口腔鳞状细胞癌(oral squamous carcinoma, OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，占全身肿瘤的3%[1]。本课题组前期研究发现转化生长因子β诱导蛋白基因(transforming growth factor beta induced, TGFBI)在OSCC中表达升高[2]。TGFBI是一种由细胞分泌的细胞外基质蛋白,在细胞和基质分子之间充当一种连接蛋白[3]。已有研究报道TGFBI在不同肿瘤中的表达水平不一致，在有些肿瘤例中表达升高，如结肠癌，而在另一些肿瘤中表达降低，如乳腺癌[5]，提示了其功能的复杂性。目前仍没有关于TGFBI对OSCC影响的报道。CRISPR/Cas9技术是近年新兴的基因编辑工具，其易于设计和高度特异性也为准确的进行基因编辑提供了快速有效的方法[6]。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建TGFBI基因敲除的HSC-3细胞系，以便于进一步研究TGFBI在OSCC中的作用及其机制。
1 材料与方法
1.1 细胞和质粒
口腔鳞状细胞癌细胞系HSC-3由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室惠赠。PX330和PGK-puro质粒由同济大学生命科学与技术学院费俭教授惠赠。
1.2 实验试剂
质粒小提试剂盒、割胶回收试剂盒、DNA抽提试剂盒购自TaKaRa公司；RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；BbsI限制性内切酶、T4 DNA连接购自纽英伦生物技术(北京)有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京博迈德公司；LipofectamineTM3000转染试剂购自美国Invitrogen公司；PCR试剂盒、cDNA逆转试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；DMEM培养基、胎牛血清，青/链霉素购自美国Gbico公司；β-actin抗体、TGFBI抗体购自美国Proteintech公司；寡核苷酸单链合成、引物合成和质粒测序由百力格公司服务完成。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养 HSC-3细胞由含10%胎牛血清、1%青/链霉素的DMEM培养基培养，并将培养皿置于37℃，5%CO2的恒温培养箱中。
1.3.2 sgRNA 利用哈佛大学张峰实验室提供的在线设计工具(http：∥crispr.mit.edu/)，根据CRISPR/Cas9靶点设计原则，设计了靶向TGFBI(ENST00000442011.6转录本)外显子3的上下游的一对sgRNA，上游sgRNA(sgRNA1)序列为GGAGG-CAACTTAGTGGAGAG，下游sgRNA(sgRNA2)序列为AGGCTCTATGCGAGGGGCTG。
1.3.3 质粒构建 将经过BbsI酶切的pX330质粒与退火形成双链的sgRNA混合，加入T4连接酶，反应10h。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，通过氨苄抗性涂板筛选，并挑取单克隆,测序鉴定。snapgene_viewer_2.8.3软件分析测序结果，并将获取的正确的质粒分别命名为TGFBI-exon3-sgRNA1和TGFBI-exon3-sgRNA2质粒。
1.3.4 细胞转染和稳定转染细胞克隆挑选 将细胞铺入24孔板中，待细胞密度达80%左右时，按照说明书，用LipofectamineTM3000将TGFBI-exon3-sgRNA1、TGFBI-exon3-sgRNA2和带嘌呤霉素抗性的PGK-puro质粒共转染到HSC-3细胞中。待转染48h后，将细胞传代至10cm细胞培养皿培养，并在待细胞贴壁后加入嘌呤霉素(1μg/ml)进行筛选3d。经过2周的培养后挑选细胞克隆，并扩大培养。
1.3.5 细胞克隆的鉴定 将扩大培养后的细胞克隆根据基因组提取试剂盒说明书提取DNA，并通过PCR扩增指定片段，上游引物序列： 5′-GCAGCCG-CCAGGAGCAT-3′，下游引物序列为： 5′-AAGGGC-CAAGTTTAGACACAGAG-3′。PCR产物经核酸电泳后根据条带初步确定TGFBI敲除克隆，并测序鉴定外显子3是否删除。
1.3.6 稳定基因敲除细胞系的实时荧光定量PCR 采用TRIzol法提取细胞的总RNA，并利用反转录试剂盒反转录成cDNA，用于qRCR分析。扩增TGFBI及其他基因的引物序列以及内参基因β-actin引物序列见表1。RT-qPCR反应体系： SYBRGreen Mix 10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA 2μL，ddH2O 7μL。反应条件： 95℃ 5min；95℃ 15s， 60℃ 15s，72℃ 20s，40个循环。并用2-ΔΔCt法分析基因相对表达情况。
表1 本次研究中合成的寡核苷酸序列
Tab.1 The oligonucleotide sequences synthesized in this study
名称寡核苷酸序列(5′→3′)TGFBI上游引物：TCCGCTAACCAGGATTTCATC下游引物：CCTCCGCTAACCAGGATTTCATCKi⁃67上游引物：AAAAGAATTGAACCTGCGGAAG下游引物：AGTCTTATTTTGGCGTCTGGAGCDK1上游引物：CTCCAGAAGTATTGCTGGGG下游引物：CCAGAAATTCGTTTGGCTGGACDK2上游引物：TTTTGGAGTCCCTGTTCGTAC下游引物：CGAGTCACCATCTCAGCAAAGCDK4上游引物：GGAACAGTCAAGCTGGCTGA下游引物：GGATACATCTCGAGGCCAGTCCNA上游引物：ACAAACTCTGCTACTTCTGGG下游引物：TTCGGGTAGTGGAAAACCAGCCNB上游引物：GCAGAAGATGGAGCTGAT下游引物：ACCAACCAGCTGCAGCATCTCCND1上游引物：CATCTACACCGACAACTCCATC下游引物：TCTGGCATTTTGGAGAGGAAGCCNE上游引物：TCTTGAGCAACACCCTCTTC下游引物：TTCTTGTGTCGCCATATACCGN⁃cadherin上游引物：ACAGCAACGACGGGTTAGTC下游引物：CCTTGGCTAATGGCACTTGAE⁃cadherin上游引物：TGGACAGGGAGGATTTTGAG下游引物：ACCTGAGGCTTTGGATTCCTVimentin上游引物：CGTGAATACCAAGACCTGCTC下游引物：GGAAAAGTTTGGAAGAGGCAGβ⁃actin上游引物：ACCTTCTACAATGAGCTGCG下游引物：CCTGGATAGCAACGTACATGG
1.3.7 基因稳定敲除细胞系的免疫印迹检测 用RIPA提取细胞的总蛋白并用BCA法进行蛋白定量，每个样各取50μg总蛋白，和上样缓冲液混合后煮沸5min变性，完成蛋白样本的制备。将样本进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将蛋白转至PVDF膜上，并用5%脱脂奶粉室温封闭1h。用一抗TGFBI及β-actin抗体在-4℃孵育过夜，之后用相应的羊抗兔或羊抗鼠二抗进行孵育2h，最后用Odyssey双色红外激光成像系统进行扫描观察。
1.4 统计学处理
用SPSS 20.0统计软件对数据进行处理和分析，结果以
表示，组间比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 重组表达载体PX330-TGFBI-sgRNA质粒构建及鉴定
PX330质粒测序结果通过snapgene_viewer_2.8.3软件分析得出的质粒图，包含2个BbsⅠ酶切位点(图1A)。BbsⅠ酶切后回收的空载体分别和sgRNA1、sgRNA2退火后的双链DNA(dsDNA)连接。转化筛选后的克隆经测序分析显示，sgRNA1和sgRNA2序列已经正确插入载体中(图1B、C)，提取质粒后分别命名为TGFBI-exon3-sgRNA1和TGFBI-exon3-sgRNA2质粒。
图1 重组表达载体pX330-TGFBI-sgRNA质粒构建及鉴定
Fig.1 Construction and identification of pX330-TGFBI-sgRNA Recombinant Plasmid
A： 根据pX330测序得出的PX330示意图及BbsⅠ酶切位点细节图；B： sgRNA1已经正确连入pX330载体，命名为TGFBI-exon3-sgRNA1质粒；C： sgRNA2已经正确连入pX330载体，命名为TGFBI-exon3-sgRNA2质粒；以上结果通过snapgene_viewer_2.8.3软件分析得到
2.2 细胞转染及稳定转染细胞株的筛选
将所构建的2个质粒以及带有puro抗性的pGX-puro质粒共同转入HSC-3细胞中，2d后，根据质粒上自带的EGFP观察转染效率，虽然转染效率较低，但的确有部分细胞转染成功(图2A)。用嘌呤霉素筛选挑选6个细胞克隆，提取DNA，PCR后将产物进行核酸电泳，发现6号克隆相对于其他克隆出现了部分核苷酸片段的缺失(图2B)，割胶回收测序发现6号克隆有290个碱基的缺失包括整个外显子3的核苷酸序列(图2C)。根据条带大小初步确定克隆6为TGFBI敲除细胞克隆命名为HSC-3-TGFBI-KO。
图2 细胞转染及稳定转染细胞株的筛选
Fig.2 Cell transfection and screening of the stably transfected cell lines
A： 暗场中少量细胞携带绿色荧光，显示转染成功；B： 挑选细胞克隆的DNA的核酸电泳图显示6号克隆有片段缺失，并将6号克隆命名为HSC-3-TGFBI-KO；C： 测序显示HSC-3-TGFBI-KO相对于HSC-3有290个碱基的缺失，包括整个外显子3序列；图中红色为sgRNA序列，蓝色为外显子3序列，红色下划线标注为PAM序列，“-”标注为缺失序列
2.3 稳定基因敲除细胞株的TGFBI表达检测
将得到的TGFBI稳定敲除细胞培养后提取mRNA和蛋白，通过实时荧光定量PCR和免疫印迹法发现，从mRNA水平上，相对于HSC-3细胞，TGFBI稳定敲除细胞HSC-3-TGFBI-KO的TGFBI表达已经有了大幅度的下调(P<0.001)，而在蛋白水平上，几乎无法在HSC-3-TGFBI-KO上检测TGFBI的表达。结果说明HSC-3细胞TGFBI基因敲除细胞构建是成功的。
2.4 TGFBI敲除引起的相关基因表达改变
通过RT-qPCR检测发现TGFBI敲出后，引起细胞增殖相关的核抗原Ki-67,细胞周期蛋白依懒性激酶1、2、4(CDK1、CDK2、CDK4)，细胞周期蛋白A、B(CCNA、CCNB)，神经性钙黏附素(N-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)的表达下调以及钙黏附蛋白E(E-cadherin)，周期蛋白D1、E(CCND1、CCNE)表达上调(P<0.05)。
图3 稳定基因敲除细胞株的TGFBI表达检测
Fig.3 Detection of TGFBI expression in the stable knockout cell line
A： RT-qPCR显示HSC-3-TGFBI-KO的TGFBI的mRNA表达有了大幅度的下调,*P<0.001；B： 免疫印迹法显示在HSC-3-TGFBI-KO细胞中无法检测到TGFBI蛋白的表达
图4 通过RT-qPCR检测TGFBI敲除
而引起的部分基因表达改变
Fig.4 Detection of the altered genes induced by TGFBI knockout shown by RT-qPCR
结果显示Ki-67、CDK1、CDK2、CDK4、CCNA、CCNB、N-cadherin和Vimentin基因表达下调，而E-cadherin、CCND1和CCNE表达上升；与HSC-3组相比，*P<0.05，**P<0.01
3 讨 论
OSCC属于上皮源性肿瘤范围，其癌变过程复杂，属于多阶段发生的过程，其整个病变过程是受到多种基因调控而完成[7]。随着近年来细胞分子生物学的研究进展，学者们发现肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活相关，细胞的生长、分化和凋亡受到一系列基因的调控，这些基因的序列或表达的变化都会引起组织的生长失控及肿瘤的产生[8-9]。在本课题组前期研究中，通过生物信息学荟萃分析及免疫组织化学的方法发现了TGFBI在OSCC患者中表达升高[2]。转化生长因子β诱导的基因(transforming growth factor-β induced, TGFBI)又被称为BGH3，BIGH3，其蛋白由683个氨基酸组成，相对分子质量为68000，其氨基端为4段肽链组成的同源序列FAS1蛋白功能域；羧基端为精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸组成的RGD模体。TGFBI作为连接整合素与细胞外基质蛋白比如胶原蛋白，层粘连蛋白，纤维连结蛋白的连接蛋白，在胚胎发育、细胞增殖、黏附、迁移、分化和炎症发生中起着一定的作用[3,10,11]。已有文章报道TGFBI作为一个细胞外基质蛋白在结肠癌，食管癌[12]，乳腺癌[13]等肿瘤中异常表达并对肿瘤的发生有着密切关系。本次研究希望能构建能用于研究TGFBI和OSCC之间作用的细胞工具。
CRISPR(clustered regularly interspersed short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)系统广泛存在于微生物界中，比如在细菌中和古生菌[14]。2012年学者在体外实验中发现证实了Cas9蛋白可以与靶向的DNA位点结合起到DNA剪切的作用以来，CRISPR/Cas9基因编辑技术已经获得了重大的发展[15]。Cas9能与特异性的sgRNA形成cas9-sgRNA复合物，靶向目的基因，对其DNA实现特异性的剪切，并进行非同源末端连接修复过程中发生替换、移码、插入或缺失，最终得到基因敲除或失活的目的[16]。与之前主流的基因编辑工具如锌指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)相比，CRISPR/Cas9系统对于载体的构建和基因的编辑更为方便，更有针对性。另外，与siRNA，shRNA等基因沉默方法相比，CRISPR/Cas9技术对于基因的敲除效果更加稳定和彻底[17]。
本次研究利用了CRISPR/Cas9技术构建了TGFBI稳定敲除的HSC-3细胞系。为此设计了针对TGFBI外显子3上下游的2个sgRNA，以PX330为载体构建了重组质粒，共同转入HSC-3细胞中。从得到的HSC-3-TGFBI-KO细胞中发现，TGFBI的整个外显子3序列已被敲除，同时，在mRNA水平上，TGFBI已经有了非常大幅度的下调，而通过免疫印迹法发现HSC-3-TGFBI-KO细胞中已经几乎无法检测到TGFBI蛋白的表达。这些结果表明，构建的TGFBI稳定敲除细胞系是成功的。通过RT-qPCR检测HSC-3-TGFBI-KO和HSC-3细胞中的部分基因表达情况，本研究发现TGFBI敲除后，部分细胞周期蛋白(Cyclin)及周期蛋白依赖性激酶(CDK)表达发生了改变,细胞增殖相关的核抗原Ki-67基因也发生了一定程度的下调，同时神经性钙黏附素、波形蛋白、钙粘附蛋白E等基因也发生了一定程度的改变。周期蛋白及其相关依赖性激酶在细胞周期调控中起到重要作用[18]，而神经性钙黏附素，波形蛋白，钙粘附蛋白E等则在上皮间充质转化中起到重要作用[19-20]。通过以上的实验，本课题组初步猜测TGFBI的异常升高可能会通过细胞周期及上皮间充质转化的调控来影响OSCC的发生发展。
总之，本研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建了TGFBI稳定敲除的HSC-3细胞，为进一步研究TGFBI在OSCC发生发展的作用及其机制研究奠定了基础。
【参考文献】
[1] JEMAL A, BRAY F, CENTER M M, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2)： 69-90.
[2] HE Y, SHAO F, PI W, et al. Largescale transcriptomics analysis suggests over-expression of BGH3, MMP9 and PDIA3 in oral squamous cell carcinoma[J]. PLoS One, 2016,11(1)： e0146530.
[3] THAPA N, LEE B H, KIM I S. TGFBIp/betaig-h3 protein： a versatile matrix molecule induced by TGF-beta[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2007,39(12)： 2183-2194.
[4] ZHU J, CHEN X, LIAO Z, et al. TGFBI protein high expression predicts poor prognosis in colorectal cancer patients[J]. Inter J Clin Exp Pathol, 2015,8(1)： 702-710.
[5] CALAF G M, ECHIBURU-CHAU C, ZHAO Y, et al. BigH3 protein expression as a marker for breast cancer[J]. Inter J Mol Med, 2008,21(5)： 561-568.
[6] ZHANG F, WEN Y, GUO X. CRISPR/Cas9 for genome editing： progress, implications and challenges[J]. Human Mol Genetics, 2014,23： R40-R46.
[7] CHOI S, MYERS J N. Molecular pathogenesis of oral squamous cell carcinoma： implications for therapy[J]. J Dent Res, 2008,87(1)： 14-32.
[8] ALVAREZ-NUNEZ F, MORA J, MATIAS-GUIU X, et al. Thyroid carcinomas of the follicular epithelium： tumor markers and oncogenes[J]. Med Clin (Barc), 2003,121(7)： 264-269.
[9] SAITO S, MORITA K, HIRANO T. High frequency of common DNA copy number abnormalities detected by bacterial artificial chromosome array comparative genomic hybridization in 24 breast cancer cell lines[J]. Hum Cell, 2009,22(1)： 1-10.
[10] KIM J E, JEONG H W, NAM J O, et al. Identification of motifs in the fasciclin domains of the transforming growth factor-beta-induced matrix protein betaig-h3 that interact with the alphavbeta5 integrin[J]. J Biol Chem, 2002,277(48)： 46159-46165.
[11] BAE J S, LEE S H, KIM J E, et al. βig-h3 supports keratinocyte adhesion, migration, and proliferation through α3β1 integrin[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2002,294(5)： 940-948.
[12] MA C, RONG Y, RADILOFF D R, et al. Extracellular matrix protein betaig-h3/TGFBI promotes metastasis of colon cancer by enhancing cell extravasation[J]. Genes Dev, 2008,22(3)： 308-321.
[13] OZAWA D, YOKOBORI T, SOHDA M, et al. TGFBI expression in cancer stromal cells is associated with poor prognosis and hematogenous recurrence in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Ann Surg Oncol, 2016,23(1)： 282-289.
[14] CHARPENTIER E, MARRAFFINI L A. Harnessing CRISPR-Cas9 immunity for genetic engineering[J]. Curr Opin Microbiol, 2014,19： 114-119.
[15] JINEK M, CHYLINSKI K, FONFARA I, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]. Science, 2012,337(6096)： 816-821.
[16] NISHIMASU H. Structure and function of CRISPR-Cas9[J]. Seikagaku, 2015,87(6)： 686-692.
[17] MA Y W, ZHANG L F, HUANG X X. Genome modification by CRISPR/Cas9[J]. Febs J, 2014,281(23)： 5186-5193.
[18] SANTO L, SIU K T, RAJE N. Targeting cyclin-dependent kinases and cell cycle progression in human cancers[J]. Semin Oncol, 2015,42(6)： 788-800.
[19] SCANLON C S, VAN TUBERGEN E A, INGLEHART R C, et al. Biomarkers of epithelial-mesenchymal transition in squamous cell carcinoma[J]. J Dent Res, 2013,92(2)： 114-121.
[20] 张莹,王璐,刘利敏,等.X射线对人三阴性乳腺癌细胞E-钙黏蛋白基因表达的影响[J].同济大学学报(医学版),2016,35(5)： 25-28.