CBD的氨基酸序列TKKTLRT是胶原酶酶解Ⅰ型胶原蛋白的识别序列，能特异性地与Ⅰ型胶原上的α2链结合。Ⅰ型胶原蛋白是目前最广泛使用的天然植入材料之一，通过将CBD序列重组到蛋白类药物上，使重组药物可以吸附在Ⅰ型胶原蛋白上，形成药物缓释系统，将蛋白类药物缓慢释放到局部环境中[2-4]。因为Ⅰ型胶原蛋白是哺乳动物体内含量最高的蛋白，也有报道直接将重组蛋白直接注射到组织内，依靠自体胶原蛋白达到缓释的效果[3,6]。
IL-4是20世纪80年代发现的一类多功能多效应细胞因子，一直以来都是研究的热点。它由激活的T细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞产生，并对感染性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病和肿瘤等疾病发挥积极的治疗作用。IL-4还可以激活巨噬细胞朝着M2的方向分化，而M2巨噬细胞具有降低局部炎症，促进组织修复的功能[9-10]。本研究构建了pET-30a-IL-4-CBD-His Tag质粒载体，并通过组氨酸标签纯化了IL-4-CBD-His Tag蛋白，经与天然的IL-4对比，证实其具有正常的细胞活性，并具有胶原依赖的缓释功能。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒pET-30a(+)为实验室自有；大肠杆菌BL21购自天根生化科技有限公司(货号： CB105)；限制性核酸内切酶NdeⅠ和EcorⅠ从New England Biolabs公司购买获得；同源重组试剂盒HieffCloneTM Plus One Step Cloning Kit购自上海翊圣生物科技有限公司(货号： 10911)；质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、DNA片段纯化试剂和蛋白分子量标准Marker均购自宝日医生物技术(北京)有限公司。His60镍柱购自GE医疗集团；qPCRmix购自Roche公司；Ⅰ型胶原蛋白溶液购自索莱宝科技有限公司(货号: C8062)；Ⅰ型胶原蛋白膜购自贝迪生物工程股份有限公司；商业化的IL-4购自R&D Systems公司(货号： 404-ML)
1.2 方法
1.2.1 克隆载体的构建 按照大肠杆菌密码子的偏爱性，在不改变IL-4氨基酸序列的前提下，对GenBank中的小鼠IL-4核苷酸序列(NM_021283)进行密码子优化，然后委托苏州金唯智生物科技有限公司合成核苷酸序列。
依次以F1和R1、F1和R2、F1和R3为引物对进行三轮PCR扩增，获得具有pET-30a(+)同源序列的IL-4-CBD-His Tag扩增产物，引物序列如下。F1: 5′-AGAAGGAGATATACATATGCATATTCATGGCTG-CGATAAAAACC-3′；R1: 5′-GGTACGCAGGGTT-TTTTTGGTGTGATGGCTATAATCCATCTGCATA-ATGCT-3′；R2: 5′-TCATTAGTGATGGTGATGGT-GGTGGGTACGCAGGGTTTTTTTGGTGTG-3′；R3: 5′-ACGGAGCTCGAATTCGTCATTAGTGATGGTG-ATGGTGGTGG-3′。
同时，依次以F1和R4、F1和R3为引物对进行两轮PCR扩增，获得带有pET-30a(+)同源序列的IL-4-His Tag扩增产物，以其作为无CBD序列的对照组。R4的引物序列为5′-TCATTAGTGATGGTGAT-GGTGGTGGCTATAATCCATCTGCATAATGCT-3′。
采用TaKaRa片段回收试剂盒分别对IL-4-CBD-His Tag和IL-4-His Tag扩增产物进行纯化，采用限制性核酸内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ对原核表达载体pET-30a(+)进行双酶切，采用DNA凝胶回收试剂盒对双酶切载体进行电泳分离和切胶回收纯化。分别将IL-4-CBD-His Tag和IL-4-His Tag与双酶切载体进行同源重组，构建分别表达IL-4-CBD-His Tag和IL-4-His Tag的重组载体。随后，经转化、挑取单克隆、测序等步骤，验证重组载体是否克隆正确。
1.2.2 重组蛋白的表达与纯化 将测序验证正确的载体转化进大肠杆菌BL21进行表达。挑取单克隆，接种到2mL LB培养基，37℃培养12h后将细菌转移到新的200mL LB液体培养基中继续培养，待吸光度值达到约0.6，加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，诱导12h后,8000r/min，离心半径10cm,4℃离心15min，收集菌体。40mL含终浓度0.5% Triton×100和1mmol/L PMSF的预冷PBS重悬菌体，超声碎菌后，8000r/min 4℃离心15min，收集沉淀，加入镍柱纯化的binding buffer(20mmol/L Na3PO4、500mmol/L NaCl、10mmol/L 咪唑、6mol/L盐酸胍pH 8.0)5mL重悬沉淀，室温孵育30min,8000r/min，4℃离心15min，收集上清液，进行镍柱纯化操作，所使用的washing buffer成分为20mmol/L Na3PO4、500mmol/L NaCl、20mmol/L咪唑和6mol/L盐酸胍，Elution buffer成分为20mmol/L Na3PO4、500mmol/L NaCl、500mmol/L咪唑和6mol/L盐酸胍。将洗脱下来的目的蛋白装在截留分子质量8000的透析袋中进行透析。透析液为含有1mmol/L GSH、0.1mmol/L GSSH和4mol/L盐酸胍的PBS缓冲液，逐渐降低盐酸胍的浓度进行梯度复性，最后的透析液换成PBS。复性后，2000r/min 4℃离心15min去除未复性成功的沉淀物，上清中即是目的蛋白。
1.2.3 IL-4的生物活性检测 使用预冷的含2%胎牛血清(FBS)的PBS从C57小鼠的股骨和胫骨中冲出骨髓细胞，红细胞裂解液去除红细胞，以每孔1×106细胞的量接种在6孔板中，所用培养基为Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)+10% FBS+1%双抗(青霉素链霉素混合液)+15% L-929细胞上清(含有巨噬细胞集落因子MCSF)，第4天换液去除未贴壁细胞，第7天获得成熟的巨噬细胞。将培养板分成3组分别加入终浓度20pmol/L IL-4-CBD-His Tag、IL-4-His Tag和商业化IL-4。24h后收集细胞，提取RNA，采用qPCR实验检测M2巨噬细胞ArgI、Egr2和CD38基因的表达。同时收集细胞上清，检测M2巨噬细胞IL-10的分泌量。
1.2.4 胶原蛋白对CBD-IL-4的吸附实验 在IL-4的吸附效果分析实验中，对夹心法ELISA进行了改进。首先，将Ⅰ型胶原蛋白铺在96孔板中，使其在孔底形成一层薄膜，重组蛋白在与胶原膜孵育后，被吸附在胶原膜上的IL-4能够与生物素化的IL-4抗体结合，经过酶联反应，吸附的IL-4的信号被放大，通过酶标仪在450nm波长处检测吸光度。根据吸光度值可间接确定吸附在胶原膜上的IL-4的量。
具体步骤为： 将0.01mg/mL鼠尾Ⅰ型胶原蛋白溶液以每孔100μL的量加入96孔板中，放置过夜后倒出溶液，PBS洗3次后，每孔加入含3%FBS的PBS，37℃孵育1h,随后加入梯度稀释的CBD-IL-4-His Tag、IL-4-His Tag和CBD-His Tag 100μL,37℃孵育1h后，倒掉溶液并用PBS洗5次，随后采用小鼠IL-4 ELISA检测试剂盒检测IL-4的含量。
1.2.5 IL-4-CBD-His Tag缓释实验 首先对胶原蛋白膜进行交联以增加其韧性和硬度，避免在长期浸入到水中时发生溶胀。将胶原蛋白膜剪成0.4cm×0.4cm的方形，浸到4mL含有1mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.6mg/mL N-羟基丁二酰亚胺的MES(pH 6.5)缓冲液中进行交联，37℃孵育4h后，使用4mol/L NaCl和去离子水洗涤1h，随后在冻干机中冻干。将10μL 5μmol/L的CBD-IL-4-His Tag和IL-4-His Tag分别滴到胶原蛋白膜上，37℃静置30min让溶液完全吸收，加入1mL PBS,放置于转速为100r/min、37℃摇床中，每隔12h更换一次PBS，最后ELISA检测每次更换下来的PBS中含有的IL-4的量。
1.3 统计学处理
所有数据处理通过GraphPad Prism完成，采用t检验分析差异。P<0.05为差异有统计意义。
2 结 果
2.1 载体构建与重组蛋白表达纯化
通过在PCR引物上引入pET-30a(+)同源序列和CBD-His Tag或His Tag，分别获得了具有pET-30a(+)同源臂的IL-4-CBD-His Tag及IL-4-His Tag片段，在同源重组酶的作用下，顺利重组到pET-30a(+)载体上，测序验证重组载体构建成功。结构示意见图1。
图1 质粒结构示意图
Fig.1 Schematic representation of the expression plasmid
在蛋白表达阶段，根据已有的文献数据[13-14]，IL-4将在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，所以我们使用盐酸胍将包涵体变性，并在变性状态下过镍柱对目的蛋白进行纯化，随后梯度降低盐酸胍的浓度，在4℃环境中缓慢使用蛋白恢复活性。同时，1mmol/L GSH、0.1mmol/L GSSH也被加入到透析液中以促进IL-4恢复到正常的构象，最后用PBS对目的蛋白进行透析。纯化的IL-4-CBD-His Tag和IL-4-His Tag蛋白样品经过SDS-PAGE凝胶电泳后，通过考马斯亮蓝G-250染色，结果显示，纯化的蛋白为一条带，见图2。
图2 重组蛋白的表达与纯化
Fig.2 Recombinant protein expression and purification
M： 蛋白分子量标准Marker；1，4： 大肠杆菌总蛋白；2，5： 经IPTG诱导后大肠杆菌总蛋白；3，6： 纯化后的蛋白条带；实心箭头和空心箭头分别指IL-4-His Tag和IL-4-CBD-His Tag
2.2 IL-4重组蛋白活性分析
qPCR数据表明，IL-4-CBD-His Tag、IL-4-His Tag能显著提高ArgI基因、Egr2基因的表达量，同时下调CD38基因的表达量。另外，在CBD-IL-4-His Tag、IL-4-His Tag的诱导下，巨噬细胞分泌的IL10显著提高，见图3。同时加入商业化的IL-4作为阳性对照，结果表明通过大肠杆菌重组表达纯化的IL-4-CBD-His Tag和IL-4-His Tag与商业化的IL-4具有相似的生物活性。
2.3 IL-4吸附与缓释效果分析
随着IL-4-CBD-His Tag浓度的增加，吸光度逐渐增加，并在60nmol/L时达到饱和。与之对比，不带有CBD序列的IL-4-His Tag虽然也会随着浓度的增加吸光度也会增加，但增加的值要显著低于IL-4-CBD-His Tag，见图4。因为吸光度能间接表明吸附在Ⅰ型胶原蛋白膜上IL-4的量，所以结果表明CBD序列能显著提高Ⅰ型胶原蛋白对IL-4的吸附水平。以CBD-His Tag为对照，CBD序列及His Tag序列不会对吸光度产生干扰。
缓释试验中，IL-4-His Tag因为没有CBD对胶原蛋白的锚定，在短期内大量释放到PBS中,而可以吸附在Ⅰ型胶原蛋白上的IL-4-CBD-His Tag则可以缓慢释放，见图5。
图3 IL-4-CBD-His Tag活性测定
Fig.3 Test of IL-4-CBD-His Tag bioactivity
A-C: qPCR检测Egr2基因、CD38基因、ArgI基因的相对表达量；D: 细胞上清液中IL10的分泌量测定
图4 Ⅰ型胶原蛋白对IL-4的吸附实验
Fig.4 Type I Collagen-binding assay
图5 缓释实验
Fig.5 Sustained release assay
3 讨 论
在IL-4的表达阶段，尽管我们尝试改变诱导剂IPTG的浓度和降低诱导温度，最终IL-4依然是以包涵体的形式表达出来。参阅相关的文献[11-12]，本研究采用在变性的条件下使用镍柱纯化目标蛋白，再通过梯度降低变性剂盐酸胍的浓度，缓慢让IL-4复性，同时加入GSH和GSSH以提高IL-4的复性效率。在检测IL-4的细胞活性方面，利用了IL-4能诱导M0巨噬细胞分化为M2巨噬细胞的原理，检测了M2巨噬细胞相关基因的表达量以及能分泌IL-10的特点，结果表明经复性得到的IL-4诱导后的巨噬细胞表现出Egr2基因和ArgI基因的表达量上调、CD38基因的表达量下调、对IL-10的分泌增加的特点，这些特点与文献中M2巨噬细胞的特点相符。另外，M0巨噬细胞除了分化为M2细胞外还可能分化为M1巨噬细胞，本研究结果表明经IL-4诱导后的巨噬细胞的Egr2基因上调、CD38基因下调，而这两个基因在M1巨噬细胞中呈相反的表达趋势[13]，进一步证实最后经IL-4诱导的M0巨噬细胞只分化为M2巨噬细胞。吸附和缓释实验结果也证明了通过大肠杆菌表达纯化的IL-4恢复成了正确的分子构象。
虽然IL-4的表达纯化技术已经很成熟，也已经有了商业化的IL-4，但本研究创新性的通过基因重组的方法将胶原吸附序列CBD与IL-4整合在一起，使IL-4具有了缓释的功能。缓释功能的存在可以克服生物体内液体环境的流动性，避免局部药物浓度随着体液的流动快速下降，同时可以避免药物崩解带来的局部刺激等不良反应。
目前药物缓释技术多是通过将药物包埋或吸附在纳米微球上，随着微球的降解，药物被缓慢释放到局部环境中。微球的来源主要分为两类： 天然来源(如壳聚糖、淀粉、海藻酸盐等)和人工合成(如聚酯、聚酰胺、聚磷酸脂等)，这些材料因为生物相容性不高往往会引起炎症反应。而本研究中药物缓释依赖的材料为Ⅰ型胶原蛋。Ⅰ型胶原蛋白因为其低致敏性和生物可降解性，已经广泛应用到止血海绵、人工硬脊膜、脊髓支架材料和骨修复材料等领域。而且，Ⅰ型胶原蛋白具有其独特的生物学优点，比如信号中继、引导组织生成、止血、组织修复等，相信随着Ⅰ型胶原蛋白研究的深入，越来越多的Ⅰ型胶原蛋白材料会应用到生物体内,这些研究大大提高了本研究的适用范畴。
IL-4作为一类多效应的免疫抑制因子，通常以JAK-STAT、Ras-ERK、PI3K-PKB这3种信号通路发挥其生物学效应。近年来，其越来越多新的生物学功能被发掘出来比如介导脂类和糖代谢、皮肤修复、抗击肠道寄生虫、控制肠道感染等。另外，文献报道IL-4在脑出血和脊髓损伤等神经系统损伤中，也具有积极的治疗效果[14-15]。但是,由于血-脑屏障的存在[16]，静脉或口服给药很难在脑或者脊髓中达到有效浓度。颅内或者髓鞘直接给药，不仅可能造成二次损伤，而且因为脑脊液的流动性，局部药物浓度很难维持。本研究通过基因工程方法重组的可缓释IL-4-CBD-His Tag，有望克服上述难题。另外,在慢性炎症控制、组织修复领域，本研究也有潜在的应用价值。
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