瘙痒是一种引起强烈搔抓意愿的不愉快的感觉[1]，超过6周的瘙痒称为慢性瘙痒。慢性瘙痒常见于多种皮肤病，如特异性皮炎、银屑病、结节性痒疹等；也可继发于系统性疾病、神经及精神性疾病等，严重影响患者生活质量和身心健康[2]。目前临床上针对慢性瘙痒的治疗主要以口服抗1型组胺受体药物为主，但常常收效甚微。
紫外线照射已成为皮肤科多种疾病的常规治疗手段。波长在311～313 nm的窄谱中波紫外线(narrow-band ultraviolet B, NB-UVB)因其穿透性强，不易引起皮肤损害而被广泛应用于白癜风、银屑病、皮肤淋巴瘤、特异性皮炎等疾病的治疗[3-6]。近年来，NB-UVB在临床上被证实是一种对慢性瘙痒有显著疗效、相对安全的物理治疗方法，并受到欧洲慢性瘙痒管理指南的推荐[7-8]。但NB-UVB缓解慢性瘙痒的机制仍不明确。本研究利用慢性瘙痒模型小鼠探究窄谱中波紫外线对慢性瘙痒的作用及其机制，为NB-UVB的临床应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物
4～6周龄雄性C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，体重约20 g。小鼠饲养环境提供充足的水、食物及活动空间，保持(22±2 ℃)的温度，60%～80%的湿度以及12 h的昼夜节律。所有实验均按照《同济大学生物研究用动物指南》进行，并经过同济大学医学院动物研究委员会批准(TJAA08521102)。
1.2 试剂及仪器
丙酮(货号： 10000418)、盐酸(货号： 10011018)、无水乙醇(货号： 10009218)、二甲苯(货号： 10023418)、多聚甲醛(货号： 80096618)、蔗糖(货号： 10021418国药)购自国药集团；异氟烷(R510-22)购自瑞沃德公司；DNFB(货号： D1529)购自Sigma公司；SuperReal荧光定量预混试剂增强版(货号： FP205-02)、FastQuant RT Kit(货号： KR106-03)购自天根生化科技有限公司、DEPC水(货号： B501005-0500)购自生工生物工程股份有限公司、TRIzol Reagent(货号： R4801-01)购自Magen公司、IL-10 ELISA试剂盒(货号： M1000B)购自R&D公司、窄谱中波紫外线治疗仪(7 mW/cm2)购自Sigma公司。
1.3 变应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis， ACD)的建立
参照并改良文献[9-10]中ACD的造模方法。提前1天用剃毛器将小鼠颈背部皮肤剃净、备皮。于第1、4、8、11天，在小鼠颈背部连续涂抹50 μL的0.15% DNFB丙酮溶液。对照组于相同位置涂抹50 μL的丙酮溶液。涂抹完成后的第1天计为Day 1(D1)。分别于第1天(D1)、第3天(D3)、第5天(D5)、第7天(D7)、第15天(D15)、第21天(D21)观察小鼠的行为学及皮损改变。
1.4 窄谱中波紫外线照射方法
按照公式： 辐照剂量(mJ/cm2)=辐照强度(mW/cm2)×辐照时间(s)可计算出辐照剂量。本实验选取8、10、12、14 s照射时间，即应用56、70、84、96 mJ/cm2的照射剂量照射小鼠颈背部皮肤。照射开始前，使用异氟烷麻醉小鼠，并将其固定在平面上。遮盖除颈背部以外的其他皮肤，使照射光源位于小鼠颈背部皮肤上方约2 cm的距离，按下按钮，开始照射。在照射过程中，注意保护操作者及实验动物的眼睛。于ACD造模成功后第1天(D1)、第3天(D3)、第5天(D5)、第7天(D7)、第9天(D9)、第11天(D11)、第13天(D13)、第15天(D15)进行照射干预。对照组小鼠同样给予麻醉及固定处理，但不照射。每一次照射应位于皮损观察及行为学数据采集之后。在第15天测量指标收集完毕后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，取下局部皮肤，放入固定液中或液氮保存。
1.5 正常小鼠最小红斑量(minimal erythema dose, MED)的确定
提前1天将正常8～12周龄雄性C57BL/6小鼠颈背部备皮，应用70、84、96 mJ/cm2照射剂量的窄谱中波紫外线照射小鼠备皮处皮肤。于24 h候后观察小鼠局部皮肤改变，并取照射局部皮肤放入固定液中。
1.6 组织病理学观察
放入固定液中的皮肤修剪、脱水、石蜡包埋、切片、H-E染色后，显微镜下观察组织病理学改变。
1.7 瘙痒行为学检测
参考文献[11]和[12]所述，小鼠后爪抬起挠抓造模部位，并放下，计为1次瘙痒行为。在测量行为前，保证周围环境安静，让小鼠在鼠笼中适应30 min后开始记录。使用录像机记录下小鼠45 min的行为，采用双盲法由人工计数。
1.8 qPCR
取小鼠颈背部皮肤，剪成小块状放入盛有TRIzol的EP管中。提取出皮肤中的总RNA，经反转录试剂盒逆转为cDNA,依次为模板进行扩增。根据参考文献[13]，使用以下引物，组氨酸脱羧酶(histidine decarboxylase)引物： 上游序列： 5′-CGTGAATACTACCGAGCTAGAGG-3′；下游序列： 5′-ACTCGTTCAATGTCCCCAAAG-3′；GAPDH引物： 上游序列： 下游序列： 5′-GAGTGTTTCCTCG-TCCCGTA-3′；下游序列： 5′-TCACCCCATTTGAT-GTTAGT-3′。配制10 μL反应体系，扩增程序为： 95 ℃，600 s，重复1次；95 ℃，10 s；60 ℃，10 s；72 ℃，10 s，重复45次；72 ℃延伸600 s。以2-ΔΔCT计算样品中目的基因的表达量。
1.9 ELISA
皮肤组织按照10 ul/mg加入裂解液并研磨，4 ℃裂解30 min，12 000 r/min, 4 ℃，离心半径13.5 cm，离心15 min, 取上清液进行ELISA检测。ELISA检测按照R&D试剂盒说明书进行，标准品和样本均做3复孔。依据标准品OD值和浓度绘制标准曲线，根据样本OD值计算样本IL-10的含量(pg/mL)。
1.10 统计学分析方法
所有数据均使用SPSS 16.0软件进行分析，计量资料采用t检验进行统计。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 确定正常小鼠MED
观察3种不同剂量(70、84、96 mJ/cm2)的NB-UVB照射C57BL/6小鼠24 h后颈背部皮肤变化，可发现： 70 mJ/cm2 NB-UVB照射24 h后，小鼠颈背部皮肤无明显改变；84 mJ/cm2 NB-UVB照射24 h后，小鼠颈背部皮肤可见轻度红斑及脱屑；H-E染色提示表皮轻度增厚；胶原方向改变，呈毛玻璃样；真皮轻度水肿；96 mJ/cm2NB-UVB照射24 h后，小鼠颈背部皮肤可见红斑及脱屑；H-E染色提示表皮增厚；真皮轻度水肿(图1)。由此可确定窄谱中波紫外线对于正常8～12周龄C57BL/6小鼠颈背部皮肤MED约为84 mJ/cm2。
图1 3种不同剂量NB-UVB照射小鼠颈背部皮肤24 h后变化
Fig.1 Changes in the dorsal neck skin of mice irradiated with three different doses of NB-UVB after 24 h
A： 照射24 h前后大体对比图片；B： 照射24 h前后组织病理对比图片；每组动物为3只，共9只小鼠
2.2 建立ACD慢性瘙痒小鼠模型
与之前的研究[9，14]类似，在11 d内反复涂抹0.15% DNFB丙酮溶液(图2A)可成功建立ACD慢性瘙痒小鼠模型。与对照组相比，从造模结束后第1天开始，实验组出现剧烈的自发搔抓行为，且可持续至3周(图2B)。从大体上看，在造模成功后第3天，实验组小鼠颈背部皮肤出现红斑、结痂、渗出等炎症性改变；在造模成功后第15天，实验组小鼠颈背部皮肤炎症性改变有所缓解，可见瘢痕、鳞屑等慢性改变。
图2 ACD模型小鼠局部皮肤外观及瘙痒行为的改变
Fig.2 Changes in the appearance of the local skin and scratching behavior after the ACD model successfully established
A： ACD造模流程图；B： ACD造模实验组和对照组瘙痒行为对比图；C： ACD造模实验组和对照组颈背部皮肤大体皮损改变对比图；每组动物为7只，共14只小鼠；***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05
2.3 窄谱中波紫外线对于ACD小鼠皮损及瘙痒行为的影响
正常8～12周龄C57BL/6小鼠颈背部皮肤NB-UVB-MED约为84 mJ/cm2(图1)。为防止红斑反应加剧皮损部位的炎症，本实验选取NB-UVB-MED的70%对模型组进行干预，与临床实际应用相适应[4]。分别用0、56、70 mJ/cm2能量NB-UVB照射模型组小鼠颈背部的皮肤，结果发现： 与对照组相比，56 mJ/cm2能量NB-UVB照射可于第13、15天缓解模型组小鼠的瘙痒行为(图3B)；与对照组相比，70 mJ/cm2能量NB-UVB照射可于第3、5、7、9、11、13、15天缓解模型组小鼠的瘙痒行为(图3B)；肉眼观，70 mJ/cm2组在第3天明显缓解小鼠炎症反应(图3C)。
图3 不同剂量NB-UVB对模型组小鼠局部皮肤与瘙痒行为的影响
Fig.3 Effects of different doses of NB-UVB on local skin and scratching behavior of ACD mice
A： NB-UVB干预流程图；B： NB-UVB干预实验组和对照组瘙痒行为对比图；C： 70 mJ/cm2NB-UVB干预实验组和对照组颈背部皮肤大体皮损改变对比图；每组动物为8只，共16只小鼠；56 mJ/cm2与0 mJ/cm2相比，*P<0.05； 70 mJ/cm2与0 mJ/cm2相比，#P<0.05
2.4 窄谱中波紫外线缓解慢性瘙痒的机制
采用qPCR和ELISA方法对NB-UVB干预实验组与对照组进行分子水平的分析，结果发现： 70 mJ/cm2能量NB-UVB干预组皮肤中IL-10的含量显著上升(图4A)；70 mJ/cm2能量NB-UVB干预组皮肤中组氨酸脱羧酶的mRNA含量显著下降(图4B)。
图4 NB-UVB干预组小鼠局部皮肤中IL-10及HDC含量的变化
Fig.4 Changes of IL-10 and HDC content in local skin of ACD mice after NB-UVB intervention
A： 70 mJ/cm2 NB-UVB干预组与对照组皮肤中IL-10含量的比较，每组4只小鼠，共8只小鼠；B： 70 mJ/cm2 NB-UVB干预组与对照组皮肤中组氨酸脱羧酶的mRNA含量的比较，每组9只小鼠，共18只小鼠；**P<0.01
3 讨 论
本研究通过动物实验证实了NB-UVB对于DNFB诱导的慢性瘙痒的缓解作用。此模型经常被应用于慢性瘙痒的研究[15-16]，常被认为是特异性皮炎[17]或者ACD[18]小鼠模型。DNFB作为一种半抗原，可诱导皮肤产生迟发型超敏反应，引发皮肤炎症。在皮肤水平，多种细胞、致炎物质、细胞因子、趋化因子等参与了慢性瘙痒的形成[19]。有研究表明，组胺依赖的瘙痒和非组胺依赖的瘙痒均参与了DNFB诱导的慢性瘙痒的形成[16]。也有研究提示DNFB诱导的慢性瘙痒小鼠皮肤内可被P物质和降钙素基因相关肽标记的肽能神经纤维的数量显著增加[15]。
在特定光源及距离下，使照射部位产生肉眼可见红斑的最小照射光剂量称为MED[20]。通过大体观察及H-E病理分析可初步确定窄谱中波紫外线对于正常8～12周龄C57BL/6雄性小鼠颈背部皮肤MED约为84 mJ/cm2，这与朱彦君[21]等的研究结果相近。临床上，在使用窄谱中波紫外线治疗之前，常常需要测量个体的窄谱中波紫外线MED，以了解个体对光疗的耐受程度及确定治疗的初始剂量，避免因紫外线能量过大造成的不必要的损害。
组胺是常见的致痒物质，由肥大细胞脱颗粒后，释放到组织中，并发挥作用，引起组胺依赖的瘙痒。组胺与外周神经纤维上1型和4型组胺受体相结合，产生动作电位，传递瘙痒感觉。组氨酸脱羧酶是组胺合成的关键酶，其mRNA含量可间接反应组织中组胺的含量[13]。IL-10主要由Th2型细胞分泌，可抑制Th1型细胞，抑制免疫反应，抑制炎症。有研究表明在接触性皮炎的慢性瘙痒可能与皮损中IL-10的含量负相关[22]。
当应用70 mJ/cm2剂量的NB-UVB对DNFB诱导的慢性瘙痒模型进行干预时，可在第3、5、7、9、11、13、15天观察到小鼠瘙痒行为显著减少，皮肤炎症明显减轻。可能机制是NB-UVB抑制了肥大细胞的脱颗粒，减少了致痒物质组胺的产生，且NB-UVB促进Th2型免疫细胞释放IL-10，抑制局部炎症，进而减轻了瘙痒。
在临床上，NB-UVB已被用于慢性瘙痒的管理，但关于其机制研究较少。使用NB-UVB治疗时，特定能量的紫外光被直接用于照射皮损部位，进而达到改善皮损、缓解瘙痒的治疗效果。因此，猜测NB-UVB的作用部位可能主要位于外周。瘙痒的产生依赖于外周多种因素对于外周神经纤维的刺激。瘙痒的传递依赖于抗原提呈细胞对于抗原的提呈作用；依赖于局部皮损中组胺的浓度及不同类型组胺受体的分布；依赖于多种细胞因子、神经营养因子、趋化因子形成的信息传递网络；也依赖于外周神经形态及分布密度。NB-UVB可能通过多条途径缓解慢性瘙痒症状。
[1] PATEL K N, DONG X. Itch： cells, molecules, and circuits[J]. ACS Chem Neurosci, 2011,2(1)： 17-25.
[2] WEISS M, METTANG T, TSCHULENA U, et al. Prevalence of chronic itch and associated factors in haemodialysis patients： a representative cross-sectional study[J]. Acta Derm Venereol, 2015,95(7)： 816-821.
[3] 陶琼,戴光辉,熊敏学.窄谱中波紫外线联合卡泊三醇治疗稳定期白癜风疗效分析[J]. 中国美容医学, 2015,24(21)： 44-46.
[4] 唐艳,梁虹.NB-UVB不同照射方案治疗中重度银屑病疗效比较[J].现代仪器与医疗,2017,23(1)： 70-72.
[5] LE P, TU J, GEBAUER K, et al. Serum 25-hydro-xyvitamin D increases with NB-UVB and UVA/UVB phototherapy in patients with psoriasis and atopic dermatitis in Western Australia[J]. Australas J Dermatol, 2016,57(2)： 115-121.
[6] YE J Z, HUANG H, LUO G Y, et al. NB-UVB irradiation attenuates inflammatory response in psoriasis[J]. Dermatol Ther, 2020,33(4)： e13626.
[7] WEISSHAAR E, SZEPIETOWSKI J C, DALGARD F J, et al. European S2k guideline on chronic pruritus[J]. Acta Derm Venereol, 2019,99(5)： 469-506.
[8] 王先文,吴晓红,莫家亮.窄谱中波紫外线治疗冬季瘙痒病的临床疗效观察[J].临床皮肤科杂志,2016,45(5)： 390-391.
[9] HUANG K, HU D D, BAI D, et al. Persistent extracellular signal-regulated kinase activation by the histamine H4 receptor in spinal neurons underlies chronic itch[J]. J Invest Dermatol, 2018,138(8)： 1843-1850.
[10] ZHANG L, JIANG G Y, SONG N J, et al. Extracellular signal-regulated kinase(ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord[J]. Mol Brain, 2014,7： 25.
[11] SHIMADA S G, LAMOTTE R H. Behavioral differentiation between itch and pain in mouse[J]. Pain, 2008,139(3)： 681-687.
[12] WANG T T, XU X Y, LIN W, et al. Activation of different heterodimers of TLR2 distinctly mediates pain and itch[J]. Neuroscience, 2020,429： 245-255.
[13] SAKAI K, SANDERS K M, YOUSSEF M R, et al. Mouse model of imiquimod-induced psoriatic itch[J]. Pain, 2016,157(11)： 2536-2543.
[14] CHEN X, ZHU C, ZHANG Y G, et al. Antipruritic effect of ethyl acetate extract from Fructus cnidii in mice with 2, 4-dinitrofluorobenzene-induced atopic dermatitis[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2020,2020： 6981386.
[15] SCHÜTTENHELM B N, DURAKU L S, DIJKSTRA J F, et al. Differential changes in the peptidergic and the non-peptidergic skin innervation in rat models for inflammation, dry skin itch, and dermatitis[J]. J Invest Dermatol, 2015,135(8)： 2049-2057.
[16] LIU X T, WANG D, WEN Y H, et al. Spinal GRPR and NPRA contribute to chronic itch in a murine model of allergic contact dermatitis[J]. J Invest Dermatol, 2020,140(9)： 1856-1866.e7.
[17] TIAN T, CHANG H, HE K, et al. Fucoidan from seaweed Fucus vesiculosus inhibits 2, 4-dinitrochlorobenzene-induced atopic dermatitis[J]. Int Immunopharmacol, 2019,75： 105823.
[18] JIN Z W, KIM H K, LEE C H, et al. Glutamine suppresses dinitrophenol fluorobenzene-induced allergic contact dermatitis and itching： inhibition of contact dermatitis by glutamine[J]. J Dermatol Sci, 2012,67(2)： 88-94.
[19] DONG X T, DONG X Z. Peripheral and central mechanisms of itch[J]. Neuron, 2018, 98(3)： 482-494.
[20] HECKMAN C J, CHANDLER R, KLOSS J D, et al. Minimal erythema dose(MED) testing[J]. J Vis Exp, 2013(75)： e50175.
[21] 朱彦君,孟宇宏,冯光珍,等.紫外线照射后无毛鼠皮肤纹理的变化及其定量分析[J].中华医学美学美容杂志,2005(6)： 358-360.
[22] INAN S, TORRES-HUERTA A, JENSEN L E, et al. Nalbuphine, a kappa opioid receptor agonist and mu opioid receptor antagonist attenuates pruritus, decreases IL-31, and increases IL-10 in mice with contact dermatitis[J]. Eur J Pharmacol, 2019,864： 172702.