·基础研究·

基于生物信息学分析的TPX2在肺腺癌中的表达及意义

王庆亮,赵艳峰,蒋 燕,宋 晓,杨富钧,姜格宁

(同济大学附属上海市肺科医院胸外科,上海 200433)

【摘要】 目的 利用多种肿瘤生物信息数据库分析TPX2在肺腺癌样本中的表达及临床意义,并在临床病理标本中进行验证。方法 通过检索Oncomine生物信息基因数据库,分析TPX2在不同肺腺癌数据集中mRNA表达情况;利用cBioportal生物信息基因数据库分析TPX2的突变频率、突变位点,并分析TPX2基因突变与预后的关系;利用HPA数据库的组织图谱分析TPX2蛋白质在肺腺癌组织中的表达情况。通过UALCAN和OncoLnc数据库检索肺腺癌与正常组织中TPX2的表达情况,分析其与肺腺癌临床病理分期的关系,并采用Kaplan-Meier在线分析TPX2表达与患者生存期的关系。通过Western印迹法实验对比肺癌患者癌组织与癌旁组织TPX2蛋白表达差异以及TPX2在不同肺癌细胞系中的表达情况。结果 Oncomine数据库的结果显示,TPX2在人肺腺癌不同数据集中的表达均显著高于正常肺组织(均P<0.001),HPA数据库检索IHC实验结果显示:与正常肺组织相比,TPX2蛋白在癌组织中的表达水平显著上调(P<0.05)。生存分析发现高表达TPX2的肺腺癌患者的生存期显著低于TPX2低表达的肺腺癌患者,TPX2高表达患者预后更差(P<0.05);cBioportal数据库分析结果显示,TPX2共有30个位点发生变异,总变异率为4%,其中有17个位点发生突变,突变频率分别为4.06%(TCGA PanCan),3.83%(Broad),且存在TPX2突变的肺腺癌患者的DFS更差(P<0.05)。在探讨TPX2在不同肺癌细胞系及肺腺癌组织和癌旁组织中的表达差异时,发现TPX2在肺鳞癌、肺腺癌、肺大细胞癌细胞系中均存在高表达,且TPX2在肺腺癌组织中的表达量显著高于癌旁组织(均P<0.05)。结论 基于肿瘤生物信息库综合分析发现,TPX2在肺腺癌组织中的表达水平明显高于正常肺组织,且TPX2的其表达水平与肿瘤预后具有相关性,TPX2在肺腺癌中的高表达预示患者预后不良。

【关键词】 TPX2;肺腺癌;生物信息学;预后

目前肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,其中肺腺癌是最常见的一种病理类型[1]。随着人们对生物信息学、肿瘤基因组学的研究日益深入,基因靶向治疗用于治疗肺癌已成世界研究热点,寻找肿瘤细胞相关的关键调控基因已经成为攻克癌症的重要方向,具有重要的临床潜在利用价值[2]

TPX2是由Wittmann等[3]于1998年首次在非洲爪蟾蜍卵发现的一种新型微管相关蛋白,被命名为XKlP2靶蛋白(targeting protein for xenopus kinesin-like protein 2,TPX2)。该基因参与有丝分裂过程中中心体的成熟和纺锤体的形成[4]。研究发现,TPX2在许多癌症的组织中高表达[5-7]。但是TPX2在肺腺癌的研究中相关研究报道较少。本研究利用Oncomine、cBioportal、UALCAN、GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)、Kaplan-Meier Plotter以及OncoLnc数据库分析TPX2在肺腺癌中的表达和预后关系,以期为肺腺癌基因靶向治疗提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 Oncomine数据库

Oncomine数据库[8](https:∥www.oncomine.org/)是在线肿瘤微阵列数据库,用于确定肺腺癌中TPX2的转录水平。评估TPX2基因在肺腺癌中的共表达谱并显示为热图。提前使用邮箱注册Oncomine数据库账号,获取使用权限,随后根据研究需要,设定具体筛选的条件。本研究具体筛选条件如下。(1) gene条目:输入TPX2;(2) cancer type条目:选择Cancer vs Normal Analysis;(3) Cancer Type条目:选择Lung Cancer;(4) Analysis Type条目,P-VALUE设定0.0001,FOLD CHANGE=2,GENE RANK=10%;然后对数据库进行检索分析。

1.2 HPA数据库

人类蛋白质图谱(Human Protein Atlas),简称HPA数据库[9](https:∥www.proteinatlas.org/),是一个综合性人类蛋白质组学门户网站。使用26000多种高度特异性的抗体,采用免疫检测技术(免疫印迹、免疫荧光和免疫组化),详细地检测了每种蛋白在76种细胞系、44种人类正常组织和17种肿瘤组织中的表达情况,该数据库提供了17000多种人类蛋白质在组织和细胞及血液中的分布信息。

1.3 UALCAN数据库

UALCAN网站[10](http:∥UALCAN.path.uab.edu/index.html)是一种交互式门户网站,网站数据主要来源是癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库。可以使用该数据库分析基因在肿瘤和正常样本中的差异性表达,同时可以比较不同肿瘤亚组临床病例特征,如肿瘤分期、病理亚型、肿瘤分子亚型、患者年龄、体重、吸烟史和种族等与基因表达的相关性,在本研究中使用该数据库分析TPX2 mRNA和肺腺癌患者临床病理特征的相关性。

1.4 cBioPortal数据库

cBio Cancer Genomics Portal数据库[11]提供了研究分析癌症相关基因数据的可视化工具,cBioPortal包含了多个数据库,比如TCGA数据库和国际癌症基因组联盟(International Cancer Genome Consortium,ICGC)等共283项大型肿瘤相关基因表达和蛋白质组学的研究。cBioPortal可以通过可视化的形式展示癌症研究样本的基因组数据。登陆cBioPortal官网(http:∥www.cbioportal.org/),在数据库检索界面输入具体筛选条件如下。(1) Select Studies条目:选择Lung Cancer;(2) Lung Adenocarcinoma:选择Broad数据库(Cell 2012,183例样本)、MSKCC数据库(Science 2015,35例样本)、TCGA(PanCancer Atlas,566例样本)、TSP(Nature,163例样本)、MSKCC数据库(Cancer Discov 2017,915例样本),共5个数据集被纳入;(3) Select Molecular Profiles条目:勾选Mutation和Copy Number Alterations选项;(4) Enter Gene:输入TPX2,提交检索。

1.5 Kaplan-Meier Plotter数据库

Kaplan-Meier Plotter在线生存分析数据库[12](网址http:∥kmplot.com)是根据已发布的微阵列的肿瘤相关数据库使用20多类癌症相关样本评估54000 多个基因对生存的影响的数据集,其中最大的数据集包括乳腺癌(6234例),卵巢癌(2190例),肺癌(3452 例)和胃癌(1440例)样本。该数据库的基因芯片和RNA序列数据来源包括GEO、EGA和TCGA数据库。本研究使用该数据库分析了TPX2 mRNA表达和肺腺癌患者预后之间的关系。

1.6 OncoLnc数据库

OncoLnc网站[13](http:∥www.oncolnc.org/)是一种基于TCGA肿瘤数据库交互式分析基因(mRNA,miRNA或lncRNA)表达和总共21种常见癌症的生存相关性的在线工具,使用该网站再次验证TPX2基因mRNA表达与患者预后的相关性。

1.7 肺癌细胞株和肺腺癌组织标本

肺癌细胞系由本实验室提供。20例肺腺癌组织级配对癌旁组织样本取自本院胸外科,患者的病理信息包含年龄、性别、病理类型、TNM分期、生存状态及总生存时间(overall survival time,OS)。肿瘤组织经过了两名以上的病理学专家进行重新阅片确定。本项目涉及的患者签署了知情同意书,且项目已通过伦理委员会批准。

1.8 主要试剂

胎牛血清、DMEM购自美国Thermo Fisher Scientific公司;β-actin抗体购自美国Sigma公司;TPX2抗体购自英国Abcam公司,SDS-PAGE凝胶试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.9 Western印迹法

用PBS洗涤培养的肺癌细胞3次,加入RIPA细胞裂解液,置于冰上30min,然后转移至新的EP试管中,离心(离心半径20cm,1000r/min,10min)。取上清液并使用BCA蛋白检测试剂盒中检测总蛋白质。加入50μL按比例配制好的巯基乙醇同上样缓冲液的混合液,并100℃水浴锅中加热10min。取10μg蛋白用于SDS-PAGE电泳,然后将蛋白质转移到PVDF膜上。使用5%脱脂奶粉在室温下密封1h,加入一抗(1∶1500),在4℃的振荡器中孵育晚上,TBST洗膜3次后,加二抗(1∶5000),室温封闭1h,继续用TBST清洗膜3次,并使用化学发光成像分析仪分析条带。

1.10 统计学处理

应用SPSS.25统计学软件进行数据分析。各计量资料进行正态性检验,非正态分布数据采用对数转换后符合正态分布,计量资料采用表示。两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Oncomine数据库分析TPX2 mRNA在肺腺癌和癌旁组织的差异表达

本研究检索Oncomine数据库中的数据集TPX2在肺腺癌组织及正常组织中的mRNA水平表达进行了分析。结果显示,共有8项数据集,每项研究的差异比较见图1。

图1 TPX2 mRNA在Oncomine数据库不同数据集中肺腺癌和正常组织中表达对比
Fig.1 Comparison of TPX2 mRNA expression in lung adenocarcinoma and normal tissues in different data sets of Oncomine database

同时对8项数据集检索分析发现,在每一项研究中,肺腺癌组织中的TPX2的mRNA表达水平均要显著高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.01),见图2。

图2 TPX2 mRNA在Oncomine数据库中表达水平分析
Fig.2 TPX2 mRNA expression level analysis in Oncomine database
1~8分别代表8项不同肺腺癌的研究数据集,红色代表过表达,蓝色代表低表达

2.2 TPX2在肺腺癌中的蛋白质表达情况分析

使用HPA数据库的组织图谱分析TPX2蛋白质在肺腺癌组织中的表达情况。通过基因芯片分析,结果显示TPX2在肺腺癌细胞的细胞核中表达。通过芯片结果分析TPX2在肺腺癌组织中表达情况,见图3。

图3 TPX2蛋白在正常肺组织及肺腺癌组织表达的免疫组织化学图像
Fig.3 Immunohistochemical image of TPX2 protein expression in normal lung tissue and lung adenocarcinoma tissue

2.3 TPX2表达与肺腺癌患者的临床特征分析

运用UALCAN数据库验证TPX2 mRNA在TCGA数据的肺腺癌组织(n=515)及正常肺组织(n=59)中的表达情况。分析显示:相较于正常肺组织,TPX2在肺腺癌组织中的表达显著升高,差异具有统计学意义(P<0.001),见图4A;同时TPX2 mRNA在女性中表达高于男性,差异具有统计学意义(P<0.05),见图4B;但TPX2的表达水平与肿瘤分期、年龄无显著相关性,见图4C、D。

图4 TPX2 mRNA表达与肺腺癌患者临床特征关系
Fig.4 Relationship between TPX2 mRNA expression and clinical features of patients with lung adenocarcinoma

2.4 TPX2高表达和肺腺癌患者的预后相关

为了分析TPX2与肺腺癌患者预后的关系,利用OncoLnc数据库对TPX2对肺腺癌患者预后的影响进行探索,发现TPX2高表达不利于肺腺癌患者预后(图5A)并利用Kaplan-Meier Plotter在线生存分析进行了验证。通过Kaplan-Meier Plotter分析发现TPX2与肺腺癌OS(HR=1.8),FPS(HR=2.82),PPS(HR=1.63)均具有相关性,且差异均具有统计学意义(均P<0.05),见图5B~D。

图5 TPX2 mRNA表达与肺腺癌预后关系
Fig.5 Relationship between the expression of TPX2 mRNA and the prognosis of Lung adenocarcinoma
A:OncoLnc数据库;B~D:Kaplan-Meier Plotter数据库;OS:总生存时间;PPS:进展后生存期;FPS:无进展生存期

2.5 TPX2基因在肺腺癌中的突变信息

通过检索cBioPortal肿瘤数据库网站对5个数据集中的1807个样本进行分析后,发现共有30个样本中发生改变,总体变异率为4%,其中有16个非同义突变,TPX2拷贝数扩增有13个样本,1例为混合变异(图6A)。说明TPX2基因在肺腺癌中突变频率很低。除了突变频率较低外,在肺腺癌中突变的另一个特征是突变位点分布较广泛,突变位点图如图6B所示。随后分析了TPX2基因突变和肺腺癌患者预后关系,结果发现TPX2基因突变对肺腺癌OS无显著影响(P>0.05),见图6C,但存在TPX2突变的肺腺癌患者比无TPX2突变患者的DFS更差,差异具有统计学意义(P<0.05),见图6D。

图6 TPX2基因突变频率及和肺腺癌预后关系
Fig.6 Relationship between the gene mutation frequency of TPX2 and the prognosis of Lung adenocarcinoma

2.6 TPX2在不同肺癌细胞的表达差异

使用Western印迹法法检测了TPX2蛋白在A549、H1650、H1299、Y82、L78、H460肺癌细胞系中检测表达水平,结果见图7。

图7 Western印迹法实验检测TPX2在肺癌不同细胞系中的表达水平
Fig.7 Western blotting experiment to detect the expression level of TPX2 in different lung cancer cell lines

通过Image J软件对Western印迹法图像进行分析,实验结果发现在腺癌A549、H1650、H1299细胞系,鳞癌Y82、L78细胞系,大细胞癌H460细胞系中,TPX2的表达水平较高,在腺癌H1975细胞系和鳞癌H1703细胞系中TPX2的表达水平较低。相对表达量对比分析见图8。

图8 TPX2蛋白在肺癌不同细胞系中的相对表达量
Fig.8 The relative expression of TPX2 protein in different lung cancer cell lines

2.7 TPX2在肺腺癌组织标本中表达情况

在配对肺腺癌组织和癌旁组织中利用Western印迹法检测TPX2的蛋白表达水平。发现在20例样本检测中,其中有15例样本中,TPX2在肺腺癌中的表达量显著高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05),见图9。

图9 TPX2蛋白在肺腺癌组织的表达情况
Fig.9 Expression of TPX2 protein in lung adenocarcinoma
A:Western印迹法检测TPX2在肺腺癌组织和癌旁组织中的表达水平;B:TPX2蛋白表达情况;肺癌组和正常肺组比较,*P<0.05;N:癌旁组织;T:癌组织

3 讨 论

肺癌是目前全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一[14]。在我国,肺癌亦是如此,最新统计数据显示我国2015年新发肺癌78.7万人,约占全部癌症新发人数的24.7%;新增肺癌死亡63.1万,约占全部癌症死亡人数的29.3%,其中男性多于女性[5]。吸烟、二手烟暴露和空气污染是已确定的肺癌危险因素[15]。目前肺癌的治疗仍然以手术治疗为主,其次为化疗、放射治疗、免疫治疗和中医中药治疗及联合治疗。手术治疗适用于中早期的肿瘤患者,对晚期患者手术治疗效果有限,甚至会导致病情恶化。由于肺癌早起症状并不明显,很多患者因此错过最佳诊断和手术治疗时机[16]。近年来,肺癌靶向基因治疗和以PD-1或PD-L1抑制剂为主要代表的免疫治疗,在晚期肺癌治疗中,起到了重要作用,但由于有效人群较少,肿瘤容易产生耐药性,且费用高昂,治疗较难普及[17-18]

TPX2是XKLP靶蛋白,位于细胞核内,定位于人类染色体20q11.2,受细胞周期严格调控。TPX2是最早发现于爪蟾的微管相关蛋白,与人类功能蛋白具有高度同源性,相对分子质量为100000,是XKLP2 COOH末端区域结合在微管上的媒介,参与细胞有丝分裂过程中微管形成及纺锤体功能[4]。研究发现,TPX2在许多癌症的组织及血清中高表达,如乳腺癌、皮肤鳞状细胞癌、前列腺癌、黑色素瘤等[19-22]。Zou等[23]研究发现,TPX2水平与胆管癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化相关。Chen等[24]的研究发现,microRNA-1294通过直接靶向TPX2抑制神经胶质瘤增殖并增强其对替莫唑胺的化学敏感性。Ma等[25]研究发现,卵巢癌2种细胞株中TPX2与PLK1存在共表达情况,敲低TPX2可抑制PLK1表达,并导致细胞增殖及迁移能力减弱。Yao等[22]通过RT-qPCR和Western印迹法检测TPX2基因在黑素瘤细胞系中的表达,结果显示其显著增高。TPX2可以促进黑色素瘤细胞的增殖,并在裸鼠荷瘤实验中得到了证实。Tomii等[5]对胃癌患者使用免疫组织化学染色和荧光实时定量反转录PCR分析了胃癌肿瘤和邻近的正常组织中的RNA(mRNA)和蛋白表达情况。结果胃癌组织中TPX2的mRNA水平显著高于匹配的邻近正常组织,且TPX2过表达与年龄、组织学类型、肿瘤深度、淋巴结转移、分期和远处转移或复发呈正相关。Glaser等[26]发现,TPX2在子宫内膜癌中高表达,与患者的淋巴结转移,预后和复发密切相关。Ma等[24]研究发现,卵巢癌2种细胞株中TPX2与PLK1存在共表达情况,敲低TPX2可抑制PLK1表达,并导致细胞增殖及迁移能力减弱,TPX2可通过调节OC细胞中的PLK1/Cdc2/CyclinB信号转导通路促进细胞增殖,还可以通过调节OC细胞中的PLK1/β-catenin/MMPs信号转导来促进细胞迁移。Feng等[20]证明在过表达miR-216b可以通过激活p53信号通路并降低TPX2基因表达,能够抑制cSCC细胞的增殖、入侵和迁移,并促进细胞凋亡。

研究表明,多基因的异常表达在肺癌的发生发展中发挥了重要作用,如p53基因,PTEN基因,Rb基因和myc基因家族[27-30]。因此,找到合适的靶目标来控制肿瘤细胞的增殖、迁移对于肺癌的预防和治疗极为重要。本课题组通过对多种肿瘤相关数据库分析,本研究基于生物学方法检索了Oncomine、HPA、cBioportal以及TCGA等数据库,综合分析了TPX2基因和肺腺癌的关系。本研究首先检索Oncomine数据库分析肺腺癌中TPX2与肺腺癌的关系,结果发现TPX2在人肺腺癌不同数据集中的表达均显著高于正常肺组织,差异均具有统计学意义。采用Kaplan-Meier Plotter分析TCGA数据库中TPX2表达与患者生存期的关系,结果发现,高表达TPX2肺腺癌患者的生存期显著低于TPX2低表达肺腺癌患者,高表达患者预后更差;差异具有统计学意义。随后通过检索c Bioportal生物信息基因数据库,分析TPX2的突变频率、突变位点,发现TPX2在2项数据集存在突变,突变频率分别为4.06%(TCGA PanCan)和3.83%(Broad),同时研究显示TPX2共有17个位点发生突变,提示TPX2与肺腺癌发生、发展密切相关。TPX2蛋白在肺腺癌患者临床组织里高表达,并且TPX2蛋白的表达量可用来监测肺腺癌复发和预后的标志,TPX2基因可能作为未来肺腺癌患者基因治疗的潜在靶点。

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Expression of TPX2 in lung adenocarcinoma and its clinical significance analyzed with bioinformatics

WANG Qing-liang,ZHAO Yan-feng,JIANG Yan,SONG Xiao,YANG Fu-jun,JIANG Ge-ning

(Dept.of Thoracic Surgery,Shanghai Pulmonary Hospital,Tongji University School of Medicine,Shanghai 200433,China)

【Abstract】 Objective To analyze the expression of TPX2 in lung adenocarcinoma and its clinical significance with bioinformatics.Methods The mRNA expression of TPX2 in different lung adenocarcinoma data sets was analyzed by searching Oncomine bioinformatics gene database;the mutation frequency and mutation site of TPX2 and its correlation with patients’ prognosis were analyzed using cBioportal bioinformatics gene database;the protein expression of TPX2 in lung adenocarcinoma tissue was analyzed using HPA tissue protein expression profiles database;the expression of TPX2 in lung adenocarcinoma and normal tissues was retrieved from UALCAN and Oncolnc databases,and the relationship between TPX2 expression and different clinicopathological stage of lung adenocarcinoma was analyzed;the relationship between TPX2 expression and patient survival time was analyzed by the Kaplan-Meier Plotter method;the protein expression of TPX2 in the tumor tissues and non-tumor adjacent tissues was examined by Western blotting;the protein expression of TPX2 in different lung cancer cell lines was measured using Western blotting.Results The Oncomine dataset analysis showed that the expression of TPX2 in different data sets of human lung adenocarcinoma was significantly higher than that in normal lung tissues (all P<0.001).The IHC data retrieved from HPA dataset demonstrated that the protein expression level of TPX2 in lung adenocarcinoma tissues was significantly higher than that in normal lung tissues.Survival analysis showed that the survival time of lung adenocarcinoma patients with high TPX2 expression was significantly lower than that of patients with low TPX2 expression,and the prognosis of patients with high TPX2 expression was worse (P<0.05).The cBioportal dataset analysis showed that there were 30 sequence variation sites in TPX2 gene,with a total variation rate of 4%,in which 17 sites were mutated,with mutation frequency of 4.06%(TCGA PanCan) and 3.83%(Broad),respectively.Furthermore,patients with lung adenocarcinoma with TPX2 mutation had worse DFS (P<0.05).The validation data demonstrated that TPX2 was highly expressed in lung squamous cell carcinoma,lung adenocarcinoma and lung large cell carcinoma cell lines,and the expression level of TPX2 in lung adenocarcinoma tissues was significantly higher than that in non-tumor adjacent tissues.Conclusion The expression level of TPX2 in lung adenocarcinoma tissue is significantly higher than that in normal lung tissue,and the expression level of TPX2 is correlated with prognosis of patients.The high TPX2 expression in lung adenocarcinoma indicates poor prognosis in patients with lung adenocarcinoma.

【Key words】 TPX2;lung adenocarcinoma;bioinformatics;prognosis

【中图分类号】 R734.2

【文献标志码】 A

【文章编号】 1008-0392(2021)01-0011-08

doi:10.12289/j.issn.1008-0392.20236

收稿日期:2020-05-26

作者简介:王庆亮(1990—),男,硕士研究生.E-mail:wangql_2017@163.com

通信作者:姜格宁.E-mail:jgnwp@aliyiun.com