·综 述·
人类基因组只有部分DNA用于编码蛋白质,其余大部分转录成各类RNA最终并不被翻译成蛋白质,这些RNA称为非编码RNA[1]。部分非编码RNA参与基因转录后调控、剪切和修饰等,在生命活动中发挥重要的作用。环状RNA(circularRNA,circRNA)是一类双链闭合非编码RNA,无5′帽子结构及3′poly A尾,长度在几百到几千个核苷酸不等,不受RNA外切酶降解,稳定且广泛地存在于真核生物,具有进化保守性[2]。circRNA在许多疾病中起着重要的调控作用,如神经系统疾病、心血管疾病、糖尿病和肿瘤等[3]。本文就circRNA在心血管疾病临床诊断和预警方面的应用研究现状进行综述。
circRNA主要来自于外显子,和一般的RNA剪接模式不同。这种结构上的差异体现在3′端和5′端通过环化的方式结合在一起[4]。目前主要有3种环化的方式。(1) 内含子配对驱动的环化: 以内含子区域的顺式作用元件配对为基础,外显子于前体信使RNA(messenger RNA, mRNA)的侧面相接,形成反义剪接[5]。(2) RNA结合蛋白(RNA bindingprotein, RBP)驱动的环化: RBP识别并且结合内含子中的特定基序,通过RBP之间的二聚作用,外显子两端的剪接位点相互靠近,于前体mRNA的侧边成环[6-7]。(3) 套索驱动式环化: 分为两种,一种是前体mRNA在剪接过程中去除内含子,内含子形成套索结构,此类circRNA不包含外显子;另一种是由于外显子跳读形成套索,此类circRNA包含外显子[8-9]。circRNA广泛表达于人体的各种细胞、外周血、唾液和其他体液中,在某些情况下其表达水平要比相关的线状RNA高10倍以上[5]。circRNA在分裂缓慢的组织细胞中丰度很高(如神经细胞或其他分化程度较高的细胞),在分裂迅速的组织细胞中丰度较低(如癌细胞)[10-11]。由于没有游离端而增加了自身稳定性,且在多种体液中富集,circRNA成为非侵入性生物标志物的理想候选者。
circRNA可以吸附并隔绝miRNA,阻止miRNA与mRNA的相互作用。如来源于CDR1基因的circCDR1AS,含有许多miRNA-7的结合位点,能够抑制miRNA-7对靶基因的调控[12]。
circRNA可以结合蛋白质,调控其活性。如来源于MBNL1基因的circRNA,包含许多MBNL1的结合位点。当MBNL1蛋白含量过高时,其转录本含量降低,转而生成更多circRNA来结合MBNL1蛋白[6]。
Hela细胞与H9细胞中有一类circRNA亚型,主要定位于细胞核,通过与小核蛋白颗粒U1相互作用调控RNA聚合酶Ⅱ的活性,提高其亲本基因的转录水平[8,13]。
由于线状剪接与反义剪接的供体与受体相同,circRNA的产生是以牺牲线状mRNA为代价的。如果蝇S2细胞中提高线状mRNA的含量会导致circRNA的表达水平降低[6]。
circRNA缺乏典型的5′帽子结构及3′poly A尾,无法被翻译。但序列中引入内部核糖体进入位点可使蛋白质翻译起始不依赖于5′帽子结构,circRNA也可以被翻译成蛋白质[14-16]。
左室重构和心功能障碍是急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)后常发生的并发症,如何对其准确预测是一个临床难题。Vausort等[17]通过检测心肌梗死相关circRNA(myocardial infarction associatedcircular RNA, MICRA),预测心肌梗死后心力衰竭的发生率。定量反转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription-polymerasechain re-action, qRT-PCR)检测结果表明,AMI患者外周血液中的MICRA表达水平显著低于健康志愿者。综合多种变量建立AMI后左室功能衰竭的预测模型,引入MICRA可以改善其预测功能,其综合判别改善指数[18](integrated discrimination improvement, IDI)为0.07。研究发现,左心室射血分数(ejection fraction, EF)≤40%的AMI患者,外周血液中的MICRA水平显著低于EF>40%的AMI患者(P<0.001)[19]。有序回归多变量分析提示,MICRA和AMI后心功能障碍有着密切关系,MICRA能够预测AMI后的心力衰竭。精准医学时代,准确预测患者AMI后心力衰竭的发生风险,可以提前干预,提高治疗效果,有助于医疗资源的合理分配。
心房颤动(atrial fibrillation, AF)是冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting, CABG)后最常见的并发症之一。术后心房颤动(postoperative atrial fibrillation, PoAF)的发生率与发病率、死亡率以及总治疗费用显著相关[20]。为了预防PoAF,临床上常进行药物干预,考虑到药物副作用,对高危患者的干预更有意义。高龄是PoAF公认的危险因素,体质量指数[21]、高血压、糖尿病[22]、左心房增大等也是危险因素,但目前还没有能够被广泛接受的预测PoAF的风险模型。Zhang等[23]应用高通量技术分析患者CABG手术前1周的血样,通过对比PoAF与非PoAF患者的检测结果,发现9种circRNA明显表达差异。扩大样本量(365例)应用qRT-PCR对这9种circRNA进行验证,发现hsa_circ_025016与PoAF强相关性。受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC)分析显示,hsa_circ_025016预测PoAF的灵敏度为73.5%,特异度为77.8%,曲线下面积(area under curve, AUC)为0.802,表明 hsa_circ_025016对PoAF有预测效能。Harling等[24]研究表明,外周血液中的miRNA-483-5p表达水平是预测PoAF的潜在生物标志物。与miRNA相比,circRNA由于缺乏游离端而对核糖核酸酶R具有抗性,不容易被降解,其作为PoAF诊断和预后的生物标志物具有更稳定的优势[23]。
冠心病(coronary artery disease, CAD)是全球高发病率和高死亡率的心血管疾病,早期诊断CAD的意义重大。目前冠状动脉造影术(coronary arteriography, CAG)是诊断CAD的金标准[25],但这种方法是有创性检查,费用较高,并不适用于低危患者的筛查。心电图(electrocardiogram, ECG)作为无创性的检查,其灵敏度和特异度均比较低,诊断效能不佳。Zhao等[26]通过高通量技术分析CAD患者和健康志愿者的外周血,发现5个差异最大的circRNA。进一步研究表明,其中hsa_circ_0124644的表达水平与CAD的严重程度相关,SYNTAX评分越高,hsa_circ_0124644的含量也越高。ROC曲线分析发现hsa_circ_0124644诊断CAD的灵敏度为0.861,特异度为0.626。引入CAD的相关危险因素,如吸烟、高血压、糖尿病、低密度脂蛋白和总胆固醇,调整后的灵敏度为0.759,特异度为0.704。Li等[27]通过高通量技术研究CAD患者和健康志愿者的外周血,发现2036个差异表达的circRNA,选取其中差异最大的5个circRNA,qRT-PCR发现其中hsa_circ_11806-28、hsa_circ_6510-1和hsa_circ_11783-2的差异有统计学意义,引入相关危险因素后通过Logistic回归分析表明hsa_circ_11783-2与CAD具有相关性。Deng等[28]通过高通量技术比较AMI患者和健康志愿者外周血中的circRNA,发现hsa_circ_081881表达水平差异最大。基因本体论(geneoncology, GO)分析发现hsa_circ_081881有7个miRNA-548位点,可以起到miRNA海绵吸附作用,抑制miRNA-548对血浆中过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)γ蛋白表达的调控作用,使得PPAR γ表达增加,进而减少泡沫细胞的形成。因此hsa_circ_081881可以作为AMI诊断的潜在生物标志物。
室间隔缺损(ventricular septal defect, VSD)是常见的先天性心脏病,是各种原因导致室间隔在胚胎时期发育不全,形成异常交通,在心室水平产生左向右分流。随着对VSD研究的深入,非编码RNA在心脏发育中起着重要的作用[29]。Liu等[30]收集6例流产胎儿(24~28周),在胎儿期应用超声诊断是否患有VSD,胎儿流产后解剖确认,将其分为VSD组和非VSD组(每组3例)。应用高通量技术,分析两组心肌中circRNA表达的差异,发现6234个差异表达的circRNA。从20个表达差异最大的circRNA中随机选择5个circRNA并通过qRT-PCR进行验证,其差异表达的趋势与高通量技术的结果一致。综合GO分析结果,发现差异circRNA含有许多miRNA-30c结合位点。上调的miRNA-30c被报道可通过相关信号通路影响胚胎发育和P19细胞的分化,影响增殖和凋亡的平衡[31]。circRNA可以作为miRNA-30c的海绵,参与心脏疾病的发生和发展。这些差异表达的circRNA具有筛查诊断VSD的潜在临床应用价值。
原发性高血压(essential hypertension, EH)是最常见的一种发病率高、危害性大的心血管疾病。EH的危险因素有很多,目前比较明确的有年龄、性别、区域和社会经济状态[32-33],遗传因素也是目前研究的热点。Bao等[34]根据CircBase数据库的生物信息学分析,提示hsa_circ_0037911和EH的发生、发展高度相关。通过检测EH患者和健康志愿者外周血,证实hsa_circ_0037911表达水平在两组中有显著差异。Bao等还发现hsa_circ_0037911的表达水平与血肌酐的浓度有着显著的正相关性(相关系数r=0.294,P<0.0001)。Santhanam等[35]发现血肌酐和血压有着紧密的关系,血压随着血肌酐升高而升高,血肌酐升高也是高血压的危险因素之一。结合Santhanam等关于血压和血肌酐的研究结果,推测hsa_circ_0037911可能通过血肌酐浓度影响血压[34]。Liu等[36]收集EH组(n=5)和对照组(n=5)的血液标本,高通量分析发现287个异常表达的circRNA。选取其中表达上调的hsa_circ_0126991和表达下调的hsa_circ_0041000,在另外的EH患者(n=89)和健康志愿者(n=89)中扩大验证,发现hsa_circ_0126991的表达水平显著升高,而hsa_circ_0041000的差异无统计学意义。ROC曲线分析提示hsa_circ_0126991可以作为预测EH的生物标志物,灵敏度0.724,特异度为0.673。
子痫前期(preeclampsia, PE)是妊娠期高血压的一种,不仅影响孕妇全身多个器官,而且严重地影响胎儿的生长、发育,引起生长受限、早产甚至死亡[37]。Jiang等[38]通过高通量技术分析PE患者和健康志愿者的血样,发现2178个差异表达的circRNA,进一步验证发现hsa_circ_0001855和hsa_circ_0004904在PE患者中显著升高。酶联免疫测定怀孕相关血浆蛋白A(pregnancy-associated plasma protein A, PAPP-A),发现PE组中PAPP-A表达水平比健康志愿者显著升高[(65.78 vs 41.38) pg/mL, P<0.05]。单独应用circRNA(AUC=0.621)或PAPP-A(AUC=0.728)预测PE效能不佳;联合应用circRNA和PAPP-A建立预测模型,具有更好的预测效能(AUC=0.940)。Hu等[39]通过高通量技术分析胎盘组织,发现8553个差异表达的circRNA,其中hsa_circ_0036877在PE患者胎盘组织中的表达水平低于健康志愿者。进一步研究发现hsa_circ_0036877在PE患者外周血中的表达水平显著高于健康志愿者。hsa_circ_0036877预测PE(AUC=0.846),其灵敏度和特异度分别为85.3%和72.7%。Zhang等[40]在另外的研究中发现hsa_circ_101222联合应用血浆蛋白因子内毒素诊断PE,具有更好的预测效能,其诊断的灵敏度为70.73%,特异度为80.49%,AUC=0.876。
circRNA是一类特殊的双链闭合RNA,与线状RNA相比,在生物体内相对稳定[41]。一些临床研究提示circRNA在AMI后心力衰竭、PoAF、CAD、AMI、VSD、EH、PE等心血管疾病的诊断和预警中具有潜在临床应用价值。当然这些研究还存在着一些不足之处: AMI后心力衰竭研究缺乏对MICRA诊断价值的评估,患者临床基线资料不完整;PoAF研究没有对hsa_circ_025016相关信号通路进行深入研究,其调节AF的潜在机制需要探索;CAD诊断方面研究是单中心研究,易受当地环境和人文因素的影响;AMI方面研究没有扩大样本量验证circRNA的诊断作用;circRNA与VSD的研究没有证明circRNA可以直接调节心脏发育,也没有发现对mRNA或miRNA的影响;预测EH研究中临床样本量太小,且没有根据患者体质量指数进行配对。更大样本量、更多临床中心的研究才能更加令人信服地证实circRNA在心血管疾病中的诊断预警作用,同时也需要更多的基础研究以阐明circRNA在心血管疾病发生发展中的生物学作用。
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