后np65聚集在PSD的现象。·综 述·
综述， 袁琼兰 审校
【摘要】 Neuroplastin(np)是属于免疫球蛋白超家族、富含于突触膜的细胞黏附分子，有np65和np55两种异构体。np65是脑特异性的，np55是全身分布的。Neuroplastin可在长时程增强、突触可塑性和促进神经突起生长等方面发挥作用，可能与学习、记忆、情感有关。本文对Neuroplastin的结构、分布和功能进行综述。
【关键词】 Neuroplastin； 细胞黏附； 神经突起生长； 突触可塑性； 情感
1977年，Neuroplastin(np)分子在神经突触膜上刀豆素(ConA)中的一条蛋白带中被发现[1]。1988年，Hill等证实了一种单克隆抗体(mabSMgp65)能够与富含于突触上的糖蛋白结合，而这种糖蛋白同样出现在大鼠的前脑突触上[2]。这种糖蛋白是由同一基因经不同的剪切形成，有两种相对分子质量： 65000和55000，最初根据其相对分子质量不同命名为糖蛋白65(glycoprotein 65)和糖蛋白55(glycoprotein 55)[3]，而后改名为Neuroplastin-65(np65)和Neuroplastin-55(np55)[4]。1988年后，Neuroplastin的功能、结构开始被广泛研究。
Neuroplastin、Basigin和Embigin(gp70)共同组成了免疫球蛋白超家族，又称CD147家族。该家族在结构上均由胞外域、跨膜区和胞内域组成。Neuroplastin和Basigin在结构上的同源性为 40%～ 50%，二者同源性最高的部分是跨膜区(包括带电荷的谷氨酸残基)和胞内域。
np65在细胞外有3个Ig样结构域(Ig1～3)，而np55则有2个Ig样结构域(Ig2～3)。np65借助Ig1进行亲同性结合介导细胞间的黏附作用[5]。np65和np55共有的Ig3样结构域与Ig2样结构域的轴线呈大约45度角，Ig2结构域存在8个β-折叠股结构并且采取Ⅱ型中间型的拓扑结构，Ig3结构域存在9个β-折叠股结构并且采取I型中间型的拓扑结构，Ig2和Ig3通过3个氨基酸相连。在大鼠和人脑中，Neuroplastin的Ig2和Ig3结构域含有6个N-连接糖基化位点，其中np55的6个糖基化位点中有4个为N-乙酰氨基葡萄糖[5]。
np65通过特有的Ig1进行分子间亲同性结合。np65的Ig1中，F-G环与Ig1表面垂直。Owczarek等[6]发现，人工合成包含F-G环和G β-折叠股的Enplastin能够和np65的F-G环相结合并发挥其拟np65的作用，进一步说明亲同性结合位点位于Ig1的F-G环。
Neuroplastin的跨膜区域大约有21个氨基酸[7]，其中np55是从第192处亮氨酸到第215处酪氨酸，这与np65的第308～331处残基一致，为跨膜区域氨基酸组成。除此之外，跨膜区域还存在一个带电荷的谷氨酸残基，这个残基存在于所有CD147家族中[8]。Neuroplastin的胞内区域由34个带电荷或中性的氨基酸组成，此外还包含若干疏水残基。目前，Neuroplastin胞内磷酸化位点尚不清楚。
Neuroplastin属于细胞黏附分子免疫球蛋白超家族，主要位于突触膜上[4]。其中np65是脑内特有的糖蛋白并且主要存在于前脑的神经元，而np55存在于脑内各个区域和其他组织[9]。
在大鼠前脑中，np65显著存在于大脑皮质、海马、杏仁核和纹状体；在皮质中，于Ⅱ、Ⅲ和Vb/Ⅵ区域强染色，其他区域中度染色；在躯体感觉区，第Ⅳ层的桶状区(barrel fields)显示了很强的染色信号；在纹状体中，壳免疫染色最强。另外，丘脑的正中核和外侧核呈中度的染色信号。在海马中，不同区域的染色信号强度差异明显，CA1区和齿状回显示了最强的染色信号。在CA1区，辐射层和始层染色信号强度要比腔隙层高，CA1区锥体细胞呈斑点状染色且在胞体周围出现免疫反应信号，而CA3呈轻度染色。在齿状回中，内分子层要比中、外分子层染色信号强，染色存在于胞体的周围[4]。
人类和大鼠脑中Neuroplastin的分布不完全相同。np65在人大脑皮质和小脑中高表达，而在大鼠小脑中主要存在的np55在人小脑中并没有被检测出。人小脑中表达np65的浦肯野细胞分布和小鼠中np55分布相同[8]，主要表达于树突和胞体的膜表面。小脑深部的核团包括齿状核和球状核及脑干核团也表达np65，而胶质细胞不表达np65。不同于大鼠海马np65的分布，人脑海马的np65分布没有区域的界限，CA1～CA4的表达量基本相同。大脑皮质区各个区域的表达含量也没有差异。在细胞层面，人脑皮质和大鼠的表达情况类似。
在不同种生物中，np65和np55都有高度的糖基化并呈现多种不同的糖基化形式[9]。其中np65中一部分的岩藻糖基化与长时间记忆形成以及长时程增强效应(long term potentiation, LTP)有关[10]。np65在突触后致密区(post synaptic density area, PSD)的免疫反应性明显增高，说明为了维持神经元活性np65可移位至PSD，且用np65抗体或者np65-Fc重组蛋白可以抑制LTP，这都说明np65和LTP的维持与突触可塑性有关。
钙离子浓度的变化是突触可塑性重要的基础，其中np65通过细胞间亲同性结合后，胞内钙离子浓度升高；而np55也能够影响突触内钙离子的变化，这说明Neuroplastin在突触重塑方面起重要作用。np65诱导的胞内钙离子升高是由于胞内储钙器释放钙增加并依赖于FGFR的激活，这种机制已经被很多黏附分子证实。np55诱导胞内钙离子的升高是由于FGFR2直接激活[11]或间接通过FGFR下游分子使电压依赖性钙通道和非选择性钙通道开放而产生的[12]。此外，激活的FGFR还可以使胞内储钙器释放钙离子。但是实验证明胞内钙离子升高的现象不能完全被FGFR1抑制剂阻制，这说明还有其他信号分子参与np55诱导的胞内钙离子升高的过程，需要进一步研究。
利用np65抗体或np65-Fc融合蛋白可以阻断海马CA1和CA3[13]区LTP。这种抑制产生的机制并未完全明了，可能的原因： (1) 干扰了np65-np65亲同性的结合而抑制LTP；(2) np65-Fc融合蛋白和np65结合后，通过信号传导过程中p38MAPK的激活后减少海马神经元兴奋性突触上细胞表面GluR1的表达来影响突触可塑性[13]，阻断了LTP。
3.2.1 np55诱导神经突生长的机制 np55与FGFR结合后，通过信号传导发挥神经突起生长作用。FGFR1的配体是FGF2，FGF2和np55在与FGFR结合位点处有重叠，因此二者具有竞争作用。np55和FGF2在与FGFR结合后都能使EKR1/2磷酸化，且FGF2使其磷酸化的作用更加显著。但FGF2和FGFR1结合后不能促进海马神经元神经突生长，因此，推测np55诱导的神经突生长是依靠FGFR1和p38MAPK的激活作用[5]。
3.2.2 np65诱导神经突生长的机制 np65诱导的神经突生长的机制和np55一样，也依赖于FGFR1的激活及MAPK p38和ERK1/2。此外，这个过程还涉及突触内钙离子升高导致的钙离子/钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ激活及其独有的亲同性结合的辅助。np65通过Ig2和FGFR1结合激活下游的p38MAPK和ERK1/2，而在这个过程中，np65的亲同性结合可以促使FGFR1聚集[6]。此外，Empson等[13]发现，np65-Fc重组蛋白引起的海马LTP的抑制，这个过程影响的是p38MAPK而不是ERK。Owczarek等[6]检测了np65的表达，推测np65可能通过诱导轴突的生长在神经分化过程中起重要作用。
GABAA是中枢神经系统中主要的抑制性神经递质受体，是苯二氮卓类药物、巴比妥类、神经甾体和麻醉剂的作用位点。GABAA是一种配体门控通道，包括5种亚基，每种亚基又有不同的类型，因此GABAA受体具有多样性。大多数GABAA都包含两个α亚基、一个β亚基和一个γ亚基[14]。支架蛋白-桥尾蛋白(gephyrin)可以与GABAA受体直接作用[15]，使其聚集并锚定在抑制性突触上，从而限制GABAA受体的侧向扩散[16]。
利用Neuroplastin的抗体或者GABAA受体中α亚基的抗体进行免疫共沉淀实验证实发现np和GABAA受体相互作用形成的复合物位于细胞表面。用HEK细胞进行荧光能量共振转移实验和免疫共沉淀实验，结果发现np和GABAA受体呈现顺向亲异性结合。np65表达减少可以影响GABAA受体中α2亚基和突触前抑制性氨基酸转运小泡的结合，证实在GABA能神经突触有np的存在。np65和包含α1或α2亚基的GABAA受体定位在同一个突触，与包含α5的GABAA受体一起定位在突触外，而这种定位并没有gephyrin的参与。这说明np65和GABAA受体一些亚型相互联系(包含α1或α2或α5)，影响GABAA受体的聚集和定位[17]。
单羧酸载体蛋白(monocarboxylate transporter, MCT)存在于细胞膜上，用于转运单羧酸(乳酸、丙酮酸等)进细胞，MCT家族共有14个成员，MCT1～MCT4是离子共转运体，其介导的单羧酸转运和质子相耦联，1∶1转运质子和单羧酸离子。给大脑提供能量的物质除了葡萄糖外，还有乳酸、丙酮酸等，这都需要MCT的参与。在大鼠神经元中，主要单羧酸转运体是MCT2[18]。Neuroplastin随年龄的增长表达增加，因此推测Neuroplastin是MCT2的主要辅助蛋白。Neuroplastin作为MCT2的辅助蛋白，能够帮助MCT2定位至神经元表面并且支持其运输乳酸进入神经元[19]。但是，Neuroplastin和MCT2是如何产生交互作用无法通过免疫共沉淀法得知，原因是在脑中Neuroplastin的量要远远大于MCT2的量，因此MCT2的抗体在免疫共沉淀实验中无法发挥作用。又由于Neuroplastin在脑中大部分要与GABAa受体、FGFR产生相互作用[17]，因此只有少量的Neuroplastin和MCT2联系，用Neuroplastin抗体产生免疫沉淀来探测MCT2也是不合适的，因为其在可探测的阈值以下[19]。
乳酸是神经突触需要能量时重要的供能物质。聚集的np65可以使MCT2定位到细胞膜表面，进而将乳酸运进突触进而满足高能的需求状态。这可以解释LTP和红藻酸盐诱导癫后np65聚集在PSD的现象。
神经节苷脂存在于细胞膜上，对中枢和外周神经系统功能的发挥及维持起到重要的作用，尤其是在轴突和髓磷脂的相互作用过程中起重要的作用[20]。神经节苷脂缺陷小鼠Neuroplastin的mRNA表达明显增加，np55蛋白表达含量也明显增加，CA1、CA3区和齿状回分子细胞层的np免疫反应明显降低。由于神经节苷脂和Neuroplastin在突触传递、突触可塑性和神经突生长方面都有着重要的作用。脑中神经节苷脂的组成类型比例发生变化会影响np的表达分布，因此，np和神经节苷脂存在着相互作用[21]。
Narpin是根据np55的Ig2与FGFR1结合处序列合成的多肽。通过强迫游泳实验和旷场实验，发现体内给予narpin的大鼠出现活跃的表现，提示np55与抑郁有关[5]。
Enplastin是人工合成的针对np65的Ig1多肽，可以和np65结合。Owczarek等[6]进行水迷宫实验，第1、2、4天训练前50min给予enplastin，大鼠在第1天训练时找平台的时间变长，但是2～4d后和对照组就无明显区别。实验提示np65与学习记忆可能有关[15]。研究[22]也同样发现，np基因缺失的小鼠逆行性记忆减退。
研究[23]发现np65敲除对海马神经元的活性没有影响；np65敲除能够抑制培养的海马神经元突起的生长但能够增加初级突起的个数；通过水迷宫实验，np65(-/-)小鼠的学习能力与空间记忆能力较野生型好，表现为逃避潜伏期短、穿越平台的次数多。进一步的研究[24]发现，np65基因敲除的小鼠出现一系列的改变，包括： (1) 兴奋性突触与抑制型突触的比例升高；(2) N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)受体表达上调；(3) ERK 信号通路被激活；(4) 神经元树突棘数目减少；(5) 空间学习和记忆能力的改善，恐惧记忆和焦虑行为的丧失，这些改变说明np65可能通过调节突触的活动性进而调节认知功能，包括改变兴奋性和抑制性突触的比例和突出相关信号ERK1/2和p-CREB的表达量。
Niemann-Pick是一种由于基因异常而导致的神经鞘磷脂在溶菌酶堆积的疾病。典型的Niemann-Pick A型是由于神经鞘磷脂酶的缺乏而使得新生儿早期死亡。神经鞘磷脂酶的缺乏会导致胆固醇代谢的异常，进而使小脑中浦肯野细胞的轴突和树突发生异常，最终导致浦肯野细胞的死亡[25]。Neuroplastin主要分布在野生小鼠浦肯野细胞的树突中，而在神经鞘磷脂酶基因敲除小鼠中，Neuroplastin大量表达于存活的浦肯野细胞的胞体。这种未知的改变可能与蛋白运输过程的改变有关[8]。
精神分裂症是一种常见的精神疾病，通过家庭发病的聚集性和双胞胎的发病情况可得出精神分裂症有遗传易感性[26]。Neuroplastin基因(NPTN)位于染色体15q22，是导致精神分裂症的危险因素，认为和患者产生视觉注意有关[27]。有一项对日本200名精神分裂症患者的研究结果表明，NPTN的上游5′端启动子存在单核苷酸多态性，存在4种形式。其中，del-G-G在精神分裂症的患者中过表达，而T-G-G在正常人中出现的频率比患者多。T-G-G存在于启动子中可以减少NPTN的转录，从而干扰np分子之间过多的亲同性结合，因此T-G-T可作为精神分裂症的保护因素。2016年，研究[22]报道： np基因敲除的小鼠在旷场实验和黑白箱穿梭实验中显示出低焦虑状态并且能够更加友善的对待不熟悉的小鼠；np基因敲除小鼠在T形迷宫中缺乏主动性并且在悬尾实验中，静止不动的时间比野生型长，提示其np小鼠呈现抑郁样行为。通过对np基因敲除纯合子、杂合子、对照组进行研究，发现50%以上的np基因敲除小鼠(Nptn-/-、Nptn+/-)能够降低声惊吓后出现的脉冲性抑制(prepulse inhibition， PPI)。而精神分裂症的患者PPI明显降低，说明np可能与精神分裂症有关。
Roderiguez-Pinto等在乳腺癌患者淋巴结的B细胞增殖区筛查肿瘤抗原时，发现了Neuroplastin的表达，在之后的研究中发现表达的主要是相对分子质量为45000和55000的np55。在Neuroplastin表达阳性的肿瘤患者中，发现50%的患者出现肿瘤远处转移而20%表现出淋巴结转移，说明Neuroplastin的表达增加了肿瘤细胞转移的概率。因此，np55可能可以作为乳腺癌的肿瘤标志物，从而成为乳腺癌的筛查和治疗效果检测的指标。Fearon等[28]的研究提到，8%～15%的乳腺癌患者FGFR1的表达增高，这提示在某些种类的乳腺癌患者中可能涉及到np55激活FGFR这一重要的病理生理过程。
自从1988年Neuroplastin发现之后，关于Neuroplastin的研究已经广泛的开展。其不仅作为一种黏附分子介导细胞之间的联系，在脑中对神经的生长与分化、突触可塑性等方面起着重要的作用。由于np55广泛分布于各个组织，而np65只在脑部表达，因此研究np65在神经系统中发挥的作用有着更大的意义。尤其新近研究发现Neuroplastin与精神、情感有关，可能是新的与情感相关的基因，对精神异常疾病诊断、治疗、疾病模型可能是新的靶点。
【参考文献】
[1] FU S C, CRUZ T F, GURD J W. Development of synaptic glycoproteins： effect of postnatal age on the synthesis and concentration of synaptic membrane and synaptic junctional fucosyl and sialyl glycoproteins[J]. J Neurochem, 1981,36(4)： 1338-1351.
[2] HILL I E, SELKIRK C P, HAWKES R B, et al. Characterization of novel glycoprotein components of synaptic membranes and postsynaptic densities, gp65 and gp55, with a monoclonal antibody[J]. Brain Res, 1988,461(1)： 27-43.
[3] LANGNAESE K, BEESLEY P W, GUNDELFINGER E D. Synaptic membrane glycoproteins gp65 and gp55 are new members of the immunoglobulin superfamily[J]. J Biol Chem, 1997,272(2)： 821-827.
[4] SMALLA K H, MATTHIES H, LANGN
SE K, et al. The synaptic glycoprotein neuroplastin is involved in long-term potentiation at hippocampal CA1 synapses[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97(8)： 4327-4332.
[5] OWCZAREK S, KIRYUSHKO D, LARSEN M H, et al. Neuroplastin-55 binds to and signals through the fibroblast growth factor receptor[J]. FASEB J, 2010,24(4)： 1139-1150.
[6] OWCZAREK S, SOROKA V, KIRYUSHKO D, et al. Neuroplastin-65 and a mimetic peptide derived from its homophilic binding site modulate neuritogenesis and neuronal plasticity[J]. J Neurochem, 2011,117(6)： 984-994.
[7] BEESLEY P W, HERRERA-MOLINA R, SMALLA K H, et al. The Neuroplastin adhesion molecules： key regulators of neuronal plasticity and synaptic function[J]. J Neurochem, 2014,131(3)： 268-283.
[8] MARZBAN H, KHANZADA U, SHABIR S, et al. Expression of the immunoglobulin superfamily neuroplastin adhesion molecules in adult and developing mouse cerebellum and their localisation to parasagittal stripes[J]. J Comp Neurol, 2003,462(3)： 286-301.
[9] LANGNAESE K, MUMMERY R, GUNDELFINGER E D, et al. Immunoglobulin superfamily members gp65 and gp55： tissue distribution of glycoforms[J]. FEBS Lett, 1998,429(3)： 284-288.
[10] JORK R, GRECKSCH G, MATTHIES H. Impairment of glycoprotein fucosylation in rat hippocampus and the consequences on memory formation[J]. Pharmacol Biochem Behav, 1986,25(6)： 1137-1144.
[11] ROSENTHAL R, THIEME H, STRAUSS O. Fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in brain neurons and retinal pigment epithelial cells act via stimulation of neuroendocrine L-type channels (Cav 1.3)[J]. FASEB J, 2001,15(6)： 970-977.
[12] KIRYUSHKO D, KORSHUNOVA I, BEREZIN V, et al. Neural cell adhesion molecule induces intracellular signaling via multiple mechanisms of Ca2+ homeostasis[J]. Mol Biol Cell, 2006,17(5)： 2278-2286.
[13] EMPSON R M, BUCKBY L E, KRAUS M, et al. The cell adhesion molecule neuroplastin-65 inhibits hippocampal long-term potentiation via a mitogen-activated protein kinase p38-dependent reduction in surface expression of GluR1-containing glutamate receptors[J]. J Neurochem, 2006,99(3)： 850-860.
[14] OLSEN R W, SIEGHART W. International Union of Pharmacology. LXX. Subtypes of gamma-aminobutyric acid(A) receptors： classification on the basis of subunit composition, pharmacology, and function. Update[J]. Pharmacol Rev, 2008,60(3)： 243-260.
[15] SAIEPOUR L, FUCHS C, PATRIZI A, et al. Complex role of collybistin and gephyrin in GABAA receptor clustering[J]. J Biol Chem, 2010,285(38)： 29623-29631.
[16] BANNAI H, LÉVI S, SCHWEIZER C, et al. Activity-dependent tuning of inhibitory neurotransmission based on GABAAR diffusion dynamics[J]. Neuron, 2009,62(5)： 670-682.
[17] SARTO-JACKSON I, MILENKOVIC I, SMALLA K H, et al. The cell adhesion molecule neuroplastin-65 is a novel interaction partner of γ-aminobutyric acid type A receptors[J]. J Biol Chem, 2012,287(17)： 14201-14214.
[18] HALESTRAP A P, WILSON M C. The monocarboxylate transporter family — role and regulation[J]. IUBMB Life, 2012,64(2)： 109-119.
[19] WILSON M C, KRAUS M, MARZBAN H, et al. The neuroplastin adhesion molecules are accessory proteins that chaperone the monocarboxylate transporter MCT2 to the neuronal cell surface[J]. PLoS One, 2013,8(11)： e78654.
[20] PAN B, FROMHOLT S E, HESS E J, et al. Myelin-associated glycoprotein and complementary axonal ligands, gangliosides, mediate axon stability in the CNS and PNS： neuropathology and behavioral deficits in single- and double-null mice[J]. Exp Neurol, 2005,195(1)： 208-217.
[21] MLINAC K, JOVANOV MILO
N, HEFFER M, et al. Neuroplastin expression in the hippocampus of mice lacking complex gangliosides[J]. J Mol Neurosci, 2012,48(1)： 161-166.
[22] BHATTACHARYA S, HERRERA-MOLINA R, SABANOV V, et al. Genetically Induced Retrograde Amnesia of Associative Memories After Neuroplastin Ablation[J]. Biol Psychiatry, 2017,81(2)： 124-135.
[23] 吴爽，期易提，陈舒芸，等.neuroplastin 65敲除对小鼠学习与记忆功能的影响[J].同济大学学报(医学版),2014,40(4)： 1-6.
[24] AMUTI S, TANG Y, WU S, et al. Neuroplastin 65 mediates cognitive functions via excitatory/inhibitory synapse imbalance and ERK signal pathway[J]. Neurobiol Learn Mem, 2016,127： 72-83.
[25] SARNA J, MIRANDA S R, SCHUCHMAN E H, et al. Patterned cerebellar Purkinje cell death in a transgenic mouse model of Niemann Pick type A/B disease[J]. Eur J Neurosci, 2001,13(10)： 1873-1880.
[26] CANNON T D, KAPRIO J, LÖNNQVIST J, et al. The genetic epidemiology of schizophrenia in a Finnish twin cohort. A population-based modeling study[J]. Arch Gen Psychiatry, 1998,55(1)： 67-74.
[27] PAUNIO T, TUULIO-HENRIKSSON A, HIEKKALINNA T, et al. Search for cognitive trait components of schizophrenia reveals a locus for verbal learning and memory on 4q and for visual working memory on 2q[J]. Hum Mol Genet, 2004,13(16)： 1693-1702.
[28] FEARON A E, GOULD C R, GROSE R P. FGFR signalling in women’s cancers[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2013,45(12)： 2832-2842.
【Abstract】 Neuroplastin(np) belonging to the immunoglobulin(Ig) superfamily, is a synapse-enriched adhesion molecule. There are two isomers of neuroplastin, named np65 and np55 according to their molecular weight； np65 is brain-specific, while np55 is widely distributed in various tissues. Neuroplastinsins played a role in long-term potential, synaptic plasticity and promoting neurite outgrowth，which may be associated with learning, memory and mood. In this review, the molecular structure, distribution and biological functions of neuroplastins are focused.
【Key words】 Neuroplastin； cell adhesion； neurite growth； synaptic plasticity； mood
doi： 10.16118/j.1008-0392.2017.05.023
收稿日期： 2016-11-18
基金项目： 国家自然科学基金(81371213、81070987、30971531)；上海市大学生创新项目(1500107066)
【中图分类号】 R 741
【文献标志码】 A
【文章编号】 1008-0392(2017)05-0113-06