·临床研究·
胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一,而且大多数胃癌患者在首次诊断时就属于进展期胃癌,这些患者虽然接受了根治性手术和化疗等综合治疗,但仍然存在较高的肿瘤复发或者远处转移的风险,导致这些患者的预后差,5年生存率低。如何尽早发现胃癌,预判肿瘤病理分期,对提高胃癌患者的远期生存率有重要意义。
肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)近年来受到普遍关注[1]。由于CTCs可能具有生物学活性和转移潜能,近年来对于CTCs与临床肿瘤病理之间的相关性问题,引起了广泛的重视。一些研究者认为,通过检测肿瘤患者外周血中CTCs的数量,可以为判断肿瘤的临床病理分期和预后提供客观的依据[2]。本研究检测了92例胃癌患者术前、术后1周的外周血中CTCs的变化,并且将CTCs检测结果与其肿瘤病理分期进行相关性分析,探讨胃癌患者外周血中CTCs与肿瘤病理分期之间的联系。
将同济大学附属东方医院自2015年6月—2018年12月收治的胃癌患者纳入本研究。纳入标准: (1) 年龄不限;(2) 经胃镜检查和活组织病理学检查明确诊断为胃癌;(3) 患者入组前未接受任何化学药物、放射、免疫制剂、中医中药等治疗。以胃部良性疾病(慢性胃炎、胃十二指肠溃疡、胃息肉)患者作为对照组。患者签署知情同意书,研究方案经过医院伦理委员会审核同意[(2016)研审第(056)号]。
分别于手术前1天、术后第7天清晨抽取肘正中静脉血5mL,用EDTA抗凝管收集保存;裂解红细胞后,使用微流控芯片进行液体处理和CTCs捕获,利用anti-CD45抗体荧光染色白细胞,DAPI染色细胞核,CEP8(8号染色体探针)荧光原位杂交(FISH)染色体呈现异倍体(2倍以上)细胞,荧光显微镜下观察,并计数目标细胞。
(1) 光镜下有完整的细胞核,细胞呈圆形、椭圆形或长形;(2) 荧光下细胞形态及边缘完整,CD45(抗白细胞表面抗原)阴性;(3) 细胞核DAPI核染色阳性,细胞核直径大于8μm,并且核形状不规则;(4) CEP8>两个信号点;(5) 同一个标本中符合上述标准的细胞≥2个视为CTCs阳性。
记录胃癌患者手术后的病理检查资料,包括肿瘤细胞的浸润深度、淋巴结转移数量、神经侵犯、脉管浸润、TNM分期等信息,并进行胃癌患者CTCs与肿瘤浸润深度、肿瘤分化、淋巴结转移数量、TNM分期等相关性分析。
采用SPSS 19.0软件进行统计学分析,计量资料用表示并采用t检验分析,采用χ2检验或Rsher确切概率法分析原发肿瘤浸润深度、肿瘤分化、淋巴结转移数量、TNM分期与CTCs检出水平之间的关系,均为双侧检验。P<0.05为差异有统计学意义。
列入本研究的胃癌患者共92例(男性56例,女性36例),年龄分别为32~82岁,平均年龄(65.3±12.6)岁。手术前1天从患者外周血中检出CTCs阳性58例,阳性率63%。CTCs阳性的鉴别标准为DAP1染色(+)、CEP8染色(+)、CD45染色(-),见图1。
图1 CTCs阳性的鉴别标准
Fig.1 The criteria for identifying positive CTCs
主机: Leica DM3000;软件版本: Leica Application Suite Version 4.9.0;放大倍数×400;A: DAPI标记阳性细胞;B: CEP8标记阳性细胞;C: CD45阴性细胞;D: 将三者叠加的效果图,具备DAP1(+)CEP8(+)CD45(-)特征的细胞为CTCs
92例胃癌患者手术前的外周血CTCs检测结果以及与性别、年龄、肿瘤浸润深度、TNM分期、神经侵犯、脉管侵犯等主要临床病理资料的统计分析结果见表1。结果显示,胃癌患者外周血中CTCs的阳性率与他们的年龄、性别没有相关性(P>0.05),但是,胃癌患者CTCs的阳性率与肿瘤浸润深度、TNM分期、神经与脉管侵犯的差异都具有统计学意义(P<0.05)。在肿瘤的浸润深度和TNM分期方面,不同组别之间差异也有统计学意义(P<0.05),随着肿瘤侵犯深度的加深,外周血中循环肿瘤细胞的阳性率也随之增加,患者中具有脉管侵犯的CTCs阳性率显著高于没有脉管侵犯者(P<0.05)。
表1 CTCs阳性率与患者的性别、年龄,肿瘤的 T分期、TNM分期及神经、脉管侵犯的相关性
Tab.1 The relationship of positive CTCs with gender, age, T stage, TNM stage, nerve and vascular invasion
因素n阳性数(率)P性别>0.05 男5637(66%) 女3621(58.3%)年龄/岁>0.05 ≤655132(62.7%) >654126(63.4%)T分期<0.05 T141(25%) T2126(50%) T34529(64.4%) T43122(70.9%)TNM分期<0.05 Ⅰ期41(25%) Ⅱ期116(54.5%) Ⅲ期5232(61.5%) Ⅳ期2519(76%)神经侵犯<0.05 (+)5637(66.1%) (-)3621(58.3%)脉管侵犯<0.01 (+)6248(77.4%) (-)2812(42.9%)
将肿瘤组织不同浸润深度的病例进行分组,将肿瘤分期为T1、T2分为一组,肿瘤分期为T3、T4分为一组。从表2可以看到浸润程度深的患者,CTCs阳性率显著高于浸润深度浅的患者(P<0.05)。
表2 胃癌患者不同T分期与CTCs阳性率的比较
Tab.2 The relationship between CTCs and T stages in gastric cancer patients
分期例数检出数阳性率(%)PT1+T24125<0.05T3+T422940.9
86例患者在术后1周进行了CTCs检测,占93.5%,其余患者由于提前出院、标本保存等因素,未能检测。手术前CTCs阳性的58例胃癌患者术后1周的检测结果: CTCs数量减少或者归零者35例,占60.3%;CTCs数量无变化者15例,占25.9%;CTCs数量增加者8例,占13.8%。这些结果表明,胃癌根治术后短期内就能够有效减少患者的CTCs负荷,获益人群达到60%左右。但是还有近26%的患者CTCs并没有减少,甚至少部分患者(占13.8%)术后CTCs反而升高。分析这部分患者的临床病理资料,发现术后CTCs没有减少甚至是增加者,主要是TNM分期较晚(Ⅲ、Ⅳ期)患者,伴有血管内癌栓、周围组织癌结节和腹膜癌结节形成等晚期现象,见表3。
表3 58例胃癌患者术后CTCs变化与临床病理的关系
Tab.3 The relationship between the CTCs after operation of 58 gastric cancer patients and clinical pathological changes
CTCs数量Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期Ⅳ期测不出1652数量减少03126数量无变化0186数量增加0035
实体癌的微转移是肿瘤恶性特征的重要表现之一,与肿瘤的临床病理分期、转移与复发、预后具有十分紧密的关系[3-4]。
CTCs检测是近年来兴起的一项临床新技术,通过对外周血中CTCs的分离富集以及对CTCs的检测等步骤,直接检测外周循环血液中肿瘤细胞的存在与否[5]。因此,文献报道在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌等等多种实体瘤患者的外周血中都能检测到CTCs,并且CTCs的恶性度与原发肿瘤细胞大致相同[6-8]。一些研究表明,CTCs的存在与肿瘤分期具有明显的相关性,CTCs数量越多,患者面临远处转移的肿瘤细胞负荷越重,未来发生转移的可能性就越大[9-10]。外周血中的异倍体细胞被认为是CTCs的标志之一[2]。
从本研究结果可以看出,胃癌患者的外周血中确实能够检测到CTCs,阳性率为63%,与文献报道基本相同。田晓坤等[10]报道在41例胃癌患者外周血中,有29例CTCs检测结果为阳性,阳性率为70.7%。本研究结果还表明,胃癌患者外周血中CTCs的阳性率与临床肿瘤病理分期具有相关性,分期越晚,CTCs阳性率越高,而早期患者的CTCs阳性率很低。但是也有文献报道,胃癌患者外周血中CTCs阳性率与肿瘤的分期、分化程度和淋巴结转移均无明显相关性[9]。因此,对于胃癌患者外周血中CTCs阳性率与临床肿瘤病理的联系,值得在更大范围,纳入更多病例进一步深入研究。
对于胃癌根治性手术后CTCs的变化,目前文献仍然报道很少。本次初步观察结果表明,多数患者在行胃癌根治性手术后,CTCs转阴或者减少(60.5%),反映随着原发肿瘤的切除,外周血中CTCs也随之减少或消失,表明了手术的根治性与彻底性。但是,仍有总数近25.9%的患者CTCs没有明显变化,13.8%的患者CTCs数量还有所增加,并且与其TNM分期晚(Ⅲ、Ⅳ)密切相关。这些现象提示: (1) 对于病理分期晚的胃癌患者,单纯的手术切除并不能消除所有的CTCs,需要联合术后化疗等综合治疗措施,以完善治疗方案;(2) 对于胃癌根治术后CTCs仍然阳性的患者,观察术后1周还是不够的,需要增加术后2、4周等节点的检测,以便能够更加全面地了解手术后CTCs的变化规律;(3) 目 前的CTCs检测技术还不能完全反映外周血中肿瘤细胞的状况,由于CTCs的数量极少,不可能在外周血中形成均匀分布,随机的单次采血检测,就大大增加了捕捉CTCs的难度和偶然性。因此,研究团队认为即使CTCs检测阴性,也并不能代表外周血中没有CTCs。今后可以考虑联合应用microRNAs检测等技术[11],进一步丰富外周血中肿瘤信号的检测。
志谢 在本研究实施过程中,得到宁波美晶医疗技术有限公司的技术支持,在此深表谢意!
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