示DNMT3A突变对生存的显著影响，甚至有研究出现DNMT3A突变的患者接受异基因HSCT的患者比未接受异基因HSCT的患者具有更好OS(P=0.038)[17]。本研究中DNMT3A突变组骨髓原始细胞比例、IPSS-R评分均低于DNMT3A非突变组，DNMT3A突变组在LDH>250 U/L的发生率及IPSS-R评分方面均明显低于NGS阴性组，提示DNMT3A突变并没有导致更严重的临床表现和AML转化倾向，与Bejar等[6]的报道一致。本研究中11例DNMT3A突变阳性患者中有7例患者均合并其他基因突变，包括SF3B1等其他基因突变的存在可能削弱了DNMT3A突变对疾病严重度的负性影响，还需要进一步的前瞻性研究、更大的样本量证实这一点。

TP53基因编码的P53蛋白具有多种靶基因，很多都与细胞凋亡或细胞周期调控过程有关，通过与这些基因内部或上游的P53反应元件相结合的方式反式激活这些基因的转录，促进细胞死亡或生长停滞。在原发MDS中TP53基因突变发生率为5%～10%[12]，本研究中TP53突变发生率达14.5%，可能与本课题62例患者的年龄较大(平均年龄、中位年龄均高于国内既往报道的数据)有关。报道显示TP53基因突变多发生在老年MDS患者中，年轻患者相对少见[18]。9例TP53突变阳性患者中，有1例为纯合突变，其余均为杂合突变。突变频率均高于40%，突变位点涉及TP53基因编码蛋白的DNA Binding结构域(如c.716A>Gp.Asn239Ser)，四聚体化结构域(如c.1009C>Tp.Arg337Cys)等突变热点，通过影响基因的正常剪切，降低转录活性，氨基酸编码提前终止等方式影响基因正常功能。其中c.218T>C(p.Val73Ala)突变暂未检索到与恶性血液疾病的相关报道。本研究显示，TP53突变组在血小板计数、白细胞计数、LDH、IPSS-R等临床特征方面差于TP53非突变组，提示了TP53突变患者的骨髓衰竭程度，疾病危险度分组均更差于TP53非突变患者，提示TP53突变患者预后不良。在11例仅携带1种基因突变的患者中，有3例患者仅携带TP53突变，亦说明TP53单基因突变亦具有较强的致病性。TP53靶向药物Eprenetapopt已在骨髓增生异常综合征患者中显示了良好的抗肿瘤活性。TP53突变的MDS患者对Eprenetapopt和阿扎胞苷的联合治疗耐受性良好，可产生较高的临床反应率和分子缓解率[19]。更多TP53靶向药物可能被研制出，有望改善MDS患者的预后。

综上所述，本研究说明MDS患者基因突变发生率高，不同的基因突变与不同的临床特征相关，深入研究MDS患者基因突变与临床特征、疾病预后、个体化治疗等方面的相关性具有重要意义。

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