组织形态学染色方法有助于在微观下研究组织形态[1]，对牙根生长发育阶段的研究十分重要。目前，最常用的染色方法是H-E染色，该染色方法技术成熟，已广泛应用于组织学研究中，但其在运用过程中仍有缺陷，如对组织间隙的染色弱、H-E试剂容易产生沉淀而影响染色结果等[2]。除H-E染色外，Masson染色法及Gomori染色等方法也广泛应用于组织学的研究，其中Masson染色法常用于胶原纤维及骨组织的染色[3-5]，而Gomori染色法能将口腔组织染成对比鲜明的红绿色[6]。
小鼠下颌第一磨牙牙根从出生后第5天(PN5)开始发育，到出生后第21天(PN21)牙根发育基本完成，在这一过程中，牙根及其相关牙周组织发生了一系列的变化[7]。为了更好的观察到其细致精确的组织学改变，此次研究选取处于牙根不同发育时期的ICR小鼠下颌第一磨牙作为研究对象，采用上述3种染色方法染色，比较其在牙体硬组织、牙周膜胶原纤维、牙槽骨等组织的染色效果，为研究不同发育阶段牙根选择合适的染色方法提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物与材料
实验所用ICR小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司；H-E试剂盒(KGA 224)、Masson染色试剂盒(KGMST-8003)购自江苏凯基生物技术有限公司；天青石蓝B、甘油、磷钨酸、冰醋酸、甲基绿、苏木精染液购自美国Sigma公司；硫酸铁铵购自成都麦卡希试剂公司；蒸馏水、变色酸2R购自上海阿拉丁科技股份有限公司。Gomori染液的制备如下。(1) 天青石蓝染液： 天青石蓝B 0.5g，硫酸铁铵5g，甘油14mL，蒸馏水100mL，将硫酸铁铵溶于蒸馏水中，放置24h后加入天青石蓝，稍加温水煮沸，冷却后过滤再加甘油；(2) 变色酸染液： 变色酸2R 0.8g，磷钨酸1g，冰醋酸1mL，蒸馏水100mL；(3) 甲基绿染液： 甲基绿0.5g，蒸馏水100mL。
主要实验器材： 组织处理仪(STP 120)购自美国Thermo Fisher公司；石蜡包埋机(LEICA EG1150H)、石蜡切片机(LEICA RM2235)、烤片机(LEICA HI 1220)购自德国Leica公司，采用日本Olympus光学显微镜采集系统采集图片。
1.2 标本制备
以小鼠出生当日早晨定为0d(postnatal day 0, PN0)，分别选取PN5, PN7, PN14, PN21的小鼠各3只，乙醚麻醉后断颈处死，分离下颌骨，用PBS冲洗3次后，置于4%多聚甲醛固定液(pH=7.4)中室温固定24h，10%EDTA脱钙液中脱钙，使用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成5μm厚的冠状组织学切片，4℃下保存备用。
1.3 H-E染色法
常规方法脱蜡至水，滴加苏木精染液染色5min，水洗，返蓝10min，滴加伊红染液20s，水洗2～3s，冲洗掉多余染液后放入梯度乙醇中脱水，置于二甲苯中，封片[6]。
1.4 Masson染色法
切片脱蜡至水，滴加1滴苏木精染色液,染色10min，冲掉染液后流水冲洗5min，滴加1滴复合染色液，染色5min,冲掉染液后滴加1滴磷钼酸40s,甩干后滴加苯胺蓝染液2min，冲掉染液放入60°C烘箱烘干，封片[2]。
1.5 Gomori染色法
常规方法脱蜡至水，用天青石蓝染液染色10min，水洗，再用明矾苏木精染液染核，水洗，盐酸乙醇分化，显蓝。变色酸2R染液染色5min，2%冰醋酸水溶液冲洗3次,观察牙本质以及牙骨质等密质骨呈红色且其他部分无色后，使用亮绿染液复染1min。使用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片[6]。
2 结 果
2.1 PN5时小鼠下颌第一磨牙切片3种染色法效果比较
小鼠下颌第一磨牙在PN5时，其牙冠不断发育，牙冠硬组织继续生成，从牙尖向牙颈延伸，开始形成上皮根鞘(Hertwig’s root sheath，HERS)[8]。3种染色法均可观察到牙釉质、牙本质、前期牙本质、成釉细胞、成牙本质细胞以及HERS等结构，见图1。H-E染色结果显示： 各类细胞以及HERS的形态清晰，细胞核呈鲜明的蓝紫色，牙釉质、牙本质、前期牙本质三者分界明显。Masson法结果显示： 图片色彩鲜艳，牙釉质被染成鲜红色，牙本质呈蓝色，提示其富含胶原。HERS明显，牙槽骨清晰可见，包绕整个牙胚，较其他两者更为清晰，但成釉细胞与成牙本质细胞形态不太清晰。Gomori染色法结果显示： 牙釉质与牙本质层次分明，牙釉质被染成暗红色，牙本质呈蓝灰色，但各类细胞的形态不够清晰，细胞核呈单一的蓝黑色。
图1 小鼠PN5时下颌第一磨牙3种方法染色结果
Fig.1 The result of the mandibular first molar
root in postnatal day 5 mice by three
different staining methods
P： 牙髓，A： 成釉细胞，O： 成牙本质细胞，E： 牙釉质，D： 牙本质，HERS： 上皮根鞘；放大200倍选取的范围为放大100倍中的方框处
2.2 PN7时小鼠下颌第一磨牙发育形态学比较
小鼠的下颌第一磨牙在PN7时，牙冠发育已经完成，颈环游离端的内外釉上皮细胞增生成双层细胞的HERS。根鞘内层细胞诱导牙乳头细胞分化，使得HERS不断生长，实现牙根的形成[9]。在该时期，H-E染色、Masson法、Gomori染色结果与PN5时期基本相同。Mason法总体染色效果较其他两种方法好，牙釉质、牙本质以及前期牙本质层次分明，色彩鲜艳，特别是包绕牙胚的牙槽骨轮廓清晰可见，但成牙本质细胞与成釉细胞形态在H-E染色中最为清晰，见图2。
图2 小鼠PN7时下颌第一磨牙3种方法染色结果
Fig.2 The result of the mandibular first molar root in
postnatal day 7 mice by three different staining methods
P： 牙髓，A： 成釉细胞，O： 成牙本质细胞，E： 牙釉质，D： 牙本质，HERS： 上皮根鞘；放大200倍选取的范围为放大100倍中的方框处
2.3 PN14时3种染色法效果比较
小鼠下颌第一磨牙在PN14时，随着HERS不断生长，牙根继续发育，逐渐形成牙髓腔的形态，同时，在牙本质增厚的过程中，根鞘变性中断，根鞘细胞进入牙囊中，牙囊细胞再移向根部牙本质，与牙本质接触后，分化为成牙骨质细胞，分泌牙骨质基质，矿化形成牙骨质[10]。这一阶段是牙周组织形成的关键时期，组织学着重观察其HERS以及牙骨质、牙周膜韧带和支持性牙槽骨等。
在3种染色方法结果中，牙釉质因为脱钙，不能观察到。H-E染色结果显示： HERS细胞形态清晰，牙周膜成纤维细胞及牙槽骨清晰可见，但胶原纤维形态不够分明。Masson染色结果显示： HERS比较直观；牙周胶原纤维排列整齐、规则；牙槽骨形态也比较清晰，与周边玫瑰红的肌肉组织界限分明，与H-E染色相比效果更好，但牙周膜成纤维细胞染色效果较差。Gomori染色效果是三者中最差的，细胞形态与组织结构层次均不清晰，见图3。
图3 小鼠PN14时下颌第一磨牙3种方法染色结果
Fig.3 The result of the mandibular first molar
root in postnatal day 14 mice by three
different staining methods
HERS： 上皮根鞘，AB： 牙槽骨，PDL： 牙周纤维，P： 牙髓，D： 牙本质；放大200倍选取的范围为放大100倍中的方框处
2.4 PN21时3种染色法效果比较
小鼠的下颌第一磨牙在PN21时，牙根发育基本完成，牙齿已经萌出[11]。在3种染色方法结果中，牙釉质因经脱钙处理，无法被观察到；该时期牙骨质和牙本质分界不清；但牙槽骨、牙周纤维及牙骨质三者界限分明。H-E染色结果显示： 牙本质与牙骨质呈淡粉红色，牙周组织中，牙周膜纤维细胞呈梭形排列，牙周纤维形态清晰但对比度不强。Masson染色结果结果显示： 牙本质呈靛蓝色，牙周组织中胶原纤维排列规则整齐，但牙周膜成纤维细胞形态不清。Gomori染色结果中，牙本质、牙骨质以及牙槽骨染色呈灰色；牙周组织中，成纤维细胞核形态清晰，但胶原纤维排列不够清晰，见图4。
3 讨 论
牙齿的生长发育是一个十分复杂的过程。研究[12-13]表明，哺乳类动物的牙齿发育是牙源性上皮与牙源性间充质相互作用的结果。有关牙齿的生长发育国内外学者已经做了大量的研究，但多集中在牙齿开始发育到牙冠发育成熟，对牙根发育的研究相对较少，且对于牙根的研究相对集中于牙周纤维、HERS和上皮剩余等组织[14]。当牙冠发育即将完成之时，成釉器的内釉上皮和外釉上皮在颈环处增生，向未来根尖孔方向生长，形成称为HERS的双层组织，从而启动了牙根发育[15]。本研究通过比较H-E染色法、Masson法和Gomori染色法在小鼠磨牙牙根不同发育阶段的染色效果，筛选出不同组织在不同时期中最优的染色结果，这对系统而全面的研究牙根发育形态学具有重要的意义。
图4 小鼠PN21时下颌第一磨牙3种方法染色结果
Fig.4 The result of the mandibular first molar
root in postnatal day 21 mice by three
different staining methods
AB： 牙槽骨，PDL： 牙周纤维，RD： 根部牙本质，P： 牙髓，D： 牙本质；放大200倍选取的范围为放大100倍中的方框处
在这3种方法中，H-E染色方法简便，但它只能简单将细胞核和细胞质染成紫蓝色与粉红色。且伊红染液若不能熟练掌握染色时间，可能会导致染色偏红。Masson法虽然相对复杂，但能够根据组织的密度不同，将牙齿的牙本质、牙釉质、牙骨质以及牙槽骨等组织的形态进行鲜明的对比。实验结果中，牙本质、牙周膜纤维和牙槽骨因富含胶原，被染成靛蓝色，细胞核呈蓝紫色。与H-E染色法相比，Masson染色不会出现染色过度的情况，切片图像更为清晰，且3种颜色使图片更加鲜艳。与H-E及Masson染色法比较，Gomori染色法成本便宜且染液保存时间较长。Gomori染色法为两步染色，先用天青石蓝和明矾苏木精染核，再以变色酸2R和亮绿两种染液分别将相应的组织和细胞成分有选择地染成红色及绿色。结果展示出牙釉质呈暗红色，牙本质、牙骨质及牙槽骨呈灰色，细胞核呈蓝黑色，牙髓及牙周纤维呈水绿色。
从3种染色方法的效果来看，H-E染色细胞形态较为清晰，细胞核与细胞质层次分明，但牙齿硬组织以及牙周组织层次感不强，适合于成牙本质细胞、成釉细胞以及HERS的细胞形态的观察。与其相比，Masson法中牙釉质、牙本质、牙周纤维、HERS以及牙槽骨的形态最明显，特别使富含胶原成分的组织染色明显，该结果与韩天龙等[2]的实验结果相一致，适合牙根发育过程中硬组织以及牙周相关组织的组织学研究。Gomori染色中细胞核的形态比较明显，但牙齿硬组织以及牙周组织的界限不够清晰，且此方法易出现染色不均匀，某些组织染色过深等问题，故在牙根、牙骨质发育时期不建议使用Gomori染色。综上所述，上述3种染色方法各有优缺点，研究人员可根据研究需要，选择最合适的染色方法。
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