随着经济水平的不断提高和社会老龄化，心血管疾病的发病率不断攀升，心肌梗死已成为人类健康的主要“杀手”之一。虽然传统的药物治疗、介入治疗和外科搭桥手术等可以重建血运，挽救部分缺血区域的心肌，一定程度上改善心肌梗死患者的预后。但是已坏死的心肌细胞无法再生，会逐渐被瘢痕组织代替，并伴随无法逆转的心室重构，进而导致心力衰竭[1]。
越来越多的研究表明，多种中药方药具有改善心脏功能、降低心肌耗氧、抑制心肌梗死后的心室重构、改善心室功能等作用[2-3]。中药方剂强心方则被证实可以改善心肌梗死所导致的心力衰竭过程中心脏的功能[4]。已有大量动物研究表明，与单纯的西药治疗组相比，加用强心方治疗的心力衰竭动物如大鼠、家兔等心室重构明显减轻，心脏功能改善明显提高[5]。临床研究同样显示强心方有助于改善心功能，提高患者预后[6-7]。强心方由附子、葶苈子、黄芪、党参、太子参、鹿角片等组成[7]。其中黄芪、附子、葶苈子是本方中的三味主药。这些药物是否对心脏功能有影响目前研究不多，本课题将通过动物实验阐明黄芪、附子、葶苈子三者单用与联用在急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)后心室重构中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
7～8周龄C57BL/6雌性小鼠，体质量20～22g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号SCXK(沪)2007-0005。饲养于同济大学实验动物中心SPF动物房。该实验得到同济大学实验动物研究和使用委员会批准，并且所有动物的饲养、处理均严格遵守美国国家研究委员会(National Research Council)1996版《实验动物护理和使用指南》(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)的规定。
1.2 药物试剂
黄芪配方颗粒、附片配方颗粒、葶苈子配方颗粒购自江阴天江药业；戊巴比妥那粉剂购自Sigma公司；磷酸盐缓冲液(PBS)、Hanks平衡盐溶液(HBSS)、4%多聚甲醛溶液购自Gibco公司。
1.3 方法
1.3.1 建立小鼠急性心肌梗死模型 选用7～8周龄C57BL/6小鼠，体质量20～22g，使用1%戊巴比妥钠溶液麻醉后气管插管。皮肤消毒后开胸。暴露胸腔后剥离心包膜，在左心耳与右室流出道交界处下方1～2mm处进针，8-0无损伤缝合线缝扎。Sham组小鼠只在结扎处进针，不结扎。逐层缝合后用注射器将胸腔内多余气体抽出。腹腔注射40万U青霉素预防感染。
1.3.2 给药方式及动物分组 急性心肌梗死模型造模后24h后开始给药，持续每天固定时间经食道给药，共 30d。假手术组(Sham，n=8)使用PBS 200ml/d经食道给药。手术对照组(PBS，n=10)心肌梗死模型建立后使用PBS 200ml/d经食道给药。黄芪治疗组(HQ，n=10)心肌梗死模型建立后将黄芪颗粒110.25mg/d溶解于200ml PBS后经食道给药。附子治疗组(FZ，n=10)心肌梗死模型建立后附子颗粒55.125mg/d溶解于200ml PBS后经食道给药。葶苈子治疗组(TLZ，n=10)心肌梗死模型建立后葶苈子颗粒110.25mg/d溶解于200ml PBS后经食道给药。1/3剂量混合治疗组(Mix，n=10)心肌梗死模型建立后按黄芪、附子、葶苈子单用剂量的1/3混合后溶解于200ml PBS后经食道给药。全剂量混合治疗组(Mix full-dose，n=10)心肌梗死模型建立后按黄芪、附子、葶苈子单用剂量混合后溶解于200ml PBS后经食道给药。
1.3.3 心脏超声评估心脏功能 持续给药30d后，将小鼠放入装有异氟烷的麻醉诱导盒中麻醉后使用小动物超声仪测量小鼠心脏功能。
1.3.4 组织切片染色 AMI模型建立并给药30d后处死小鼠，取出心脏，生理盐水清洗并脱水处理冲洗后垂直于心脏长轴将心脏切片，分别行马松(Masson)染色与天狼星红(Sirius red)染色后，显微镜下观察小鼠心肌组织。
1.3.5 心肌组织Isolectin-B4染色 心脏组织OCT包埋后制作冰冻切片。PBS漂洗5min。4% PFA溶液固定15min。PBS漂洗后使用1%的BSA封闭液封闭30min。将Isolectin-B4抗体用配制好的抗体稀释液以1∶100比例稀释后孵育，4℃过夜。PBS漂洗5次，每次3min。将生物素标记的荧光二抗用配制好的抗体封闭液以1∶100比例稀释后室温孵育2～3h。PBS漂洗5次，每次3min。然后用PBS漂洗3次，每次5min。每个样本加入5μg/ml DAPI 100ml，孵育5min。PBS漂洗后抗淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察。
1.3.6 麦胚凝集素(wheat germ agglutinin， WGA)免疫荧光染色 心脏组织OCT包埋后制作冰冻切片。PBS漂洗5min。4% PFA固定15min。HBSS漂洗3次，每次5min。WGA抗体孵育10min，室温，抗体浓度5mg/ml。HBSS漂洗3次，每次 5min。每个样本加入5mg/ml DAPI 100ml，孵育 5min。HBSS漂洗5次，每次5min。抗淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察。
1.4 统计学处理
本研究中的数据采用SPSS16.0统计软件包处理，所有数据均以
表示，两组数据的统计分析比较采用独立样本t检验。超过两组的数据则组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)的方法。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 小鼠心肌梗死模型造模结果
小鼠急性心肌梗死动物模型建立方法如文献[8]所述。在心肌梗死造模并开始给药30d后，Sham组小鼠存活率100%，心肌梗死造模后小鼠活动减少，1～2d有小鼠死亡，另有部分小鼠在后期胃管给药时死亡，30d时PBS组存活率60%，HQ组存活率90%，FZ组与TLZ组小鼠给药30d后存活率为80%，混合给药组无论是混合组还是全剂量给药组小鼠存活率都为100%。
2.2 心脏超声结果
采用超声心动图测量各组小鼠给药30d后的心脏功能，结果表明给药1个月后PBS组小鼠相对于Sham组小鼠左室短轴缩短率(FS)及射血分数(EF)显著降低，左心功能明显降低；各给药组小鼠的EF及FS显著降低，左心功能明显低于Sham组小鼠的EF、FS(75.90%±2.43%、43.68%±2.28%)，见图1。但是各给药组小鼠的EF与FS相对于PBS组则均有不同程度的改善。PBS组小鼠的EF、FS为41.64%±3.50%、20.23%±1.91%。HQ组、FZ组、TLZ组、Mix组与Mix full-dose组小鼠的EF值分别提高到了65.05%±1.53%、51.48%±2.66%、54.46%±3.09%、61.77%±3.37%、57.51%±5.35%；FS值则分别提高到了34.65%±1.13%、25.79%±1.68%、27.82%±1.99%、32.70%±2.37%、30.70%±3.51%。其中HQ组、Mix、Mix full-dose组的改善最为明显，显著优于FZ组与TLZ组(P<0.01)，见图1。
图1 给药30d后心脏超声检测心功能结果
Fig.1 Cardiac ultrasound detection of cardiac function 30 days after administration
与Sham组相比，*P<0.05，**P<0.01；与PBS组相比，#P<0.05，##P<0.01
2.3 组织切片染色结果
给药30d后，将各组小鼠处死，取出心脏，心肌组织石蜡包埋后切片，后行Masson与Sirius red染色分别测定心肌组织中瘢痕组织的面积与心肌组织中胶原纤维的含量。心肌瘢痕组织统计结果如图2所示，Sham组小鼠心肌组织中基本没有纤维瘢痕组织，PBS组小鼠心肌组织中瘢痕组织的面积占比为24.80%±1.97%，HQ组、FZ组、TLZ组、Mix组、Mix full-dose组的梗死面积分别为16.51%±2.83%、14.91%±0.38%、12.22%±1.56%、12.92%±1.56%、11.32%±1.24%，各治疗组的心肌梗死面积与PBS组相比均有显著的减少。可见经过药物治疗后，小鼠心肌组织中瘢痕组织的形成减少。肌组织中胶原纤维含量统计分析结果如图3所示，PBS组小鼠心肌组织中胶原纤维的含量为23.83%±2.27%,HQ组、FZ组、TLZ组、Mix组、Mix full-dose组则分别为17.31%±1.43%、14.22%±1.16%、15.40%±1.04%、12.73%±1.73%、13.32%±1.49%。与PBS组相比较有显著的减少(P<0.05)，各给药组小鼠的心室重构程度显著减轻。
图2 给药30d心脏组织切片Masson染色检测结果
Fig.2 The Masson staining results of cardiac tissue sections 30 days after administration (scale bar， 2mm)
图3 给药30d后心脏组织切片Sirius red染色检测结果
Fig.3 The Sirius red staining results of cardiac tissue sections 30 days after administration (scale bar， 2mm)
2.4 麦胚凝集素(WGA)免疫荧光染色结果
在给药30d后，进行免疫荧光WGA染色，用以显示细胞的边界，测量心肌桥的横截面积，结果如图4所示，PBS组小鼠的心肌桥横截面积为(0.065±0.004)cm2，相对于Sham组的(0.043±0.002)cm2明显增大，FZ组、Mix组、Mix full-dose组小鼠的心肌横截面积分别为(0.047±0.002)cm2、(0.045±0.002)cm2、(0.41±0.004)cm2，相对于PBS组小鼠的心肌横截面积显著减小，而与Sham组相比，PBS组、HQ组、TLZ组心肌桥横截面积显著增大(P<0.01)，见图5。表明FZ、Mix、Mix full-dose可以显著缓解心肌梗死后心肌组织的增生肥大。
图4 给药30d后各组小鼠心脏组织切片WGA免疫荧光染色
Fig.4 The WGA staining results of cardiac tissue sections 30 days after administration (scale bar，50μm)
图5 给药30d后心脏组织切片WGA免疫荧光染色统计结果
Fig.5 The WGA staining results of cardiac tissue sections 30 days after administration
与Sham组相比，**P<0.01；与PBS组相比，##P<0.01
3 讨 论
在中医临床实践中，黄芪、附子、葶苈子这三味药经常出现在治疗心脏疾病的药方当中，大量的实验研究证实了这些中药方剂可以改善心肌梗死之后心脏的功能，有助于心脏功能的恢复。
关于这三种药单药治疗心力衰竭的效果，众多的研究显示出了积极的结果。赵扬等[9]的研究也证实了黄芪注射液对充血性心力衰竭患者的心功能指标有明显改善作用，杨林等[10]的研究也证实采用黄芪治疗的临床效果明显,可以在很大程度上减轻慢性心力衰竭疾病症状,为患者生活提供质量保障。此外还有研究发现，急性心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡加剧,bax、bcl-2参与了缺血再灌注时心肌细胞凋亡凋控,黄芪可抑制凋亡加速基因bax的表达,因而在缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的保护方面有一定价值[11]。王胜林等[12]的研究证实附子水煎液可改善心脏收缩功能，抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统。徐菲拉等[13]的研究发现，附子与人参配伍使用相伍，能够有效提高血液中IL-10表达水平，抑制炎症因子的表达,从而提高心力衰竭大鼠存活率;其还能有效抑制IL-18和TNF-α的表达水平,改善心力衰竭大鼠心功能水平,其效果较单独应用人参的效果更佳。此外有报道[14]说明葶苈子的水提取物具有显著强心和增加冠脉流量的作用，但不增加心肌耗氧量。孙志强等[15]则证实葶苈子提取液可改善心力衰竭SD大鼠心功能各项指标，从而增强心功能。这些研究报道的黄芪、附子、葶苈子对心功能的改善作用与本研究结果相符合。
本研究中，1/3剂量混合治疗组与全剂量混合治疗组小鼠的射血分数、心脏短轴缩短率均有提高，与单药组相比较，1/3剂量混合治疗组与全剂量混合治疗组小鼠的心功能改善程度与黄芪组相似，都显著优于附子组与葶苈子组。
在抑制心肌肥大方面，有研究证实黄芪皂苷甲能够抑制压力过载型心肌肥厚大鼠肾素-血管紧张素系统的过度激活,这可能是其逆转左室肥厚的途径之一[16]。而附子对心肌肥厚的作用尚有一些争议，有研究认为附子抗心肌肥厚及抑制神经内分泌因子分泌的作用不显著[17]，也有研究认为附子对心肌肥厚具有一定的抑制作用[18]。本研究结果中，附子组、1/3剂量混合治疗组、全剂量混合治疗组对心肌梗死后心肌组织的肥大有明显的抑制作用。
本课题将黄芪，附子，葶苈子单一药物治疗与复方使用治疗对心肌梗死后心力衰竭的影响效果进行了验证与比较，发现单独给药的作用效果不如联合使用，联合给药可以改善心肌舒缩功能，缓解心室重构，减少纤维瘢痕组织的形成以及减轻心肌梗死后心肌组织的肥大增生。研究结果证实药物配伍使用时比单独使用更有优势，尤其是1/3剂量混合治疗组好于全剂量混合治疗组，这些结果对于中药临床上剂量的应用具有明显的指导作用，需要进一步深入探讨。
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