黑素皮质素受体4基因rs489693位点多态性与慢性精神分裂症患者疗效、BMI及高血糖的关系

精神分裂症是一种严重的衰退性疾病，通常需要长期甚至终生使用抗精神病药物治疗。抗精神病药诱发的体质量增加(antipsychotic-induced weight gain, AIWG)是抗精神病药物的常见不良反应，是患者治疗依从性差的主要原因之一，且增加发生2型糖尿病、代谢综合征和心血管事件的风险[1-3]。各种抗精神病药物导致的AIWG严重程度各有不同，其中以氯氮平和奥氮平诱发AIWG尤为突出。第二代抗精神病药(second generation antipsychotics, SGA)奥氮平通过作用于控制能量平衡的下丘脑，增加进食刺激，继而导致体质量增加、代谢紊乱及高血糖风险[4-5]。除了药物不良反应，导致精神分裂症患者发生肥胖的原因还包括不良生活方式、社会心理因素和基因缺陷等。

随着SGA相关体质量增加的药物遗传学领域的快速发展，人们致力寻找明确的候选基因以便指导临床选择避免肥胖的药物。黑素皮质素受体-4基因(melanocortin four receptor, MC4R)属于一个包含7个跨膜结构域的G-蛋白偶联受体家(G-protein-coupled receptors, GPCR)，这个基因家族在下丘脑神经核群调整摄食区域有较低水平的表达[6]。动物实验证实缺乏MC4R等位基因r(MC4R-/-)的大鼠会产生肥胖症状，而杂合子基因鼠(MC4R+/-)出现中度肥胖的表型[7]。全基因组关联分析(genome wide assoeiationstudy, GWAS)发现MC4R附近的单核苷酸多态性位点rs489693与SGA肥胖相关基因位点，该基因位点多态性导致体质量增加具有遗传生物学合理性[8]。已有研究发现初次服用SGA的高加索人种精神分裂症患者群体中，rs489693多态性含A等位基因可能是发生体质量增加的风险因素[9]。但目前尚缺乏汉族慢性精神分裂症患者服用奥氮平治疗后体质量变化与rs489693多态性的关系。本研究选取上海地区汉族的慢性精神分裂症患者，根据不同MC4R rs489693多态性及服用奥氮平治疗后体质量指数(body mass index, BMI)、糖脂水平和尿酸变化的情况，从遗传学角度分析探讨该位点与精神分裂症患者发生肥胖风险的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

纳入2018年1月1日至2018年01月31日在上海市民政第三精神卫生中心门诊或住院的非急性期精神分裂症住院患者共135例。入组标准： (1) 年龄18～65岁，汉族，男女不限；(2) 符合国际精神与行为障碍分类第十版(ICD-10)精神分裂症诊断标准,病程大于2年；(3) 入组前已经服抗精神病药者需停止服用抗精神病药物，药物清洗期2周；(4) 文化、社会及受教育背景足以理解知情同意和研究内容。排除标准： (1) 合并符合ICD-10除精神分裂症以外的诊断；(2) 有脑器质性疾病或严重的头部外伤史；(3) 过去2个月有存在酒精或其他物质依赖或滥用者，社会和认知功能显著缺损；(4) 在过去1年中，有丧偶等重大生活事件；(5) 严重自杀企图者；(6) 当前患者严重的躯体疾病如显著心血管功能、肝肾功能异常等；(7) 孕妇和哺乳期女性；(8) 近1个月接受过MECT治疗者。本研究通过上海市民政第三精神卫生中心伦理委员会一致同意(沪三精发[2018]26号)。所有受试者及其法定监护人均进行知情同意相关告知，理解试验目的和过程，收益及可能的不良反应，并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 MC4R基因型检测对于入组患者首先予药物代谢基因检测(MC4R)。所有研究对象于早上6：00 取样，利用口腔拭子采集口腔黏膜脱落细胞，并委托上海康黎医学检验所进行DNA的提取和多态性的检测。DNA提取完成之后，采用PCR及飞行时间质谱技术(matrix assisted laser desorption ionization time of flight, MALDI-TOF)对MC4R(rs489693)多态性分析。主要步骤如下： (1) PCR扩增反应：反应体系为基因组DNA10ng,引物0.1mol/L,缓冲液0.5μL，MgCl2 2mmol/L，dNTP 500mol/L,Taq酶1U，体系共5μL。SNP位点的上游引物为： 5′-CCAGATTTGGTCAATACAGG-3′，下游引物为： 5′-TATGGACGGTGCGACATTTG-3′(搜索自https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?do_not_redirect&rs=rs489693)。扩增条件为95℃预变性2min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，进行45次循环，最后72℃延伸5min，4℃ 保存。(2) 虾碱性磷酸酶反应(shrimpal-kalinephosphatase, SAP)： SAP消化PCR扩增后剩余的dNTP及残留引物。(3) 单碱基延伸反应：反应体系为纯化后PCR产物7μL，iPLEX缓冲液0.2μL，iPLEX特异性终止反应液0.2μL，延伸引物0.94μL，iPLEX酶0.041μL，体系共9μL。反应条件为94℃预变性30s；94℃变性5s，52℃退火5s，80℃ 延伸5s，共进行40次循环(其中52℃退火5s及80℃延伸5s进行5次循环)；最后72℃延伸3min。(4) 样本脱盐及上机检测：将上一步的反应产物加入阳离子交换树脂完成脱盐，点样，利用质谱仪进行分析，并使用Typer Analyzer软件分析基因分型数据。根据不同MC4R基因rs489693多态性分为AA型，AC型，CC型3组。

1.2.2 一般资料和人口学资料收集使用研究者自编的一般情况问卷：用于收集患者姓名、性别、年龄、民族、婚姻、教育年限、文化程度等一般人口学资料以及身高、体质量、腰围、病程、家族史、婚姻史、吸烟史等疾病相关资料，计算BMI=体质量/身高2。

1.2.3 阳性与阴性症状量表(PANSS量表)[10-11]评分用于评定精神病性症状的严重程度，经过30余年的临床和科研使用，被证明具有良好的信度和效度，兼顾了精神分裂症的阳性症状和阴性症状及一般精神病理症状，较全面地反映了精神病理全貌。本研究使用的是何燕玲等[12]于20世纪90年代引入国内的PANSS中文版，共30个基本条目组成3个分项：阳性、阴性和一般精神病理。每个条目均为7级评分，从1到7，按精神病理水平递增排列[13]。

1.2.4 实验室检查所有研究对象于早晨6：00抽血取样，全自动生化分析仪(7180，HITACHI，日本)检测空腹血脂谱，包括总胆固醇(total cholesterol, TC)、三酰甘油(triacylglycerol, TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)，检查血糖、糖化血红蛋白、尿酸水平。

1.3 治疗与评估

所有研究对象予奥氮平口服治疗，共服用12周。复发者治疗前需停止服用任何抗精神病药物，药物清洗期2周。奥氮平片的用药方案为10～20mg/d。PANSS量表由2名专门受过培训的主治医师完成，Kappa值为0.84。评估时点：分别于基线、治疗4周末、8周末、12周末对研究对象行PANSS量表测试。所有被试者均在宽敞安静的环境下完成测验。所有研究对象于基线和治疗12周末行体质量、腰围和实验室检查，见图1。

1.4 统计学处理

使用SPSS 22.0软件进行数据处理。计算各基因型及等位基因频率并以Hardy-Weinberg平衡检验所选样本的群体代表性。计量资料以

表示，一般资料基线的分析采用卡方检验和方差分析，以重复测量方差分析比较不同时间点和不同组别间PANSS量表评分变化。以协方差分析比较不同等位基因携带者间各临床变量差异，对有显著性差异的变量采用Bonferroni校正法进行事后多重比较以确定具体的组间差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

本研究基线纳入符合入组条件的慢性精神分裂症门诊或住院患者135例，有15例排除(3例基因检测无结果，3例缺乏生化数据，2例门诊失访，7例转院)，故最终120例纳入研究统计。根据DNA测序法检测MC4R基因rs489693的多态性分为AA组19例(15.83%)，AC组46例(38.33%)，CC组55例(45.83%)，其中男性85例(70.83%)，女性35例(29.17%)。A等位基因在男性总数为56，女性总数为28，C等位基因在男性总数为114，女性总数为42，OR值为0.737(95%CI为0.415～1.310)。平均年龄(62.51±9.14)岁，3组在性别、年龄、病程、家族史、婚姻史、吸烟史方面差异无统计学意义(卡方检验或方差分析，P>0.05)。本研究3组奥氮平使用剂量采用Kruskal-Wallis检验，结果差异无统计学意义，见表1。rs489693基因分布频率符合Hardy- Weinberg平衡检验(χ2=2.98，P=0.08)。

3组间比较计数资料采用卡方分析或Fisher精确检验，计量资料采用的是方差分析；不服从正态分布采用Kruskal-Wallis检验，*P<0.05，**P<0.01

2.2 PANSS量表评分分析

经12周治疗后，所有120例研究对象的PANSS总分、阳性得分、阴性得分均趋下降趋势(平均减分13.84±12.14、6.12±1.96、4.10±2.28)，见图2。3组间经重复测量方差分析，AA组、AC组、CC组的PANSS总分、阳性分、阴性分、一般病理分存在时间主效应(P均<0.01)，提示各项分数治疗后比基线显著下降，差异有统计学意义。AA组、AC组、CC组在PANSS各项的分组主效应、时间×分组交互效应经检验，差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表2。

2.3 体质量、腰围、BMI变量的分析

治疗12周后，以年龄、性别、病程为协变量，对治疗前后患者的体质量、腰围、BMI等项目进行协方差分析发现3组在治疗后净增体质量、净增BMI、净增BMI百分比有差异有统计学意义(P均<0.01)。余项3组间差异无统计学意义(P均>0.05)，见表3。为进一步观察3组间的差异使用Bonferroni校正法进行事后两两比较。结果发现净增体质量AA组大于AC组(P=0.017)和CC组(P<0.01)；净增BMI AA组大于AC组(P=0.031)和CC组(P<0.01)，净增BMI百分比AA组大于CC组(P<0.01)，差异有统计学意义。

2.4 糖脂水平和尿酸的分析

治疗12周后，以年龄、性别、病程为协变量，对治疗前后患者的糖脂水平和尿酸等项目进行协方差分析发现，3组在治疗后血糖、治疗后糖化血红蛋白有差异，差异有统计学意义(P均<0.05)。余项3组间差异无统计学意义(P均>0.05)，见表4。使用Bonferroni校正法进行事后两两比较。结果发现治疗后血糖AA组大于CC组(P=0.040)；治疗后糖化血红蛋白AA组大于CC组(P=0.026)，差异有统计学意义。

Tab.3 Covariance analysis of body weight, waist circumference and BMI in different genotypes

Tab.4 Covariance analysis of glucose, lipid levels, uric acid before and after treatment in 2 groups

2.5 药物量及副反应情况

本研究治疗前后不良反应主要有AA组血压改变1例，失眠1例；AC组血压改变1例，窦性心动过速2例，便秘1例；CC组出现2例血压改变，2例肝功能轻度异常，1例窦性心动过速，均未出现明显实验室检查异常，对症治疗后好转。

3 讨论

MC4R首先由Huszar提出，他们发现MC4R突变基因的实验鼠有摄食多，肥胖和高胰岛素血症的表现。动物实验[14]表明，正常的MC4R功能在于抑制食欲和增加代谢率，减轻体质量。此后的研究表明，定位于染色体18q22的人MC4R基因在维持能量内稳态方面发挥重要作用，该基因上存在功能相关变异导致约6%的极度肥胖个体，是肥胖病的主效基因之一[15-16]。在MC4R基因的变异中，rs489693一直是肥胖遗传机制研究的热点，目前已有多个rs489693与抗精神病药物所致肥胖相关性的研究认为AA纯合子比含C等位基因者增重明显[17]。Czerwensky等[9]纳入341例高加索人种的住院精神分裂症患者，根据rs489693多态性分为AA、AC、CC 3组，经SGA治疗后发现rs489693的各个基因型在SGA治疗后均表现出体质量增加，而A等位基因体质量增加尤为明显，可能是发生肥胖的风险因素。本研究经12周奥氮平治疗后，AA组在净增体质量、净增BMI与其余2组差异有统计学意义，净增BMI百分比与CC组差异有统计学意义，提示AA型基因比其他2种基因型更易导致体质量增加。在糖脂代谢各项指标中，AA组治疗后血糖和糖化血红蛋白均大于CC组，提示AA型等位基因比CC基因型更易导致血糖升高的风险，研究结果与Czerwensky等[9]研究结果部分相同。不同的是，本研究的研究对象以病程较长的慢性精神分裂症为主，使用的药物均为奥氮平。本研究在进行比较后得出结论，AA型患者在奥氮平治疗后体质量增高和血糖升高的风险明显高于其他基因型患者，分析原因与MC4R基因变异导致功能缺陷有关。MC4R可通过作用于中枢黑素细胞皮质素神经元途径(central melanocortin neuronal pathways)调控食物摄入和能量平衡，以及血糖水平[18]。MC4R rs489693的AA纯合子是一种基因变异，或导致MC4R调控能量的功能缺陷，比含C等位基因有明显的增重作用。此外，rs489693多态性影响MC4R的调控区域，通过MC4R表达的改变影响人体对血糖的利用和胰岛素敏感性[19]，继而导致血糖升高[20]。

本研究结果显示，经奥氮平12周治疗后，3组研究对象的精神症状均较基线明显好转，但3组间各项PANSS量表评分变化比较差异无统计学意义，提示AA、AC、CC及3种多态性对奥氮平的精神症状疗效无明显区别。有研究提出代谢不良反应和抗精神病药物的疗效似乎存在某种关联[20]。对易增加体质量的药物和疗效较好的药物分别排序，其等级排列极为相似(氯氮平>奥氮平>利培酮>喹硫平= 阿立哌唑=齐拉西酮)。甚至有学者提出代谢阈值(metabolic threshold)的概念，即抗精神病药物能否起效取决于代谢不良反应的情况[21]。以此推论，本课题组预期易导致代谢不良反应(体质量增加、血脂血糖升高)的AA基因型患者，其精神症状会改善更为明显。但本研究却并未发现此结果，原因可能与选择人群和观察时间较短有关，本研究的对象主要为慢性精神分裂症患者，其精神病症状表现虽较基线好转但改善幅度仍有限。此外，AA组的血脂增高与其余2组差异无统计学意义，而血脂升高与精神症状的改善关系更为密切[21]。这提示有必要扩大观察范围，更多观察时间，以验证代谢反应与精神症状间的关系。本研究中3组研究对象奥氮平使用量差异无统计学意义，研究中未出现严重不良反应，提示奥氮平总体安全有效。

本研究不足之处在于样本量有限且仅来源上海地区的一家医院，如果能扩大样本量、采取多中心研究则或可减少因群体分层(population stratification)对结果导致的干扰。此外进一步研究可对代谢不良反应与不同基因型患者精神症状缓解间的内在联系作测量，如睡眠情况的改善与否、食欲的好转、胰岛素水平等，以便更全面考察两者间的关系，取得更明确的结论。

总之，本研究对慢性精神分裂症患者的MC4R rs489693多态性进行分组对比研究，发现MC4R基因489693位点的AA基因型可能是慢性精神分裂症患者发生体质量增加和高血糖的风险因素，该结果或许能为临床上常见的慢性长期住院精神分裂症患者发现体质量和糖脂代谢异常、及时调整用药、改善代谢风险综合征提供借鉴意义。

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