富血小板纤维蛋白(platelet rich fibrin, PRF)为第二代血小板浓缩物，与第一代的富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)相比，其制备方法简单，不需要添加抗凝剂，只需一次离心即可得到，离心后介于上清液与红细胞之间的纤维蛋白凝胶即为PRF[1]。Dohan等[2]发现，PRF中含大量血小板，激活后可释放生长因子发挥生物学作用，这些生长因子包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、血小板源性生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)等。研究[3-4]发现，PRF可促进骨再生，对骨缺损修复和软组织愈合有一定作用。PRF来源于自体血液，避免了移植时交叉感染的发生。但目前对PRF形态学超微结构及其意义未见报道，因此本研究对此进行了深入探讨，为PRF在骨缺损修复中的基础研究和临床应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验对象
取10名健康志愿者(男性6名，女性4名，海军军医大学附属长海医院职工和实习生)，年龄22～50岁，平均年龄(30.20±1.22)岁，静脉血血小板计数>100×109/L。采血前1周不吸烟、不喝酒，采血前3个月未服用任何影响血小板功能和调节免疫的药物，所有志愿者知情并同意采血用于本试验。
1.2 主要材料和仪器
无抗凝剂真空采血管购自中国武汉致远医疗科技有限公司；湘仪L500医用离心机购自中国长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；BC-5380 Mindray全自动血液细胞分析仪购自中国深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；Olympus CX31光学显微镜购自日本Olympus公司；S3400N扫描电镜购自日本HITACHA公司；JEM-1230透射电镜购自日本电子株式会社。
1.3 PRF制备方法
用真空玻璃管抽静脉全血5mL，立即放于离心机中离心(离心半径10cm，3000r/min，离心10min)，静置3～5min[1]，此时离心管内分为3层，最上层为上清液，最下层为红细胞，中间为淡黄色凝胶层即为PRF。用无菌镊子取出保留红色末端的PRF凝胶分别用10%甲醛固定和4%多聚甲醛固定用于实验。另采集2mL静脉血置于含肝素抗凝管中，用全自动血细胞分析仪测定血常规。因PRF制备中不含抗凝剂，血液一旦接触离心管即开始凝集，要求快速采血并立即离心[5]。
1.4 PRF光学显微镜观察
用10%甲醛固定PRF,乙醇梯度脱水，沿组织长轴方向用石蜡包埋后切成厚约5μm切片，常规H-E染色和瑞士-吉姆萨染色，光学显微镜下观察PRF结构并拍照。
1.5 PRF扫描电子显微镜观察
4%多聚甲醛固定PRF 2h，浸泡0.1mol/L PBS中24h，用PBS漂洗PRF 6min，共5次(pH=7.2)；30%、50%、70%、90%的丙酮各脱水30min,再用100%丙酮脱水10min，共3次，CO2临界点干燥，金离子溅射法镀膜，S-3400N扫描电子显微镜观察并采集图像。
1.6 PRF透射电子显微镜观察
4%多聚甲醛固定PRF 2h；浸泡于0.1mol/L PBS中24h，以0.1mol/L的PBS漂洗6min共5次，加入1%锇酸固定2h，用PBS漂洗6min共5次，分别用30%、50%、70%、90%的丙酮梯度脱水30min,用100%丙酮10min 3次，用环氧丙烷和EPON以3∶7比例渗透2h,以7∶3比例渗透过夜，用100%的EPON渗透2h,用EPON包埋液在60℃聚合48h，用德国LKB8870超薄切片机切片，厚度500nm,醋酸铀染10min，铅染8min, JEM-1230透射电子显微镜观察并拍照[6]。
2 结 果
2.1 所选志愿者个人特征和主要血液指标
在10名志愿者中，年龄<35岁者占80%，>50岁1名，三酰甘油高；本科以上占70%，吸烟者占20%。所选人群白细胞平均值为(6.29±0.54)×109/L,红细胞为(4.78±0.22)×1012/L，血小板为(201.7±5.16)×109/L，见表1。
表1 10例志愿者主要血液指标
Tab.1 Main blood indexes of donors
2.2 大体观察
PRF为淡黄色半透明纤维蛋白凝胶，5mL血液得到PRF约1.5cm×0.8cm×0.8cm,有弹性且质韧，表面光滑，见图1。
图1 PRF的制备
Fig.1 Platelet rich fibrin production
A： 全血离心分为3 层，中间淡黄色层为PRF凝胶；B： 取出的PRF
2.3 光镜观察 H-E和吉姆萨染色结果
PRF含大量红细胞和蓝染细胞核的白细胞镶嵌在胶原纤维之中，胶原纤维为均一淡红色，见图2A。油镜见在近细胞端纤维排列较致密，含大量血小板，见图2B；在远离细胞一端淡红的纤维排列为较疏松网状结构，血小板较少，见图2C。
吉姆萨染色见胶原纤维排列为淡蓝色的网状结构，近细胞端见深蓝色的白细胞；远离细胞区为无细胞网状胶原纤维,见图3。
2.4 SEM观察结果
PRF中胶原纤维聚集成疏松多孔立体网状结构，含大量血小板，部分血小板伸出多个伪足，见白细胞散在分布；远端胶原纤维排列成网状立体支架结构中血小板和白细胞少，见图4。
图2 PRF的H-E染色结果
Fig.2 H-E staining results of PRF
A： 在红细胞上部为蓝染核的白细胞，再上部为胶原纤维(×400);B： 在网状排列的纤维中有血小板(×1000)；C： 排列稀疏的纤维中血小板少(×1000)
图3 PRF的吉姆萨染色结果
Fig.3 Gimsa staining results of PRF
A： 近细胞端在墨绿色的红细胞上部为白细胞，淡蓝的为胶原纤维；B： 远离细胞端为蓝色无细胞网状胶原纤维(×400)
图4 PRF的SEM观察
Fig.4 PRF observation by SEM
A： 网状纤维之间大量血小板(×3000)；B： 大量血小板位于胶原纤维之间，左下角见激活血小板(×5000)
2.5 TEM观察结果
PRF中血小板处于静止或激活状态，使α-颗粒释放于细胞间隙或纤维之间，在细胞之间有高密度的颗粒样物为血小板释放的颗粒，见图5。
图5 PRF的TEM观察
Fig.5 PRF observation by TEM
A： 白细胞周围可见血小板及颗粒样物质(×10000)；B： 血小板部分激活，部分静止，颗粒样物位于血小板内或细胞之间(×6000)
3 讨 论
近年来，对自体血液成分处理对手术中血液保护作用及与再生医学关系有许多研究报道[1-5，7]。2010年，Dohan等[8]报道，PRF中血小板释放生长因子可促进细胞增殖和分化，对血管再生和骨缺损修复有一定作用。而血小板释放生长因子需要血小板活化来完成，血小板活化是细胞膜受外界刺激，膜受体活化胞内钙释放，引起构型改变。PRF移植后血小板激活主要靠机体自身使血小板碎裂完成对生长因子释放。PRF在离心时自体凝血酶使纤维蛋白原凝结为疏松纤维蛋白，并聚集了大量白细胞和血小板[1-3]。对PRF提取方法，程亚楠等[9]发现在2500r/min与3000r/min 离心时，可制备出理想的PRF。本研究用3000r/min离心成功制备了PRF，对其形态学研究发现，PRF的纤维蛋白排列成疏松立体网状结构，并聚集了大量血小板，电镜观察发现血小板激活伸出突起，活化的血小板内α-颗粒释放到细胞和纤维之间形成密集区，与Dohan等[2]报道一致。
本研究通过光镜观察发现，PRF含有大量白细胞，使其有抗感染和免疫功能。Dohan等[3]报道，PRF析出液中有5种免疫因子，分别为IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4和VEGF，PRF中白细胞可通过分泌细胞因子发挥止血和炎症反应。电镜证实PRF的多孔疏松纤维网状支架结构与人的天然组织结构相似，在组织再生中发挥支架作用，有利于新生细胞迁移长入和增殖[1]。从本研究可知，PRF两端结构有一定差异，在行PRF移植时选取上端无细胞区域时，其作用来自于纤维支架结构；若选取下端富含细胞区域移植时其作用来自于PRF的网状支架及其中血小板释放生长因子的联合作用。Tayapongsak等[10]在下颌骨重建时发现，在骨移植初期移植物内细胞营养物质的摄入主要靠弥散完成。因此在PRF移植时纤维蛋白网状立体结构可使营养成分及氧气弥散至细胞周围，利于骨髓干细胞分化为成骨细胞形成新骨,加速组织再生[11]。
对PRF形态学超微结构观察发现，PRF中血小板伸出多个突起的过程就是血小板激活的过程，α-颗粒性物质释放其实就是生长因子分泌的过程，细胞因子分泌后位于立体网状结构中对新生细胞迁延有重要意义。研究[12-13]发现，PRP联合生物活性玻璃可促进牙周骨缺损修复，PRP联合多孔矿化骨对下颌双皮质骨缺损修复有明显促进作用，且主要发生在PRP移植的早期阶段。PRP作用的发挥与实验中所用的凝血酶有关，血小板中α-颗粒内生长因子短时间内大量释放，引起骨髓干细胞数量短期内迅速上升而发挥作用。Marx等[14]发现，创伤部位血小板可存活5d，后期作用主要依赖于新生骨髓干细胞通过刺激机体自身继续产生生长因子发挥作用。Lundquist等[15]发现，用胰蛋白酶处理PRF可持续释放生长因子和抵抗内源性纤维蛋白酶的蛋白降解作用，可见PRF缓慢释放生长因子与其纤维网状结构中血小板逐渐激活有关。PRF中与纤维蛋白紧密接触的血小板外膜结构部分消失，可能与PRF中未加抗凝剂，纤维蛋白原与血小板表面受体结合产生生物学效应有关[16]。本研究发现，PRF中血小板有的α-颗粒未被释放，被网状纤维紧紧包裹，这些纤维对血小板激活起保护作用，随着纤维蛋白逐渐降解，血小板激活释放生长因子于纤维蛋白支架中，受胶原纤维保护抵抗蛋白降解，延长了生长因子效应时间。
综上所述，PRF为独特三维网状结构，富含血小板和生长因子，为种子细胞提供天然支架和生长环境，且制备简单，是组织再生良好的支架材料，可作为支架材料单独或联合用于骨缺损修复。但PRF生物学作用尚需进一步研究。
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