·综 述·
慢性巨大肩袖损伤(chronic massive rotator cuff tears, CMRCT)是一个复合结构的损伤，包括肌腱从骨界面的撕裂，原有的腱骨界面止点结构的破坏；肩袖肌肉萎缩、脂肪浸润的产生；肩袖止点肱骨大结节骨质疏松等一系列的病理过程[1]。目前，临床对于CMRCT的治疗方案首选手术治疗，通过手术重建肩袖止点连接结构。由于CMRCT的病理机制复杂，单纯手术重建肩袖止点结构，并不能很好地恢复肩袖止点组织结构及生物力学功能，术后容易再次损伤。临床常见的CMRCT手术修复后的再发撕裂率非常高[2]，如何更好地促进CMRCT的组织结构和功能的恢复，是目前临床研究的热点和难点。随着干细胞研究的深入开展，越来越多的研究利用干细胞治疗肩袖损伤，在肩袖组织结构的修复和生物力学功能恢复方面均获得了一定的治疗效果。本文就CMRCT的病理机制及干细胞治疗在促进CMRCT修复中的作用及其机制进行综述。
CMRCT常同时伴有肩袖肌肉萎缩、脂肪浸润，而肩袖肌肉萎缩、脂肪浸润严重程度与肩袖损伤的时间及损伤的严重程度密切相关，并能够用来判断肩袖能否修复以及评估修复后再撕裂的发生率。因此，对于肩袖肌肉萎缩及脂肪浸润的研究越来越多，有些研究发现肩袖肌肉萎缩、脂肪浸润在肩袖修补以后无法恢复，呈不可逆性改变[3]。有些研究发现肩袖肌肉萎缩、脂肪浸润在肩袖修补以后能够部分修复[4]。那么，具体是什么机制导致肩袖损伤后出现肌肉萎缩、脂肪浸润，目前研究显示引起肩袖损伤后肩袖肌肉萎缩、脂肪浸润的病理机制是多方面的[5]。其中炎症是目前研究较多的领域，肩袖从肱骨大结节止点撕裂后，肩袖肌肉失去了机械应力刺激，出现炎症细胞的聚集，引起肌纤维细胞的凋亡，浸润的炎症细胞释放IL-1β和TNF-α，引起炎症级联反应[6]。这些因子通过激活细胞内核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)，不仅引起细胞凋亡和肌肉萎缩还会抑制肌肉再生。动物模型研究显示肩袖肌肉长时间缺乏应力刺激，导致周围细胞基质中的巨噬细胞转化为促纤维化的M2巨噬细胞，并且重新编程肌原性前体细胞向脂肪细胞转化的路径，引起脂肪细胞沉积在肌纤维内或肌纤维之间，从而引起脂肪浸润[7]。
由于聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(Poly adeno-sine diphosphoribose polymerase-1, PARP-1)是重要的炎症调节因子，在炎症反应中，能够引起肌肉萎缩、脂肪浸润，Kuenzler等[8]通过敲除大鼠PARP-1基因的肩袖损伤模型研究显示肩袖肌肉能够再生，脂肪浸润明显减少。临床研究显示细胞外基质中金属蛋白酶(metalloprotease,MMP)的表达与肌肉萎缩密切相关[9]。研究[10]显示，冈上肌腱撕裂后，MMP-1、MMP-9、MMP-13的表达明显增高。通过切断冈上肌腱、冈下肌腱，6周后发现敲除MMP-13基因的小鼠与正常小鼠肌肉萎缩明显，而敲除MMP-13基因的小鼠出现更为严重的脂肪浸润。由此认为MMP-13在慢性巨大肩袖损伤后脂肪浸润的发生中起到重要作用[11]。Wnt信号通路被认为是间充质干细胞向脂肪细胞分化的重要调节因子，Wnt信号通路的激活能够抑制成脂过程，而Wnt信号通路缺失时会引起成肌细胞向成脂细胞分化[12]。当机械应力刺激时能够激活Wnt信号通路，而CMRCT由于肩袖肌肉长时间缺乏应力刺激，导致肩袖肌肉内Wnt信号通路失活，引起成肌细胞向成脂细胞分化，出现了脂肪浸润[13]。Liu等[14]通过大鼠模型研究发现，肩袖损伤后，Tie2+肌肉间充质祖细胞是肌肉纤维化的主要细胞来源，而PDGFRα+纤维脂肪祖细胞是引起脂肪组织浸润的主要细胞类型。那么对于这两种细胞类型的干预，可以阻断肩袖肌肉纤维化和脂肪浸润。从目前的研究结果可以看出，对于CMRCT合并出现肌肉萎缩、脂肪浸润的机制研究非常多，也取得了一定的研究成果，还需要进一步去明确CMRCT合并出现肌肉萎缩、脂肪浸润的关键机制。
随着脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)研究的不断深入，对于ADSCs治疗CMRCT肌肉萎缩、脂肪浸润的研究越来越多。Oh等[15]通过建造兔肩胛下肌腱损伤模型，发现肩袖损伤后，肩胛下肌脂肪浸润明显，实验组给予手术修复肩袖止点，在肌肉肌腱移行处注射ADSCs，对照组注射生理盐水，通过肌电图检查、组织学观察、生物力学检测发现ADSCs能够通过改善肩袖损伤后脂肪浸润促进肩袖愈合。Kim等[16]通过兔冈上肌腱损伤修复动物模型，实验组给予注射ADSCs，对照组给予生理盐水，研究发现脂肪干细胞通过促进胰岛素样生长因子受体(insulin-like growth factor receptor-1, IGFR-1)和肌源性基因重链肌球蛋白(myogenic gene heavy chain myosin, MyHC)的表达促进肩袖肌肉组织再生。还有研究通过将人体血管基质成分(stromal vascular fraction, SVF)应用到免疫缺陷大鼠CMRCT模型，研究结果显示SVF能够修复CMRCT肌肉纤维化，由于SVF组织内主要细胞成分是ADSCs，由此认为ADSCs能够逆转肌肉纤维化过程[17]。也有部分研究显示间充质干细胞无法完全恢复CMRCT肌肉萎缩、脂肪浸润，通过大鼠CMRCT模型研究，给予局部注射骨髓间充质干细胞和肌细胞，发现能够促进肩袖肌肉及脂肪浸润的部分恢复，但无法完全修复肩袖肌肉萎缩、脂肪浸润[18]。
CMRCT合并肩袖肌肉萎缩、脂肪浸润的研究非常多，其发病机制具有多面性，治疗起来也非常棘手，如何更加全面的治疗CMRCT合并肩袖肌肉萎缩、脂肪浸润，促进肌肉萎缩、脂肪浸润的可逆性改变是将来研究的重点、难点。随着干细胞研究的深入，越来越多的实验研究显示ADSCs能够在一定程度上逆转CMRCT合并肩袖肌肉萎缩、脂肪浸润，而对于ADSCs的作用机制和临床疗效仍需进一步研究。
腱骨界面是连接肌腱、韧带、关节囊到骨组织的结构，是一个逐渐从软组织向骨转化的过渡区域，具有应力传导和缓冲功能。正常腱骨界面具有复杂的组织学结构和生物力学特性，在光学显微镜下可以看到四层组织结构： 肌腱、非钙化纤维软骨、钙化纤维软骨、骨。这种特殊的组织学结构使得腱骨界面具有特定的生物力学缓冲功能，能够将应力由肌腱组织传导至骨组织。而腱骨界面损伤的机制主要包括外源性机制、内源性机制两个方面[19]。外源性机制是Neer撞击学说： 肩袖肌腱与肩峰之间直接撞击损伤，以冈上肌腱的损伤最为严重，在影像学检查时可以得到验证。对于外源性机制，可以通过手术进行肩峰成形术，扩大肩峰下间隙，减少肩峰下撞击，达到治疗的目的，然而术后肩袖损伤的复发率非常高。内源性机制是缺血-退变学说： 冈上肌腱的止点近端1cm区域是乏血管区，随着年龄增长，肩袖组织退变及局部炎症反应，导致肩袖组织营养障碍，所以发病率与年龄密切相关，与肩袖损伤的流行病学相吻合，目前没有很好的治疗方案可以解决肩袖退变的问题。腱骨界面损伤以后局部炎症反应主要是由于巨噬细胞聚集引起促炎因子的释放，降解细胞外基质，从而影响肌腱成纤维细胞对肌腱损伤的修复作用。有动物模型实验研究显示M1巨噬细胞是引起炎症反应、阻碍腱骨界面愈合的重要原因，通过抑制M1巨噬细胞的作用，可以促进腱骨界面愈合[20]。同样，在体外实验结果也显示M1型巨噬细胞通过释放促炎性因子(IL-1β和TNF-α)等影响腱骨界面愈合[21]。TNF-α是一种有效的炎症调控因子，可以促进破骨细胞的生成，阻碍成骨细胞的分化[22]。因此，在疤痕形成过程中，TNF-α起到调控作用，而且抑制骨组织长入腱骨界面止点。Gulotta等[23]用大鼠模型研究肩袖损伤修复中显示TNF-α的阻断剂可以促进肩袖生物力学功能和组织学恢复。
认识哪些因素影响愈合与哪些因素促进愈合一样重要，MMPs是一种能够降解细胞与周围组织连接的细胞外基质金属蛋白酶，像MMP1、8、9、13通过破坏胶原及其他的细胞外基质影响腱骨界面的愈合，已经有研究显示通过抑制MMPs的活性可以促进大鼠肩袖损伤的愈合[31]。而且，在腱骨界面愈合的不同阶段基质金属酶的作用也是不一样的。在认识到MMPs对腱骨界面愈合影响的基础上，人们开始设想应用MMPs的阻断剂来促进腱骨界面的愈合。Bedi等[24]应用SD大鼠制作急性冈上肌腱损伤的动物模型，然后手术修复冈上肌腱腱骨界面的止点，实验组局部给予MMPs阻断剂重组α2巨球蛋白，实验组术后2周结果显示腱骨界面止点纤维软骨明显增生，术后4周可见胶原纤维组织增生明显，而腱骨界面的生物力学强度与对照组差异无统计学意义。
随着干细胞研究的深入，为再生医学带来了希望，有很多学者致力于应用干细胞促进腱骨界面止点结构的再生。Manning等[25]通过体外实验观察在巨噬细胞诱导的炎症反应中ADSCs对肌腱成纤维细胞的调节作用。实验通过体外培养肌腱成纤维细胞，分别： (1) 加入或不加入IL-1β；(2) 与ADSCs共同培养，加入或不加IL-1β；(3) 与巨噬细胞共同培养；(4) 与 巨噬细胞、ADSCs共同培养。实验研究结果显示促炎因子IL-1β和M1型巨噬细胞通过影响肌腱成纤维细胞的修复作用，阻碍肌腱损伤的修复。ADSCs细胞具有调节M1型促炎巨噬细胞向M2型抗炎巨噬细胞分化作用，调节早期炎症反应阶段，改变局部炎性微环境，同时分泌生物活性因子促进肌腱组织修复及疾病治疗。
干细胞还能够通过基因通路，促进腱骨界面愈合。SOX9、Scx是成软骨、成肌腱过程中必须的2个要素。SOX9是成软骨所必需的要素，在增殖软骨细胞中表达，在肥大软骨细胞中不表达，其作用主要是促使软骨细胞进一步转化为肥大软骨细胞，最终出现矿化过程形成骨组织，在软骨细胞分化中起重要作用[26]。Scx基因是结缔组织的标志基因，位于肌腱的前体细胞，是肌腱、成肌腱的转录因子，在肌腱细胞及肌腱祖细胞中均有表达Scx基因，间充质干细胞具有周期中上调Scx基因表达的作用[27]。Ihh与PTHrP促进软骨细胞增殖、分化[28]。这些因素的逐级表达最终形成了腱骨界面的特有结构。Gulotta等[29]在大鼠的肩袖止点修复重建模型中，转染Scx基因的间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)组，在第2、4周时生物力学强度均强于未转染MSCs组，在组织学方面，第4周时形成了更多的纤维软骨。转录因子Mohawk(Mkx)调节肌腱分化，在肌腱的形成过程中起重要作用。在肌腱炎的病人中Mkx表达受抑制，在肌腱修复时，被激活表达。Mkx通过激活TGFβ通路促进MSCs向肌腱细胞分化作用，抑制MSCs向脂肪细胞、骨细胞分化。在MSCs中，外源性Mkx比Scx能够更显著促进肌腱生成，而且，Mkx能够通过TGFβ2通路激活Scx和细胞外基质的表达。通过大鼠跟腱损伤模型研究结果显示，Mkx可以促进肌腱的再生[30]。Ihh与PTHrP在软骨细胞分化中其重要作用，增殖软骨细胞、肥大软骨细胞前体细胞通过分泌Ihh进入肥大软骨细胞阶段，Ihh与细胞表面的Patched 1(Ptc1)受体结合，导致跨膜蛋白质聚集，促进PTHrP的合成，阻断软骨细胞进入这个过程，这是Ihh与PTHrP的一个负反馈调节通路[31]。Ihh信号传导通路在胚胎发育过程中对细胞分化、增殖、细胞凋亡起到重要作用，目前的研究也显示在腱骨界面止点纤维软骨形成及矿化过程中，Ihh通路发挥重要作用。Breidenbach等[32]通过实验证实去除Ihh通路会导致髌腱止点出现纤维软骨矿化不足，减弱了其生物力学功能。PTHrP存在于增殖的软骨细胞中[33]，防止软骨细胞向肥大软骨细胞增生，因此，PTHrP可以保持软骨细胞群的存在，促进生长，避免出现异位骨化的发生。所以在腱骨界面止点矿化与非矿化层面的转变中起到重要作用。有研究[34]显示Wnt/β-catenin通路在腱骨界面的愈合中起到重要作用，实验中通过体外培养肌腱干细胞分别给予黄岑素和黄岑素加DKK-1(Wnt通路抑制因子)诱导分化，14d后，baicalein组成骨细胞分化标志物(Runx2、OCN、OSX、I胶原)表达明显增高，肌腱干细胞Wnt/β-catenin通路增强明显。黄岑素加DKK-1组显示baicalein促进Wnt/β-catenin通路和促进肌腱干细胞成骨作用受到明显抑制。进一步通过将跟腱移植到大鼠胫骨干骺端的关节外模型研究黄岑素对腱骨界面愈合的影响，实验组给予经胃口服黄岑素3～6周，对照组给药生理盐水喂养。结果显示实验组术后3周、6周腱骨界面愈合的强度明显强于对照组，腱骨界面可见更多成熟成纤维细胞、Sharpey纤维，更多新骨形成，肌腱干细胞Wnt/β-catenin通路增强明显，由此可见，黄岑素主要是通过增强Wnt/β-catenin通路促进腱骨界面的愈合。Tao等[35]利用兔肩袖损伤模型，研究EGR1对肌腱干细胞的分化调节作用以及促进肩袖损伤愈合的机制，结果显示EGR1在肩袖损伤修复中起关键作用，其作用机制主要是通过BMP12/Smad1/5/8通路来实现的。
MSCs具有多种不同功能，如激活成骨、促进骨形成，促进组织再生和免疫调节功能。近年来，MSCs应用于促进腱骨界面组织结构再生的研究很多，并取得了可观的疗效。临床使用骨髓激发来促进MSCs进入腱骨界面来促进腱骨界面组织结构的形成，有一定临床疗效。动物实验研究将人MSCs用到去胸腺的裸鼠CMRCT修复模型中，发现能够明显促进肩袖组织学和生物力学功能的恢复[36]。Zong等[37]用16只去胸腺的裸鼠建造肩袖损伤修复动物模型，实验组用纤维蛋白胶携带人骨髓来源MSCs，对照组仅适用纤维蛋白胶，在2周时可见实验组Ⅱ胶原和SOX9阳性细胞表达明显增强，Gli1和Patched1表达明显加强，在2周、4周时均可见实验组Ihh阳性细胞数量较对照组明显增多。由此可见，干细胞能够通过SOX9、Ihh通路促进纤维软骨形成，促进肩袖止点结构再生。回顾分析27篇临床前研究和5篇临床研究显示： MSCs能够在肌腱环境中存活并能分化为肌腱细胞，能够增加胶原纤维密度，增强组织结构，重建接近正常的腱骨界面止点[38]。
目前对于肩袖损伤修复的研究更多集中在如何获得腱骨界面的再生和腱骨界面生物力学的恢复，一系列的研究均证实干细胞在体内能够通过各种基因通路促进腱骨界面的组织结构的再生，增强腱骨界面的生物力学功能，为临床应用干细胞治疗腱骨界面损伤提供了实验依据，然而，将这些实验研究的成果转化为临床应用还需要临床研究去实现。
通过比较正常人与肩袖损伤患者肱骨大结节骨密度，结果显示肩袖损伤患者肱骨大结节骨密度明显下降[39]。引起肱骨大结节骨密度下降的机制主要包括： 废用性骨质疏松、炎症性骨质疏松。CMRCT由于肩袖止点骨组织缺乏应力刺激，很容易出现肱骨头骨质吸收、骨密度降低，在肩袖修复过程中，由于腱骨界面止点骨组织骨量减少，导致腱骨界面止点愈合延迟[40]。也有研究显示CMRCT，局部炎症反应引起破骨细胞活性增强，局部骨吸收增多而导致了骨质疏松，CMRCT程度与骨密度降低的程度密切相关[41]。
由于CMRCT合并肩袖止点骨质疏松，在进行手术修复过程中，容易出现内固定松动、拔出，影响肩袖愈合。通过临床分析关节镜下修补合并不同程度骨质疏松的肩袖损伤，结果显示肱骨大结节骨质疏松会影响肩袖愈合[42]。Abtahi等[43]通过272例肩袖损伤患者行关节镜手术修补以后分析研究显示骨质疏松是影响肩袖愈合的独立因素。通过双能X线检测对比患者有CMRCT侧的肱骨近端骨密度较正常侧明显降低[44]。通过建造不负重的肩关节模型，发现肩袖止点骨组织钙盐丢失，骨量减少，出现骨质疏松，容易出现肩袖损伤[45]。CMRCT后3周动物模型能够很好模拟人体慢性肩袖损伤的病理改变，肩袖止点骨密度明显降低[46]。
有多种尸体标本研究显示骨质疏松标本的铆钉把持力较弱，可以通过铆钉加固技术或骨水泥加固技术提高铆钉把持力，增强骨质疏松标本肩袖修补时即刻稳定性，防止术后出现肩袖止点的再撕裂，有利于肩袖损伤的修补[47]。肩袖止点的骨质疏松不仅会影响肩袖修补术中铆钉的把持力，影响肩袖修补的即刻稳定性，也会影响腱骨界面的愈合及骨质生长。对于CMRCT的患者肱骨大结节部位出现骨质疏松，会直接影响腱骨界面止点愈合，单纯通过骨水泥加固等技术来增加铆钉的把持力，是无法促进腱骨界面止点组织结构的重建，难以从根本上治疗肩袖损伤[41]。应用ADSCs治疗CMRCT的动物研究显示： CMRCT模型中存在肩袖止点部位骨密度减低，通过给予ADSCs治疗后，可以明显提高肩袖止点局部骨密度[48]。因此，应用干细胞治疗的技术来治疗肱骨大结节骨质疏松、促进腱骨界面止点骨组织结构再生才能彻底解决CMRCT肱骨大结节骨质疏松的问题。
CMRCT是临床常见病，由于其复杂的病理机制，包括肩袖肌肉-腱骨界面-肩袖止点骨组织复合结构的损伤，目前CMRCT的临床治疗主要是给予肩袖止点的修补，难以获得良好的疗效，是目前临床研究的热点。干细胞治疗是非常有前景的一种新型治疗方法，干细胞治疗的出现为再生医学带了曙光。越来越多的实验研究开始应用干细胞治疗CMRCT，研究显示干细胞在CMRCT的整个病理过程中均有一定的治疗作用，对于干细胞治疗CMRCT的机制及其疗效还需要进一步的全面研究和探讨，为临床应用干细胞治疗CMRCT提供充分的依据和可行性。
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