尿沉渣RUNX3基因甲基化检测联合B超检查在膀胱癌随访中的作用

(1. 同济大学附属东方医院泌尿外科，上海 200120； 2. 同济大学附属东方医院介入超声科，上海 200120)

【摘要】 目的探讨尿沉渣RUNX3基因甲基化检测联合B超检查在膀胱癌随访中的作用。方法 2014年9月至2015年2月，对50例初发膀胱癌患者行经尿道膀胱肿瘤电切术，术后病理证实为非肌层浸润性尿路上皮癌。术后2年内，所有患者每3个月随访复查1次，行膀胱B超检查、尿沉渣RUNX3基因甲基化检测、尿脱落细胞学检查及膀胱镜检查。结果 50例患者膀胱镜检查并活检发现肿瘤复发28人次，联合膀胱B超检查、尿沉渣RUNX3基因甲基化检测的联合检测法诊断膀胱癌复发的灵敏度92.86%，特异度91.62%，Youden指数0.8448，阴性预测值高达99.35%。结论膀胱B超检查联合尿沉渣RUNX3基因甲基化检测膀胱癌复发，灵敏度高、特异性强，阴性预测值高。

膀胱癌在我国是常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，术后极易复发。目前，膀胱镜检查及活检、尿脱落细胞学检查以及膀胱B超检查是膀胱肿瘤临床最常用的随访的方法，但均存在明显的优缺点。膀胱癌患者尿液DNA甲基化研究是近年来膀胱癌的研究热点，通过尿液进行基因甲基化检测有望能早期检测膀胱癌[1]。人runt相关转录因子3(human runt-related transcription factor 3， RUNX3)是近年来发现的一种新的抑癌基因。RUNX3与膀胱癌的发生发展密切相关，膀胱癌组织RUNX3甲基化水平与膀胱癌的预后相关。本研究通过尿沉渣RUNX3甲基化检测联合膀胱B超检查，对膀胱癌患者术后进行随访，与同期膀胱镜检查结果进行对比，以期找到膀胱癌随访的无创方法，从而减少常规有创膀胱镜检查次数。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究为前瞻性研究。入选标准：初发膀胱癌患者，行经尿道膀胱肿瘤切除术，术后病理检查证实为非肌层浸润性膀胱癌，同意收集尿液进行尿沉渣RUNX3基因甲基化检测，并签署知情同意书。排除标准：确诊患有其他泌尿系统肿瘤(肾盂癌、输尿管癌、尿道癌以及肾癌)或身体其他部位肿瘤患者；病理诊断不明确的患者。按照入选标准及排除标准顺序纳入2014年9月至2015年2月间在同济大学附属东方医院住院手术的50例膀胱癌患者，其中男39例，女11例，平均年龄(61.8±10.5)岁，均行经尿道膀胱肿瘤电切术，所有病例均经术后病理证实为非肌层浸润性尿路上皮癌，肿瘤单发42例，多发8例；肿瘤直径<3cm者38例，≥3cm者12例；肿瘤分期Ta期36例，T1期14例；肿瘤分级：低度恶性潜能3例，低级别34例，高级别13例。所有患者术后均接受定期膀胱灌注化疗，高危患者初次电切后 4～ 6周接受二次电切手术。

1.2 随访

术后2年内，每3个月随访复查1次，行膀胱B超检查、尿沉渣RUNX3基因甲基化检测、尿脱落细胞学检查、膀胱镜检查。每项检查的检查医师互不知道检查结果。(1) 膀胱B超检查：患者憋尿，保证膀胱充盈状态下，由1名固定的B超科副主任医师进行经腹部膀胱B超检查。(2) 尿沉渣RUNX3基因甲基化检测：在患者膀胱镜检查当日，采集晨尿50ml，尿液标本在4℃时，离心半径15cm，离心速度2000r/min离心10min，其沉淀用PBS洗涤2次，沉淀溶解于200μl纯水中，存储于-80℃冰箱。采用组织基因组DNA提取试剂盒[天根生化(北京)科技有限公司]提取组织基因组DNA，紫外分光光度计检测DNA含量和纯度(A260/A280>1.8)，置于1.5ml离心管中，-20℃ 保存。采用EpiTect Bisulfite Kits试剂盒(德国Qiagen公司)对基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰，-80℃保存备用，保存时间不超过1个月。对修饰过的基因组DNA分别进行甲基化特异性PCR和非甲基化特异性PCR。甲基化上游引物： 5′-TATTCGTTAGGGTTCGTTCGTTGC-3′，下游引物： 5′-ACGACCGCGAACGAACTTCGAAAC-3′，扩增产物201bp；非甲基化上游引物： 5′-TATTTGTTAGGGTTTGTTTGTTGT-3′，下游引物： 5′-ACAACCACAAACAAACTTCAAAAC-3′，扩增产物201bp；引物均由上海英潍捷基公司合成。PCR反应体系(25μl)组成如下：修饰后的DNA 2μl，上下游引物各 0.5μl，10×PCR 缓冲液 2.5μl，Taq酶0.5μl，超纯水19μl。PCR扩增条件为： 94℃预变性5min；热循环94℃ 60s、54℃ 30s、72℃ 30s，40个循环；72℃延伸10min后终止反应。取PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并照相。甲基化PCR扩增阳性则表明RUNX3基因启动子区甲基化；非甲基化PCR扩增阳性则表明未发生甲基化；若甲基化PCR扩增和非甲基化PCR扩增均为阳性则表明部分甲基化。甲基化或者部分甲基化均为检测结果阳性。(3) 尿细胞学检查：按常规进行尿细胞学检查，每例患者每天检查1次，连续3d。作巴氏染色，以找到癌细胞为尿细胞学检查阳性，以3次均未找到癌细胞为阴性。(4) 膀胱镜检查：由1名专门的高年资主治医师负责，患者取截石位，局麻或者静脉麻醉满意后，置入膀胱镜，应用70°镜仔细观察膀胱各部位有无肿瘤复发，如发现新生物或者可疑病灶取活检送病理检查。

本研究随访终点为初次手术后2年，或肿瘤进展为浸润性膀胱癌行全膀胱切除术。

本研究经同济大学附属东方医院医学伦理委员会批准，并与患者或家属签署了知情同意书。

1.3 统计学处理

应用SPSS 19.0统计软件分析。计量资料以

s表示。以膀胱镜检查为“金标准”，分别比较膀胱B超检查、尿沉渣细胞RUNX3基因甲基化检测法、尿脱落细胞学的灵敏度、特异度、Youden指数(Youden index， YI)，阳性预测值、阴性预测值，应用配对χ2检验比较两种检查结果，采用Kappa检验分析两种结果之间的一致性。同时将膀胱B超检查联合尿沉渣细胞RUNX3基因甲基化检测做并联试验，只要其中一项检查阳性即认为联合检测阳性，只有2项检查结果均为阴性才认为联合检测阴性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在50例患者中，膀胱镜检查并活检发现肿瘤复发21例，占42%，16例为1次复发，3例为2次复发，2例复发3次，共28人次复发，活检报告均为乳头状尿路上皮癌。5例患者发展为浸润性膀胱癌，行全膀胱切除术。8例患者因各种原因未全部完成2年内随访复查，共362人次有效复查。

2.1 各项检测诊断膀胱癌复发结果的比较

膀胱B超检查发现膀胱内占位性病变22人次，其中20人次经膀胱镜检查及活检证实为肿瘤复发，肿瘤最小直径0.6cm，另外2人次病理证实为膀胱炎症；尿沉渣细胞RUNX3基因甲基化检测法阳性47人次，阴性315人次，灵敏度为75%(21/28)，特异度为92.22%(308/334)；膀胱B超和尿沉渣甲基化联合检测阳性54人次；尿脱落细胞学检查发现病理细胞11人次，均为肿瘤复发，见表1。

膀胱镜检查与膀胱B超检查： χ2=2.5、P=0.109>0.05，提示两种方法诊断结果一致；Kappa=0.785、P<0.001，提示两种方法诊断结果存在一致性，Kappa>0.75，说明一致程度相当高。

膀胱镜检查与甲基化检测： χ2=9.8、P=0.001<0.05，提示两种方法诊断结果不一致部分有统计学差异；Kappa=0.513、P<0.001，提示两种方法诊断结果存在一致性，Kappa为0.4～0.75，说明一致性一般。

膀胱镜检查与尿脱落细胞学： χ2=15.06、P<0.001，提示两种方法诊断结果不一致部分有统计学差异；Kappa=0.544、P<0.001，提示两种方法诊断结果存在一致性，Kappa为0.4～0.75，说明一致性一般。

膀胱镜检查与联合检测： χ2=20.83、P<0.001，提示两种方法诊断结果不一致部分有统计学差异；Kappa=0.593、P<0.001，提示两种方法诊断结果存在一致性，Kappa为0.4～0.75，说明一致性一般。

甲基化检测：指尿沉渣细胞RUNX3基因甲基化检测法；联合检测：指联合膀胱B超检查及尿沉渣细胞RUNX3基因甲基化检测法，两项结果中只要一项阳性即为联合检测阳性，两项结果均阴性则联合检测阴性

2.2 各项检查结果评价

联合检测灵敏度和特异度均较高，综合灵敏度和特异度的Youden指数达到0.8448，优于其他检测，且联合检测的阴性预测值高达99.35%，提示联合检测阴性，膀胱癌复发的可能性很低，见表2。

3 讨论

随着工业化程度的加快和个人饮食、吸烟等生活习惯的改变，近10年间，膀胱癌发病率在我国呈逐年增长趋势，应引起高度重视[2]。同时，膀胱癌术后极易复发，其复发率可达到50%～70%，且多在 1～ 2年内复发，并伴有恶性程度增加或向浸润性肿瘤发展[3]，严重影响患者的生存期。因此，监测膀胱肿瘤是否复发显得尤为重要，早期发现肿瘤复发可以增加微创手术保留膀胱的机会，避免全膀胱切除、尿流改道给患者带来的痛苦，并提高患者总体生存率。

目前，膀胱镜检查及其对可疑病变组织进行活检、尿脱落细胞学检查以及膀胱B超检查是膀胱肿瘤临床最常用的随访的方法，其中膀胱镜检查是“金标准”，对于高危患者，前2年每3个月就需要行一次膀胱镜检查。膀胱镜检查是一种侵袭性的检查方法，操作过程中有可能造成膀胱黏膜损伤、出血、膀胱穿孔等风险，属于有创性检查，给患者带来痛苦；B超检查无创、方便，价格低廉，患者易于接受，但B超易受膀胱其他疾病的影响，而且一般只能发现5mm以上的膀胱肿瘤，对于平铺在黏膜表面不向腔内突出的肿瘤往往无法发现，如果膀胱未充盈往往更难以明确肿瘤是否复发，本组中通过B超发现的膀胱肿瘤复发直径均>5mm；尿脱落细胞形态学检查虽然无创，但阳性率较低，且对早期膀胱癌检出率更低[4]，给临床应用带来不便，本组中尿脱落细胞学检查灵敏度仅为39.29%。

DNA甲基化是表观遗传学修饰的一种重要方式，主要发生在富含CpG岛的启动子区域，通过该区域的甲基化阻碍转录因子与启动子结合，从而使基因转录受阻或转录水平降低。抑癌基因启动子区CpG岛异常甲基化在多种肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，是理想的肿瘤早期诊断和判断肿瘤生物学行为的标志，通过调控甲基化，可以抑制肿瘤细胞增殖[5]。RUNX3是近年来发现的一种新的抑癌基因，在细胞生长发育和肿瘤发生发展中起重要作用。研究[6]发现，膀胱癌组织中抑癌基因RUNX3的表达下调，且其表达下调主要是由于其启动子区发生异常甲基化，RUNX3与膀胱癌的发生发展密切相关，RUNX3启动子区甲基化水平可用于指导膀胱肿瘤的早期检查和疾病监测，RUNX3基因甲基化水平还可以作为评估膀胱癌预后的一个可行的生物学指标[7-9]。前期研究[10-12]表明RUNX3基因在与膀胱癌的发生、发展有重要关系。

甲基化特异性PCR检测作为一种定性分析手段，可从含有10000个正常细胞的复杂临床样品中检出个位数的甲基化异常的肿瘤细胞，因此通过甲基化特异性PCR方法可以检出尿液中占细胞总量的比例极低、却与正常细胞的甲基化谱式呈相反状态的膀胱癌细胞。其敏感性较尿脱落细胞学检查大大增加。目前，已有研究[13-17]通过检测尿液某些基因的CpG岛甲基化，早期诊断膀胱癌的报道，其敏感性较尿细胞学检查高。相比较传统的膀胱癌检测方法具有高通量、高敏感性的特点，能早期检出微小肿瘤甚至是癌前病变。在本研究中，单纯应用尿沉渣RUNX3基因甲基化检测，其灵敏度仍有所欠缺(75%)，在临床上诊断膀胱肿瘤是否复发尚缺乏说服力，因此单一应用尿沉渣基因检测在临床工作中仍无法代替膀胱镜，如联合应用多基因，灵敏度较高，但存在诊断费用高的缺点。

本研究中应用临床上最常用的无创检查方法——膀胱B超检查，结合尿沉渣RUNX3基因甲基化检测，克服B超检查的缺点，提高灵敏度，无创、方便的优点，并且联合检测阴性预测值高达99.35%，提示联合检测阴性，膀胱癌复发的可能性很低，可酌情延迟3个月再行膀胱镜检查，有望可以减少患者常规接受有创的膀胱镜检查，为早期诊断膀胱癌患者复发提供了一种新的无创检查手段，减轻患者痛苦。但该联合检测法仍无法完全替代膀胱镜检查。本研究样本量偏少，且RUNX3基因甲基化检测未采用荧光定量PCR技术，单一检测RUNX3基因灵敏度有所欠缺，因此在进一步的研究中，尚需要更大样本量，多基因并采用定量PCR检测的多中心试验来验证。

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Detection of RUNX3 gene methylation in urine sediment with transabdominal ultrasonography for follow up of non-muscle-invasive bladder cancer

WEN Ji-ling1, CUI Zheng2, QIU Guang-ming1, WANG Xue-lei1, LAN Jun1, WEN Xiao-fei1

(1. Dept. of Urology, East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China； 2. Dept. of Interventional Ultrasonography, East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China)

【Abstract】 Objective To evaluate of combination of RUNX3 gene methylation detection in urine sediment with transabdominal ultrasonography for the follow up of non-muscle-invasive bladder cancer. Methods Fifty patients with primary bladder cancer, who were underwent transurethral resection (TUR) from September 2014 to February 2015 and non-muscle-invasive urothelial carcinoma was confirmed by postoperative pathology, were enrolled in this study. The patients were followed up every 3 months for 2 years after TUR. Cystoscopy, transabdominal ultrasonography and urine cytology were performed； and methylation of RUNX3 was detected in urine sediment during the follow-up. Results Among 50 cases, tumor recurrence was found in 28. For parallel test of detection of RUNX3 methylation in urine sediment with transabdominal ultrasonography, the sensitivity, specificity, Youden index and negative predictive value were 92.86%, 91.62%, 0.8448 and 99.35%, respectively. Conclusion Combination of RUNX3 methylation detection in urine sediment with transabdominal ultrasonography is convenient and noninvasive in the follow up study of non-muscle-invasive bladder cancer, with high sensitivity and specificity. The negative result may indicate the extremely low possibility of recurrence of bladder cancer, which might reduce the times of cystoscopy.

【Key words】 RUNX3； urine sediment； bladder cancer； methylation； follow up

作者简介： 温机灵(1980—)，男，主治医师，硕士.E-mail： wenjiling@163.com