近年来，由于药物耐药性、组织分布不均，以及毒性等，药物的应用受到越来越多的限制。克服这些问题的方法之一就是开发合适的载药系统[1-2]。不同特性脂质合成的固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles, SLNs)已受到极大的关注。SLNs具有众多优点，如： 控制药物释放和靶向、提高药物稳定性、增强药物分散性、提高药物有效载荷、载体无生物毒性、能够大规模生产[3-7]。重要的是，由生理脂质和表面活性剂组成纳米颗粒已通过FDA批准。被批准用于临床应用[8]。因此，它们作为潜在的药物载体越来越受到重视，尤其是对于水溶性差的药物[9-13]。本课题组研究SLNs搭载脂溶性药物环丙沙星并进行表征。
环丙沙星(ciprofloxacin, CIP)对革兰阳性和阴性细菌有均有很好疗效的广谱抗生素。但由于自身的耐药、肾脏损害等缺点，限制了临床应用。本研究的目的是设计合成环丙沙星固体脂质纳米粒(CIP-SLNs)，进行表征。并检测其抑菌效果。
1 材料与方法
1.1 试剂及仪器
环丙沙星(CIP)和二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma-Aldrich公司。胆固醇和吐温-80购自中国上海国药化学试剂有限公司。乙醇、丙酮购自国药集团化学试剂有限公司(中国上海)。双蒸水由Millipore(Bedford，MA)Milli-Q®系统制备透射电镜，所有其他化学品均为分析纯。
1.2 CIP-SLNs制备
157mg的胆固醇溶解在12mL的丙酮/乙醇(体积比/1∶3)溶液中，形成油相；环丙沙星溶解于114ml含1%(v/v)吐温-80的水溶液中，20℃下，600r/min转匀速搅拌，形成水相。油相逐滴加入水相。1200r/min转速，75℃下继续搅拌2h。0℃冰上继续搅拌2h。收集乳化液，20000r/min离心2h(Avanti J25 centrifuge, JA 25.50 rotor, Beckman Coulter)，去上清液，4℃双蒸水洗涤后再次离心，沉淀再次悬浮后冷冻冻干，称质量，得到CIP-SLNs纳米颗粒，见图1。4℃保存备用。
图1 环丙沙星-固体脂质纳米粒合成示意图
Fig.1 The technical process of preparing CIP-SLNs
1.3 环丙沙星标准曲线建立
将标准重量的环丙沙星样品溶于乙酸/乙醇(体积比1∶9)溶液中，依次将环丙沙星浓度设为1.25、2.5、5、7.5、10、15μg/mL，使用紫外-可见分光光度计(UV-vis)在280nm处测定环丙沙星的吸光度值(A280)。对每个浓度重复测量3次，取均值。以吸收值为纵坐标，浓度为横坐标生成标准曲线。
1.4 透射电镜扫描分析
蒸馏水稀释CIP-SLNs，置于覆有硝化纤维素的铜网格上，形成一层薄薄的液膜，样品用2%磷钨酸钠负染10min，然后自然风干。用透射电镜(日本东京Jeol1230)观察CIP-SLNs的形态特征。
1.5 粒径和Zeta电位分析
在25℃下使用Malvern Nano-ZS 90激光粒度分析仪测定CIP-SLNs的粒径和Zeta电位。将CIP-SLN分散于ddH2O中，按操作说明进行3次粒径测量，取平均值。用同样的仪器测量Zeta电位。
1.6 分散性研究
在PBS(mol/L)中放入等量的CIP或CIP-SLN，以观察其分散性。称量4mg CIP和对应质量的CIP-SLNs置于5mL离心管中，4mL PBS悬浮。涡旋1min后，试管静置4h观察沉淀现象。
1.7 载药率和包封率
在合成过程中，收集所有上清液。测量计算其所含CIP质量，根据上清液中CIP的含量和总投入量，计算包封率(encapsulation efficiency, EF)。将称重的CIP-SLNs样品置于烧瓶中，用含10%乙酸(V/V)的乙醇完全溶解，计算其中所含CIP浓度。载药率(drug loading, DL)和EF可按下式计算。
1.8 紫外-可见光谱研究
用紫外-可见光谱(UV-VIS)测定说明，用Cary 50(Varian，Victoria，Australia)紫外-可见吸收分光光度计测定纳米颗粒紫外-可见光谱，以特征吸收峰证明纳米核中CIP完整存在。将CIP、SLNs和CIP-SLNs溶于含10%乙酸(V/V)的乙醇中，分别测定光谱。
1.9 缓释研究
体外药物释放采用透析膜法[14]。简言之，37℃ 的PBS(pH7.4)受体介质。取一定量的CIP-SLNs(20mg)，溶于20mL ddH2O中，将CIP-SLNs分散液放入透析膜袋中。袋子浸入600mL(含1%吐温-80PBS中)，37℃水浴，100r/min振荡。在指定的时间间隔内更换相同体积(4mL)的样品。通过紫外-可见分光光度计算所取样品中CIP含量，计算累积释放率。重复测定分3次。
1.10 抑菌试验
将大肠杆菌ATCC 25922接种在LB培养基(10g胰蛋白酶原、5g酵母提取物、10g NaCl、1L去离子水)培养。然后将单个菌落接种到50mL的LB培养基中，在37℃条件下，200r/min的转速在HZQ-QX型轨道振动培养箱(哈尔滨东联电子有限公司)培养过夜，将大肠杆菌稀释至106 cfu/mL。分别为大肠杆菌组、大肠杆菌+SLN组、大肠杆菌+CIP组、大肠杆菌+CPX-SLN组。采用二倍稀释法测定其最低抑菌浓度(minimum inhibitory concertration, MIC)，各组浓度分别稀释至6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.005μg/mL，37℃摇床过夜，观察抑制可见细菌生长的最低药物浓度，澄清的肉汤培养基所对应的浓度即最低抑菌浓度。
2 结 果
2.1 CIP标准曲线
逐步稀释的CIP浓度分别为： 1.25、2.5、5、7.5、10、15μg/mL。通过紫外-可见光谱测定吸收值见表1。根据线性方程进行数据拟合并得到方程组： y=0.1345 x + 0.0135，R2=0.9991。
表1 环丙沙星标准曲线
Tab.1 Standard curve of ciprofloxacin
浓度/(μg·mL-1)吸收值1231.250.1760.1780.1762.500.3420.3460.3467.500.6660.6600.67310.001.0551.0631.05315.001.9911.9782.068
2.2 透射电镜分析
透射电镜图片显示CIP-SLNs呈球形(图2A)，直径40～70nm，这同粒度分析结果相似。纳米粒边界清晰，未见聚集现象，相对分散良好，见图2。
2.3 粒径和Zeta电位分析
纳米粒的Zeta电位为(-21.8±1.3) mV(图2B)。动态光散射显示CIP-SLNs粒径为(171±11.4) nm。该结果同TEM结果相似，但大于上述结果。见图2。
图2 环丙沙星-固体脂质纳米粒的表征
Fig.2 Characterization of CIP-SLNs
A： 环丙沙星-固体脂质纳米的透射电镜扫描分析；B： 环丙沙星-固体
脂质纳米的Zeta电位；C： 环丙沙星-固体脂质纳米的粒径分布
2.4 分散性分析
CIP是一种疏水性化合物，不溶于水溶液。为了证实载药体系能够增加CIP的分散性，本研究将等量的游离CIP和CIP-SLN悬浮在等量的PBS中。涡旋1min，静置4h后观察到游离CIP和SLNs-CIP在PBS中的分散。可以看出，CIP-SLN在PBS中分散稳定，静置4h后纳米粒沉淀很少，而CIP静置 4h 后管底沉淀明显，因此，将CIP嵌入SLNs纳米结构中提高了CIP的分散性，见图3。
图3 环丙沙星和环丙沙星-固体脂质纳米粒分散性
Fig.3 Solubility study of free CIP and CIP-SLNs inPBS
A： 环丙沙星；B： 环丙沙星-固体脂质纳米粒
2.5 载药率和包封率
根据前述(2.1项)已获得的CIP标准曲线方程(y=0.1345x+0.0135，r2=0.9991)，对上清液CIP的含量进行测量，计算出的DL和EF分别高达31.10%和77.54%，能够满足下一步实验要求。
2.6 紫外-可见光谱分析
将CIP-SLNs溶于含10%乙酸的乙醇溶液中，其吸收强度在280nm处呈现出与游离CIP相同的峰，但在SLNs中未观察到特征性的CIP峰，这表明CIP在合成过程中仍保持完整，并被包裹在SLNs的纳米核中，见图4。
图4 环丙沙星、固体脂质纳米粒和环丙沙星-固体脂质纳米粒的紫外-可见光光谱
Fig.4 Ultraviolet-visible spectral of CIP, SLNs, CIP-SLNs
2.7 体外缓释
本实验为模拟此类制剂在生物体内释放条件，选择pH7.4的PBS作为释放介质，但CIP难溶于水，无法满足体外释放要求的漏槽条件，所以在受体介质中使用1%吐温80作为表面活性剂。促进其在介质中的漏槽条件。SLNs-CIP的体外药物释放曲线呈现双相模式，起初是突释，然后是持续释放。释药机理可分为药物扩散、聚合物基质膨胀、聚合物侵蚀或降解。在实验条件下，CIP-SLNs在72h 的累计释放度为78.6%，见图5。
图5 环丙沙星-固体脂质纳米粒在PBS中的缓释
Fig.5 In vitro release studies of CIP-SLNs were performedin PBS
2.8 抑菌试验
培养液澄清，无浑浊、沉淀表明无细菌生长，培养液浑浊程度表明细菌生长丰度。-： 无菌；+： 少量细菌；++： 许多细菌；+++： 大量细菌。大肠杆菌组和大肠杆菌+SLN组培养液明显浑浊；大肠杆菌+CIP组的MIC为1.6μg/mL，大肠杆菌+CPX-SLN组的MIC为0.8μg/mL，后者低于前者。结果表明，CPX-SLN的抗菌效果优于单纯的CIP，见图6。
图6 环丙沙星-固体脂质纳米粒和环丙沙星的最低抑菌浓度
Fig.6 The MIC of CIP and CIP-SLNs
-： 无菌; +： 少量细菌; ++： 许多细菌; +++： 大量细菌
3 讨 论
环丙沙星是喹啉羧酸衍生物，有广谱抗菌效果[15-17]，但因其耐药性，特别是泌尿道细菌耐药越来越普遍[18-20]，且其不溶于水的特性及脏器损害作用均限制其临床使用[21-22]。SLN常用制备方法有微乳法、高压乳匀法、乳化蒸发-低温固化法、薄膜超声分散法，每种方法都有各自的优劣性。本研究采用乳化-低温固化法，此方法不需要特殊的设备，能耗低，制备的纳米粒粒径较小、均一，载药量和包封率较高。作为一种非常有前途的药物载体，SLNs具有低毒、控释、靶向、高载药量等优点。近年来，越来越多的研究集中在使用纳米颗粒作为载体来增强药物的抗菌效果，包括环丙沙星，但关于SLN搭载环丙沙星的研究较少，用于临床的研究更是少之又少。
搅拌速度是影响粒径的重要因素，如果搅拌速度过慢，粒径具有增大的趋势，放置后稳定性较差；速率过快，在乳化的过程当中，产生泡沫较多，容易外溅，增加损耗，影响了表面活性剂的乳化效果，故本实验采取1200r/min[23]。低温固化过程，降温必须迅速，否则易导致不能瞬时固化，使纳米粒具有一定的软黏性，在相互碰撞的过程中易粘连，使粒径增大且易沉降。
本研究使用SLNs搭载环丙沙星。在确认设计方案后，进一步对纳米体系表征。SLNs-CIP的粒径是(171±11.4) nm。它大于TEM扫描结果。可能是因为TEM实在干燥情况下测得的；DLS是在潮湿状态下测得的[14]。Zeta电位是(-21.8±1.3) mV，根据双分子层原理，Zeta电位的大小与纳米粒体系的稳定性密切相关，Zeta电位控制在-20～-45mV能够得到稳定的SLNs，CIP-SLNs所带电位符合要求，该电位保证纳米粒产生排斥效应，防止聚集，并增加稳定性。此外，UV-VIS分析说明，环丙沙星在合成过程中波峰特征未改变，保持了完整性，并被包裹到纳米粒中。同CIP相比,SLNs-CIP在PBS中具有更好的分散性。体外缓释显示，CIP-SLNs可持续释放至72h。并呈双相模式，初始的突释可能源于纳米粒表面的环丙沙星，此后的缓释源于纳米颗粒内药物扩散导致的缓慢而均匀的释放。在实践中两者均具有重要意义，突释可以尽快达到血药浓度。CIP-SLNs的载药率和包封率均达到要求。
大肠杆菌ATCC29522体外抑菌试验表明，CIP-SLN的MIC低于CIP。CIP的MIC是1.6μg/mL，这同既往研究结果一致[24]。然而CIP-SLN的MIC是0.8μg/mL，显示固体脂质纳米粒提高了环丙沙星的抑菌效果。
本研究成功制备了CIP-SLNs纳米颗粒，初步研究了其抑菌效果，但具体的机制还有待进一步研究。
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