·基础研究·

黄芪汤对肾脏集合管上皮钠离子通道的调控机制

陈骏良1, 池杨峰1, 宁凤玲2, 王 利1, 吴晓涵1, 臧赢君1,陈 静1, 张雪梅2, 王 浩1

(1. 上海中医药大学附属普陀医院肾脏内科,上海 200062; 2. 复旦大学药学院,上海 201203)

【摘要】 目的 研究肾病综合征(nephrotic syndrome, NS)水肿的中药良方黄芪汤对肾脏集合管上皮钠离子通道(epithelial sodium channel, ENaC)的调控效应和作用机制。方法 对小鼠肾脏集合管M-1细胞进行黄芪汤药物干预,并利用短发夹RNA敲减其腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)的表达。通过Western印迹法、免疫共沉淀等方法研究黄芪汤对ENaC表达量的调控效应和AMPK/Nedd4-2/泛素化通路在其中的作用机制。结果 黄芪汤可显著提升M-1细胞AMPK和Nedd4-2的磷酸化激活水平,增强ENaC与Nedd4-2的结合作用和ENaC的泛素化水平,并下调ENaC膜表达的绝对量和相对比例;AMPK敲减后,黄芪汤对Nedd4-2和ENaC的上述作用显著减弱。结论 黄芪汤可激活肾脏集合管上皮细胞的AMPK/Nedd4-2/泛素化通路,下调ENaC膜表达水平,从而抑制其活性。该方改善NS水肿的药理机制可能与此有关。

【关键词】 黄芪汤; 腺苷酸激活蛋白激酶; 上皮钠离子通道; 肾病综合征

水肿是肾病综合征(nephrotic syndrome, NS)的常见临床表现,近年来研究认为肾脏集合管上皮钠离子通道(epithelial sodium channel, ENaC)激活所致原发性钠潴留是引起NS水肿的重要致病机制[1-3]。ENaC由α、β、γ 3个亚基组成,其在集合管顶膜上的表达量是决定通道活性的重要因素,并与腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)密切相关[4]。AMPK可使泛素连接酶Nedd4-2发生磷酸化,增强其与ENaC间的结合作用,促使ENaC发生泛素化并被细胞内吞降解,最终导致ENaC膜表达量下降,该AMPK/Nedd4-2/泛素化通路是调控ENaC活性的重要机制[5-7]

传统中医理论认为水肿的形成与正气不足、气水失运有关,益气扶正是水肿的重要治法。黄芪汤始载于北宋《仁斋直指方论》,由黄芪、茯苓、麦门冬、五味子、生地黄、瓜蒌根和炙甘草七味药组成,有益气养阴、扶正祛邪之效,本课题组在临床实践中发现该方可有效改善NS水肿,但其现代药理学机制尚不明确。根据既往研究基础[8-11],推测黄芪汤对NS水肿的治疗机制可能在于其可激活AMPK/Nedd4-2/泛素化通路,从而抑制ENaC活性,减轻水钠潴留。基于该科学假设,本课题组研究了黄芪汤对小鼠肾皮质集合管上皮细胞(M-1细胞)ENaC的干预作用及AMPK/Nedd4-2/泛素化通路在其中的调控效应,初步阐明了黄芪汤利水作用的药理机制,为改善NS水肿的临床疗效提供了研究基础和启示。

1 材料与方法

1.1 黄芪汤提取物的制备

黄芪汤方剂组成(g): 黄芪20、茯苓20、麦门冬20、五味子10、生地黄30、瓜蒌根20和炙甘草10。加4倍量水,热回流提取2h后过滤,挤干滤渣内水分,再重复上述流程2次。合并所有提取液,减压浓缩为稠浸膏,以95%乙醇调节含醇量为70%,静置过夜。吸取上清液,105℃减压干燥48h,得黄芪汤干粉提取物。称取适量经涡旋、超声和水浴后充分溶解于细胞培养基中,经0.22μm滤器过滤并配制成所需浓度的溶液,4℃保存备用。

1.2 试剂与仪器

M-1细胞购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC);人胚肾293T细胞购自中国中乔新舟公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;地塞米松、抗ENaCβ抗体购自美国Sigma公司;DMEM/F12购自上海源培生物科技股份有限公司;聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)购自美国Polysciences公司;聚凝胺(polybrene)和嘌呤霉素购自上海翊圣生物科技有限公司;细胞膜蛋白提取试剂盒、辣根过氧化物酶标记的小鼠和兔二抗、小鼠非特异性IgG抗体、MG-132购自中国碧云天生物技术有限公司;抗ENaCα抗体购自美国Thermo Fisher公司;抗ENaCγ抗体、抗p-Nedd4-2抗体、抗NaK ATPase抗体、抗泛素抗体购自美国Abcam公司;抗AMPKα1抗体、抗p-AMPKα1抗体购自美国Cell Signaling Technology公司;抗Nedd4-2抗体、Protein A/G琼脂糖珠购自美国Santa Cruz公司;抗α-tubulin抗体购自美国Proteintech公司。

1.3 细胞培养和分组

M-1细胞在37℃、5% CO2饱和湿度环境下复苏、培养、传代于含5%胎牛血清、5μmol/L地塞米松的DMEM/F12中。将细胞分为空白对照组和黄芪汤组,后者予以0.1、0.3或1.0mg/mL 的黄芪汤溶液预孵24h。在研究AMPK的作用机制时,部分M-1细胞预先进行了短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)干扰以抑制AMPK的表达。

1.4 方法

1.4.1 构建AMPK敲减的M-1细胞系 设计合成特异性识别小鼠AMPK-α1基因的shRNA慢病毒质粒。慢病毒载体质粒为pGLV2-U6-puro,shRNA靶标序列如下。shRNA1: 5′-GCACGAGTTGACCGGAC-ATAA-3′;shRNA2: 5′-GCTGTGGCTCACCCAATTA-TG-3′;shRNA3: 5′-GCGTGTACGAAGGAAGAATCC-3′。引物序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。用PEI将shRNA慢病毒质粒(pMD2.G)和辅助包装质粒(psPAX2)共转染至人胚肾293T细胞中,72h后收集培养基上清液,16000×g超滤离心10min以获得慢病毒浓缩液。M-1细胞接种至6孔板中,待细胞融合密度为30%左右,更换为不含血清、青/链霉素的培养基,加入聚凝胺5μg/mL和慢病毒浓缩液20μL/孔,6h 后换液。细胞传代,用嘌呤霉素2μg/mL 筛选,并用Western印迹法验证细胞内AMPK-α1的表达水平,以建立AMPK-α1敲减和阴性对照的稳定细胞株。

1.4.2 Western印迹法 对于细胞质蛋白,用裂解液(1% NP-40,50mmol/L Tris pH 7.4, 1mmol/L EDTA, 150mmol/L NaCl, 50mmol/L NaF, 10mmol/L焦磷酸钠, 10mmol/L甘油磷酸酯)裂解细胞,16000×g离心10min取上清液;用细胞膜蛋白提取试剂盒提取细胞膜蛋白。蛋白定量,加入SDS上样缓冲液,95℃加热5min后上样行SDS-PAGE电泳。电泳完毕后转膜,之后以含5%脱脂牛奶的TBST室温封闭30min。加入抗ENaCα、ENaCβ、ENaCγ、AMPKα1、p-AMPKα1、Nedd4-2、p-Nedd4-2、α-tubulin或NaKATPase等一抗(1∶1000稀释),4℃孵育过夜。TBST洗膜3次,加入辣根过氧化物酶标记的小鼠或兔二抗,室温孵育1h。TBST洗膜3次后以ECL化学发光法显影,用Image LabTM图像采集和分析软件(Bio-Rad,美国)进行成像分析。

1.4.3 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP) Protein A/G琼脂糖珠使用前均经过裂解液预清洗3次。裂解细胞,800×g离心5min取上清液,蛋白定量。各组取1.5mg蛋白,先加入小鼠非特异性IgG抗体和琼脂糖珠,4℃孵育30min以清除非特异性杂蛋白,800×g离心5min取上清液。加入抗Nedd4-2抗体,4℃孵育过夜后加入琼脂糖珠,4℃ 继续孵育2h。800×g离心5min,弃去上清液,用裂解液清洗琼脂糖珠5次,加入SDS上样缓冲液,95℃加热5min 后800×g离心5min取上清液,并以Western印迹法进行ENaC检测。泛素化检测时,细胞培养基中预先加入MG132 10μmol/L以抑制蛋白降解,处理4h后收集细胞,用抗泛素抗体和琼脂糖珠进行Co-IP,余同前述。

1.5 统计学处理

以GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。两组之间采用独立样本t检验,多组之间采用One-way ANOVA单因素方差分析,并根据方差齐性选择Tukey法或Tamhane法进行组间两两比较。P<0.05时为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 黄芪汤可下调ENaC的膜表达水平

随着黄芪汤浓度由0.1mg/mL增至1.0mg/mL,ENaC各亚基的膜表达量呈剂量依赖性下降趋势,其中ENaCα在黄芪汤1.0mg/mL时、ENaCβ在黄芪汤0.3、1.0mg/mL时与空白对照组的差异有统计学意义(P<0.05),见图1A及图1C~E。与膜表达量不同,随着黄芪汤浓度上升,ENaC的全细胞表达量未见同步下降,ENaCα和ENaCβ在部分浓度时反较空白对照组有所升高,差异有统计学意义(P<0.05),见图1B及图1F~H。进一步分析ENaC的膜/全细胞表达比,ENaCα、ENaCβ在黄芪汤各浓度时均显著低于空白对照组,ENaCγ在黄芪汤1.0mg/mL 时也显著低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见图1I~K。上述结果显示,黄芪汤1.0mg/mL对ENaC膜表达水平的下调作用最强,故选定该值作为统一药物浓度进行后续研究。

2.2 黄芪汤促进AMPK和Nedd4-2的磷酸化激活

在上述结果的基础上,推测黄芪汤抑制ENaC膜表达的作用机制可能与其对AMPK/Nedd4-2/泛素化通路的调控效应有关。进一步的检测显示,黄芪汤组的AMPK和Nedd4-2水平与空白对照组的差异无统计学意义,磷酸化AMPK(p-AMPK及其总体占比)和磷酸化Nedd4-2(p-Nedd4-2及其总体占比)水平则均显著高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见图2。提示黄芪汤确实具有促进AMPK和Nedd4-2磷酸化激活的作用。

2.3 黄芪汤激活AMPK以活化Nedd4-2,抑制ENaC的膜表达

为进一步证实黄芪汤通过AMPK/Nedd4-2/泛素化通路对ENaC膜表达的调控机制,我们基于shRNA干扰技术构建了AMPK-α1敲减的稳转细胞系。检测显示3个shRNA敲减试验组中,shRNA1和shRNA3的M-1细胞AMPK表达量均显著低于空白对照组和阴性对照(negative control, NC)组,差异有统计学意义(P<0.05),见图3。证实敲减系构建成功,其中shRNA1的敲减效果最好,故选为实际应用组,设为shRNA组,该组细胞加用黄芪汤1.0mg/mL孵育24h后设为shRNA+黄芪汤组。

图1 黄芪汤对ENaC表达水平的影响作用(n=3)
Fig.1 The effect of Huangqi decoction on ENaC expression(n=3)
A: Western印迹法示各组ENaC膜表达量;B: Western印迹法示各组ENaC全细胞表达量;C~E: 各组ENaC膜表达量比较;F~H: 各组ENaC全细胞表达量比较;I~K: 各组ENaC膜/全细胞表达量比值比较;与空白组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与黄芪汤0.1mg/mL组相比,#P<0.05,##P<0.01

图2 黄芪汤对AMPK和Nedd4-2的影响作用(n=3)
Fig.2 The effect of Huangqi decoction on AMPK and Nedd4-2(n=3)
A: Western印迹法示AMPK、Nedd4-2及其磷酸化水平;B~D: AMPK及其磷酸化水平比较;E~G: Nedd4-2及其磷酸化水平比较;与空白对照组相比,**P<0.01,***P<0.001

图3 shRNA敲减AMPK的效果验证(n=3)
Fig.3 Examination of AMPK knockdown by shRNA interference (n=3)
A: Western印迹法示各组AMPK表达量;B: 各组AMPK表达量比较; 与空白组相比,***P<0.001;与NC组相比,#P<0.05,###P<0.001

在ENaC各亚基的膜表达量上,shRNA组均较空白对照组呈升高趋势,其中ENaCα的增幅明显,差异有统计学意义(P<0.05);而shRNA组和shRNA+黄芪汤组间的差异均无统计学意义,见图4A及图4C~E。在全细胞表达量上,除shRNA+黄芪汤组的ENaCβ小幅高于shRNA组外(P<0.05),ENaC各亚基在三组间的差异均无统计学意义,见图4B及图4F~H。进一步分析ENaC膜/全细胞表达比,shRNA组的ENaC各亚基较之空白对照组仍呈升高趋势,但尚未达显著水平,同时shRNA组和shRNA+黄芪汤组间的差异也均无统计学意义,见图4I~K。Nedd4-2水平在三组间均无显著性差异;磷酸化Nedd4-2水平在shRNA组和shRNA+黄芪汤组间无显著性差异,但均显著低于空白对照组(P<0.05),见图5。

图4 AMPK敲减后黄芪汤对ENaC表达水平的影响作用(n=3)
Fig.4 The effect of Huangqi decoction on ENaC expression after AMPK knockdown (n=3)
A: Western印迹法示ENaC膜表达量;B: Western印迹法示ENaC全细胞表达量;C~E: 各组ENaC膜表达量比较;F~H: 各组ENaC全细胞表达量比较;I~K: 各组ENaC膜/全细胞表达量比值比较;与空白组相比,*P<0.05;与shRNA组相比, #P<0.05

图5 AMPK敲减后黄芪汤对Nedd4-2的影响作用(n=3)
Fig.5 The effect of Huangqi decoction on Nedd4-2 after AMPK knockdown (n=3)
A: Western印迹法示Nedd4-2及其磷酸化水平;B~D: 各组Nedd4-2及其磷酸化水平比较;与空白组相比,***P<0.001

2.4 黄芪汤激活AMPK以增强Nedd4-2与ENaC的结合作用,促进ENaC泛素化

Co-IP检测显示,黄芪汤组ENaCγ与Nedd4-2的结合作用高于空白对照组,且随着黄芪汤浓度由0.1mg/mL增至1.0mg/mL呈剂量依赖性增长;ENaCα、ENaCβ与Nedd4-2的结合作用则在各浓度下与空白对照组间均无明显差异,见图6A~C。AMPK敲减后,shRNA组ENaC各亚基与Nedd4-2的结合作用均低于空白对照组;shRNA+黄芪汤组ENaCγ与Nedd4-2的结合作用较之shRNA组无明显变化,而ENaCα、ENaCβ与Nedd4-2的结合作用则高于shRNA组,见图6D~F。

泛素化检测显示,黄芪汤组ENaCα、ENaCβ的泛素化水平均高于空白对照组,且呈剂量依赖性增长;ENaCγ的泛素化水平随黄芪汤浓度增加也呈进行性升高,虽然在黄芪汤0.1mg/mL和0.3mg/mL时其泛素化水平低于空白对照组,但在1.0mg/mL时仍高于空白对照组,见图7A~C。AMPK敲减后,shRNA组ENaC各亚基的泛素化水平均不同程度低于空白对照组,其中ENaCγ尤为明显;shRNA+黄芪汤组的ENaCγ泛素化水平较之shRNA组无明显变化,而ENaCα、ENaCβ的泛素化水平则仍高于shRNA组,见图7D~F。

图6 黄芪汤对ENaC和Nedd4-2间结合作用的影响
Fig.6 The effect of Huangqi decoction on the interaction between ENaC and Nedd4-2 A~C: 黄芪汤各浓度下ENaC和Nedd4-2的结合作用(Co-IP);D~F: shRNA敲减AMPK对ENaC和Nedd4-2结合作用的影响(Co-IP)

图7 黄芪汤对ENaC泛素化水平的影响作用
Fig.7 The effect of Huangqi decoction on ubiquitination of ENaC A~C: 黄芪汤各浓度下ENaC的泛素化水平(Co-IP);D~F: shRNA敲减AMPK对ENaC泛素化水平的影响(Co-IP)

3 讨 论

水肿是NS的常见临床表现,经典理论多以“低灌注假说”来解释其发病机制[12],而近年来的研究则发现NS时蛋白尿还可通过肾内原发机制直接引起钠潴留,导致有效血容量增加和水肿形成,其核心环节是肾脏集合管的ENaC激活[1-3,13]。在ENaC的3个亚基中,ENaCγ含有纤溶酶的剪切位点,主司通道开闭。NS时肾小球滤过膜受损,原尿中纤溶酶异常增多,可通过蛋白剪切作用去除ENaCγ上的抑制性肽段,导致通道激活并促进水钠潴留发生[14]。ENaC在集合管顶膜上的表达量是决定通道活性的重要因素,其与AMPK的调控作用密切相关[4]。AMPK是细胞的“能量代谢感受器”,在营养代谢、炎症反应和水钠调节中发挥着重要的生理作用。多项研究显示,AMPK可使E3泛素连接酶Nedd4-2的Ser-328位点发生磷酸化,增强其WW模体与ENaC各亚基胞内域PPxY模体间的结合作用,促使ENaC发生泛素化并被细胞内吞转运至溶酶体降解,从而导致其膜表达量下降、活性受抑[5-7,15]。AMPK/Nedd4-2/泛素化通路是调控ENaC活性的重要机制。

中医经典理论认为水肿形成与正气不足、气水失运有关,因此益气扶正是水肿的重要治疗方法。我科常用方黄芪汤始载于北宋杨士嬴的《仁斋直指方论》卷十七,方中黄芪益气固表、利水消肿;茯苓利水渗湿、健脾和胃;麦门冬滋阴生津、清心除烦;五味子收敛固涩、补肾宁心;生地黄清热生津、滋阴养血;瓜蒌根清热润肺、消肿排脓;炙甘草益气补中、调和诸药。诸药合而成方,有益气扶正之功,并兼具养阴之效,可生精化气,对NS水肿具有良好的改善作用。我科室团队长期致力于黄芪汤的现代药理学研究,发现该方及其活性成分之一黄芪甲苷Ⅳ具有抑制足细胞凋亡、改善肾间质纤维化、保护内皮细胞功能、延缓糖尿病肾病进展等多种生物学效应[10-11,16-21]。在此基础上,本研究进一步对黄芪汤改善NS水肿的药理机制进行了深入探索,结果显示,黄芪汤可显著提升M-1细胞AMPK和Nedd4-2的磷酸化激活水平,并可下调ENaC膜表达的绝对量和相对比例;AMPK敲减后,黄芪汤对Nedd4-2和ENaC的影响作用显著减弱,甚至趋于消失,说明AMPK是黄芪汤上述生物学效应的重要介导因子。进一步的Co-IP检测显示,黄芪汤可增强ENaC与Nedd4-2的结合作用及其泛素化水平,AMPK敲减后,黄芪汤对ENaCγ的上述效应明显减弱,而对ENaCα、ENaCβ的作用则基本不受影响,提示ENaC的γ亚基很可能是黄芪汤上述效应的主要作用位点。既往研究业已证实AMPK/Nedd4-2/泛素化通路激活可抑制ENaC膜表达,故结合本研究结果,综合提示黄芪汤可通过激活AMPK以促进Nedd4-2磷酸化,增强Nedd4-2与ENaC的结合作用,导致后者发生泛素化降解、膜表达量下降,从而抑制其通道活性,这可能构成了该方利水作用的现代药理学机制。此外,本研究显示AMPK敲减后,Nedd4-2的磷酸化激活受抑,其与ENaC的结合作用以及后者的泛素化水平下降,而ENaC膜表达则呈上升趋势,这一结果也符合既往研究已证实的AMPK/Nedd4-2/泛素化通路对ENaC活性的调控规律。

既往研究[6]显示,生理状态下,AMPK激活Nedd4-2后,ENaCβ是与Nedd4-2结合的主要亚基,同时ENaCγ也可能少量参与了该结合过程。而本研究则发现,与生理状态下的机制不同,黄芪汤激活AMPK后,ENaC与Nedd4-2结合的主要位点可能位于γ亚基上。这说明黄芪汤对ENaC的药理作用并非生理状态下机制的简单放大,而是可能牵涉到包括靶亚基转移在内的其他独特机制,值得进一步深入研究。当然,无论Nedd4-2的结合亚基是ENaCβ还是ENaCγ,其都是ENaC必不可少的组成部分,无论何者发生泛素化降解,都会使ENaC无法形成完整、稳定的膜蛋白,从而导致ENaC其他亚基的膜表达量也同步下降,这也与本研究的结果相符。

作为肾脏负责水钠转运的核心通道之一,ENaC活性除受AMPK调控外,还受到其他诸多因素的影响,其中最经典的是醛固酮/血清和糖皮质激素调节蛋白激酶1(serum-and glucocorticoid-induced protein kinase 1, SGK1)/泛素化通路和血管加压素/蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)/泛素化通路。醛固酮和集合管细胞胞质内的盐皮质激素受体结合后,一方面该复合体可发生核转位并激活ENaC基因的转录、转译,从而直接增加ENaC的蛋白合成;另一方面其还可促进SGK1的合成,后者磷酸化Nedd4-2的位点(Thr-246为主,Ser-328次之)和效应与AMPK不尽相同,能降低Nedd4-2和ENaC的亲和力,抑制ENaC泛素化,从而上调ENaC的膜表达水平[2,7,22]。除醛固酮外,血管加压素也是参与机体水钠调节的重要激素,其与集合管细胞基膜侧的V2R受体结合后,可激活PKA,发挥类似于SGK1的作用,抑制Nedd4-2与ENaC的结合,从而增加ENaC的膜表达量[4,23]。由此可知,SGK1、PKA虽然也作用于Nedd4-2,但其与AMPK的效应正相反,双方互相拮抗平衡,对ENaC形成了双向调控。本研究目前聚焦于黄芪汤调节AMPK以影响ENaC的作用机制,其中shRNA抑制AMPK后黄芪汤对Nedd4-2的磷酸化激活虽显著受抑,但仍有微弱上升趋势,这一方面可能在于shRNA对AMPK系敲减而非彻底敲除、致使残留AMPK仍可微弱激活Nedd4-2,另一方面也不排除存在SGK1、PKA代偿性激活Nedd4-2的可能。在后续研究中,须进一步拓展评估黄芪汤对醛固酮/SGK1、血管加压素/PKA通路等ENaC调节网络中其他要素的作用效应,从而更全面地阐明黄芪汤调控ENaC活性的完整机制图谱。

综上所述,本研究显示黄芪汤可通过激活AMPK/Nedd4-2/泛素化通路以下调ENaC的膜表达水平,从而抑制其活性,这可能构成了该方利水作用的现代药理学机制。

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Mechanism of Huangqi decoction in regulating epithelial sodium channel on renal collecting duct

CHEN Jun-liang1, CHI Yang-feng1, NING Feng-ling2, WANG Li1, WU Xiao-han1, ZANG Ying-jun1, CHEN Jing1, ZHANG Xue-mei2, WANG Hao1

(1. Dept. of Nephrology, Putuo Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200062, China; 2. School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 201203, China)

【Abstract】 Objective To investigate the effect and mechanism of Huangqi decoction, a traditional Chinese medicine compound for nephrotic edema, in regulating epithelial sodium channel(ENaC) on renal collecting duct. Methods The M-1 mouse renal collecting duct cells were treated with Huangqi decoction and expression of AMP-activated protein kinase(AMPK) was knocked down by short hairpin RNA. Western blotting and co-immunoprecipitation were performed to identify the regulatory effect of Huangqi decoction on ENaC expression and its association with AMPK/Nedd4-2/ubiquitination pathway. Results Huangqi decoction could significantly increase the phosphorylating activation level of AMPK and Nedd4-2, promote ENaC-Nedd4-2 interaction and ubiquitination of ENaC, and further down-regulate the membrane expression level and comparative proportion of ENaC. Such effects of Huangqi decoction on Nedd4-2 and ENaC were significantly attenuated after AMPK knock-down. Conclusion Huangqi decoction can activate AMPK/Nedd4-2/ubiquitination pathway, thus down-regulating membrane expression and inhibiting the activity of ENaC on renal collecting duct cells. This may be associated with its pharmacological mechanism in ameliorating nephrotic edema.

【Key words】 Huangqi decoction; AMP-activated protein kinase; ENaC; nephrotic syndrome

doi: 10.16118/j.1008-0392.2020.06.004

收稿日期: 2020-08-18

基金项目: 国家自然科学基金(81703876);上海市卫生和计划生育委员会科研课题(20164Y0183);上海市医学重点专科建设项目(ZK2019A12)

作者简介: 陈骏良(1985—),男,主治医师,博士.E-mail: havol_chen606@163.com

通信作者: 王 浩.E-mail: wang402hao@163.com

【中图分类号】 R692

【文献标志码】 A

【文章编号】 1008-0392(2020)06-0700-09