三阴性乳腺癌易复发转移，目前临床缺乏有效的治疗靶点[1]。MicroRNAs(miRNAs)是具有大约22个核苷酸的单链非编码RNA，通过促进靶基因mRNA的降解或抑制翻译而调节靶基因的功能，在细胞的增殖、发育、分化、代谢、凋亡、衰老和肿瘤的发生等多种生物学过程中发挥重要作用[2-3]。多种miRNAs与三阴性乳腺癌(three-negative breast cancer, TNBC)的预后相关，可以作为转移治疗靶点[4]。本课题组前期研究发现，miR-182在三阴性乳腺癌组织中表达上调,与淋巴结转移、临床分期密切相关。miR-182高表达是三阴性乳腺癌独立的预后因素之一，与不良预后相关[5-6]，是潜在的三阴性乳腺癌治疗靶点。有研究[7]发现，FOXF2低表达可导致乳腺肿瘤进展和预后不良，但目前尚未见miR-182与FOXF2的关联性研究。本研究通过生物学信息软件Targetscan(http:∥www.targetscan.org/vert_61/)发现miR-182在FOXF2的3′-UTR端688～695片段和485～491片段有潜在结合位点，为进一步明确miR-182的表达水平与乳腺癌增殖、侵袭的关系，本研究探讨miR-182/FOXF2信号通路在三阴性乳腺癌侵袭及血管生成的意义。
1 材料与方法
1.1 伦理申明
由于本实验涉及人源细胞的采集，因此所有涉及伦理问题的实验操作均报备了上海长宁区妇幼保健院伦理委员会，并已获得伦理委员会批准。
1.2 细胞培养及基因转染
1.2.1 细胞培养 MCF-7和MDA-MB-231细胞株(中国科学院上海细胞库)在37℃含10% CO2细胞培养箱中，用DMEM培养基加10%体积的胎牛血清培养；质粒及miRNA mimic使用LipofectamineTM 2000试剂(Gibco公司)转染。
1.2.2 生物信息学分析 使用在线预测工具miRWalk对可靶向结合FOXF2基因3′-UTR的miRNA进行预测。根据has-miR-182靶点预测信息，将FOXF2基因上的2个预测靶点分别构入荧光素酶报告基因质粒PGL3-3′UTR中，将构建成功的荧光素酶报告基因质粒与miR-182 mimics共转染至低转移乳腺癌细胞系MCF-7，通过酶标仪检测荧光素酶活性是否降低。
1.2.3 质粒构建及Luciferase测试报告实验 将MCF-7细胞接种于48孔板。细胞铺板24h后，使用Poly-Fecter转染试剂进行转染，每孔用量如下： has-miR-182 mimics 100ng，Luc-UTR报告基因质粒100ng，内参Renilla 5ng。以阴性参照siRNA(NC)100ng加Luc-UTR报告基因质粒100ng，内参Renilla 5ng为对照组实验。每组设置3个重复孔。6h后换液；转染48h后裂解细胞，测试luciferase活性。
1.2.4 miRNA靶点突变测试报告及内源基因表达量检测 根据前期miR-182对目的基因FOXF2 3′UTR的测试结果，将包含has-miR-182靶点的FOXF2-U2靶点序列突变，并将构建成功的荧光素酶报告基因突变质粒与miR-182 mimics共转染至低转移乳腺癌细胞系MCF-7，通过酶标仪检测荧光素酶活性是否恢复，进一步明确miR-182的结合位点。MCF-7细胞转染miR-182，对照组转染si-NC。24～48h后提取RNA，通过qRT-PCR检测FOXF2 mRNA表达量变化。
1.3 细胞的CCK-8增殖实验
将MDA-MB-231细胞和MCF7细胞接种于96孔细胞培养板中，3000细胞/孔。18h后转染siRNA，高转移乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞转染AntagomiR-182，低转移乳腺癌细胞系MCF-7细胞转染miR-182分别作为实验组。以不干扰任何基因的相应的MicroRNA为对照组，每组重复3次，LipofectamineTM RNAiMAX的用量为0.25μL/孔，RNA的用量为5pmol/孔，6h后换液，继续培养。转染72h后吸去培养基，每孔换成含有10%的CCK-8的DMEM完全培养基，继续培养1h。在酶标仪上检测细胞活力值。
1.4 细胞的侵袭和迁移实验
将MDA-MB-231细胞和MCF7细胞接种于细胞培养板中。18h后转染siRNA，高转移乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞转染AntagomiR-182，低转移乳腺癌细胞系MCF-7细胞转染miR-182，分别作为实验组。以不干扰任何基因的MicroRNA为对照组，每组重复3次，LipofectamineTM RNAiMAX的用量为0.25μL/孔，RNA的用量为5pmol/孔，6h后换液，继续培养。转染24h后，将基质胶和DMEM培养基以1∶3的比例混合后每孔上室加入20μL，放入37℃培养箱静置30min，使胶凝结。将转染后的MDA-MB-231和MCF7细胞消化打散，取100000个细胞，加入Transwell小室上层，总体积为100μL，不含血清，每组用3个小室。小室下层中加入600μL含有10%血清的培养基。48h后将Transwell小室用4%多聚甲醛固定，然后将上层膜的细胞轻轻擦除，下层膜的细胞用DAPI染色。将染色后的下层膜的细胞置于荧光显微镜下拍照，每个小室随机选取5个视野，20×物镜观察。对每张照片中的细胞数进行统计。
1.5 qRT-PCR
使用TRIzol抽取总RNA，并采用RNA-PCR试剂盒(TaKaRa公司)进行反转录，使用Sybr GreenMaster Mix(TaKaRa公司)行qRT-PCR，见表1。以GAPDH作为标准化参照，使用ΔΔCt法计算不同基因的相对表达状况。
表1 qRT-PCR中采用的引物序列
Tab.1 Primers sequence used in qRT-PCR analysis
基因引物序列VEGF正义链5′⁃CTACCTCCACCATGCCAAGT⁃3′反义链5′⁃TGGTGATGTTGGACTCCTCA⁃3′GAPDH正义链5′⁃CCCACTAACATCAAATGGGG⁃3′反义链5′⁃CCTTCCACAATGCCAAAGTT⁃3′
1.6 ELISA实验
将MCF-7、HUVEC细胞分别接种于6孔板中，待细胞密度达到50%左右进行转染。实验组转染miR-182，阴性对照组转染si-NC。转染使用Lipofectami-neTM RNAiMAX Reagent试剂盒。转染48h后，收集上清液，依ELISA试剂盒说明书操作检测VEGF表达量变化。
1.7 统计学处理
所有数据以
来表示，结果用SPSS 19.0软件进行分析。采用配对t检验比较miR-182及FOXF2的表达差异。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 荧光素酶基因报告及内源基因表达结果
预测结果显示FOXF2基因的3′UTR序列端的2个靶点的目的片段分别为485～491(U1)、688～695(U2)，见表2。MiRNA靶点突变测试报告测试MCF-7，发现FOXF2-U1荧光素酶活性降低不显著(P=0.145)，而FOXF2-U2荧光素酶活性降低较为明显(P=0.001)。即FOXF2基因的688～695靶点为has-miR-182的预测靶点。qRT-PCR检测发现，转染miR-182后MCF-7中FOXF2表达量明显降低(P<0.01)。
表2 has-miR-182与FOXF2的结合靶点表
Tab.2 The combination target table of has-miR-182 and FOXF2 mRNA
靶点预测mRNA序列与miRNA序列Position688～695ofFOXF23′UTR5′⁃GUAUACUUUUACAGUUUGCCAAA⁃3′hsa⁃miR⁃1823′⁃CACACUCAAGAUGGUAACGGUUU⁃5′Position485～491ofFOXF23′UTR5′⁃ACAUUUGGAUACAGGUGCCAAA⁃3′hsa⁃miR⁃1823′⁃ACACUCAAGAUGGUAACGGUUU⁃5′
2.2 miR-182对细胞增殖影响
细胞CCK-8增殖实验发现，高转移乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞，转染AntagomiR-182后使其表达抑制，细胞增殖能力下降(P<0.01)，与预期结果相符；低转移乳腺癌细胞系MCF-7细胞，转染miR-182使其过表达，细胞增殖能力提高(P<0.01)，与预期结果相符，见图1。
图1 CCK-8中MDA-MB-231与MCF-7细胞系增殖率
Fig.1 Proliferation rate of MDA-MB-231 and MCF-7 cell lines with CCK-8
与Si-NC组比较，*P<0.01
2.3 细胞的侵袭和迁移实验结果
Transwell实验发现，与对照组细胞胶穿(侵袭)和空穿(迁移)数量相比，转染了AntagomiR-182的MDA-MB-231细胞胶穿和空穿数量减少(P<0.05)；与对照组细胞胶穿和空穿数量相比，转染了miR-182的MCF-7细胞胶穿和空穿数量增多，且较为明显(P<0.01)，见表3。
表3 Transwell实验胶穿与空穿细胞计数
Tab.3 The change of cell counts in Transwell assay
组别胶穿平均计数空穿平均计数MDA⁃MB⁃231NC634573AntagomiR⁃182426420MCF⁃7NC371374miR⁃182934911
2.4 qRT-PCR检测MCF-7和HUVEC细胞系中VEGF基因表达
转染miR-182的MCF-7细胞系和HUVEC的VEGF基因表达情况如图2。qRT-PCR检测结果显示，MCF-7细胞系和HUVEC的VEGF基因表达与miR-182的浓度无关(P>0.05)。
图2 MCF-7和HUVEC细胞系中VEGF基因表达
Fig.2 VEGF gene expression in MCF-7 and HUVEC cell lines
A： VEGF基因在MCF-7细胞系中表达；B： VEGF基因在HUVEC细胞系中表达
2.5 ELISA检测MCF-7和HUVEC细胞系中VEGF蛋白表达
转染miR-182后，MCF-7细胞培养液上清液中VEGF蛋白较对照组含量升高(P=0.021，见图3)；而HUVEC细胞培养液上清液中VEGF蛋白含量升高更加显著(P=0.004)，见图4。
图3 细胞培养液上清液中VEGF蛋白含量的ELISA标准曲线
Fig.3 The standard curve of VEGF protein in the cell culture medium
图4 MCF-7和HUVEC细胞培养液上清液中VEGF蛋白含量
Fig.4 VEGF protein content in MCF-7 and HUVEC cell culture medium
与si-NC组比较，*P<0.05
3 结 论
本研究通过荧光素酶报告基因实验，验证了FOXF2基因的688～695靶点为has-miR-182的靶点。细胞的CCK-8增殖实验发现，对于高转移乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞，转染AntagomiR-182使其表达抑制，细胞增殖能力下降；对于低转移乳腺癌细胞系MCF-7细胞，转染miR-182使其过表达，细胞增殖能力有所提高，与预期结果相符。通过transwell实验发现，在MDA-MB-231细胞中，AntagomiR-182可以抑制细胞迁移和浸润能力；在MCF-7细胞中，miR-182可以促进细胞迁移和浸润能力。转染miR-182后，MCF-7和HUVEC细胞培养液上清液中VEGF蛋白含量均升高，但miR-182对VEGF基因基本没有影响。
三阴性乳腺癌侵袭性强，复发早，预后差，远处转移率高，缺乏内分泌及抗HER-2治疗靶点，是乳腺癌研究的热点和难点。Liu等[6]报道了miR-182促进TNBC细胞的增殖和迁移，抑制其凋亡等；Kong等[7]发现，FOXF2低表达可能与乳腺癌的进展和转移有关。Lei等[8]发现，miR-182的高表达与乳腺癌的复发和远处转移相关，Hirata等[9]发现，MicroRNA-182-5p可下调FOXF2促进前列腺癌侵袭及转移，但目前尚无系统研究miR-182与靶基因FOXF2之间的相关性及其与TNBC病理学特征之间的关系。前期研究[6]发现，miR-182在三阴性乳腺癌组织中高表达，并与差预后相关。本研究在FOXF2基因的3′UTR区域发现了两个miR-182的结合位点(U1和U2)，可能是其潜在靶基因。3′UTR区域的荧光素酶报告质粒验证，初步确认FOXF2-U2为miR-182的靶基因。进一步的体外细胞实验证明，has-miR-182通过与FOXF2基因的688～695靶点结合，降解靶基因FOXF2。CCK-8实验及Transwell实验表明，has-miR-182可促进乳腺癌细胞增殖，提高癌细胞浸润和迁移。miR-182作为乳腺癌促癌因素，直接作用于FOXF2基因，引起该基因下调，导致该通路所调控的细胞凋亡受到抑制，从而促进癌细胞增殖、浸润和迁移，最终影响TNBC患者预后。进一步的研究应致力于阐明has-miR-182的致癌机制，从而更深入认识TNBC复发、转移影响因素。
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