图1 标准样品色谱图
Fig.1 Chromatogram of standard sample
峰1为邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯
·基础研究·
【摘要】 目的 建立一种有效的中药汤剂包材中邻苯二甲酸二辛酯迁移量的检测方法。方法 采用COSMOSIL 5C18-AR-Ⅱ(4.6 ID ×150mm)C18色谱柱分离，流动相为乙腈、甲醇、水(90∶10∶0.5)，进样量，对照品20μl样品40μl，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长224nm。检测灌装后邻苯二甲酸二辛酯的迁移量。结果 质量浓度与其峰面积具有良好的线性关系(r=0.99949)，邻苯二甲酸二辛酯成分在15min内得到了较好分离。检出限为1.534566mg/L，平均加标回收率为101.4070%，仪器精密度相对标准偏差为0.501%，方法相对标准偏差2.101%。结论 本方法灵敏、简便，适用于中药汤剂包材中邻苯二甲酸二辛酯迁移量的检测。
【关键词】 中药汤剂； 邻苯二甲酸二辛酯； DEHP
邻苯二甲酸二辛酯(DEHP或DOP)又称为邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯。是邻苯二甲酸的衍生物，一般为无色透明液体，难溶于水，易溶于有机溶剂，难挥发，具高脂溶性，通过呼吸、饮食、皮肤接触直接进入人体和动物体内，以吸附态附着在固体颗粒物上并在生物体内积累，是使用最广、产量最大的增塑剂品种，广泛用于各种塑料制品中。近年来，国内外研究[1-4]显示，增塑剂造成的环境污染状况日趋严重，对人体健康造成了严重的威胁。环境中的DEHP进入人体后能诱发儿童哮喘、过敏及呼吸功能障碍等多种疾病[5-6]。蔡智鸣等[7]通过试验测定发现，DEHP已普遍进入人们日常食用的土壤栽培农作物中，如水果、蔬菜，干货中。因此，建立中药汤剂中的邻苯二甲酸酯类增塑剂迁移的检测显得十分有必要。本研究采用高效液相色谱仪对中药汤剂包材中邻苯二甲酸二辛酯的迁移进行了检测，并利用液相色谱法进行了分析研究。
高效液相色谱仪(1100)、脱气装置(G1322A)、四元泵(G1311A)、柱温箱(G1316A)、紫外检测器(G1314A)购自Agilent公司；恒温水浴锅(HWS-26)购自上海慧泰仪器制造有限公司；电子天平(ME204)、精密电子天平(XS105DU)购自梅特勒-托利多公司。
邻苯二甲酸二辛酯标准品购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水硫酸钠(AR，7757-82-6)；正己烷(AR，110-54-3)、甲醇(AR，67-56-1)购自凌峰公司；液相甲醇、乙腈购自默克公司；蒸馏水自制。
用精密电子天平准确称取邻苯二甲酸二辛酯标准品约85mg，甲醇溶解定容至100ml(此为标准品母液，约850mg/L)。取母液稀释，分别配制成0.5、1、2、5、10mg/L的标准液，保存于 4℃ 冰箱中。
1.3.1 流动相的选择 根据流动相尝试不同配比，结果发现增加甲醇或水的配比，检测峰与前面的溶剂峰交错在一起，甚至出现所有峰叠在一起分不清彼此，而且峰型也不好，分离效果明显不好；如果增加乙腈比例，峰型变好，分离效果开始增加，到了某一程度后峰型便开始保持不变。但是乙腈加的量越多，出峰的时间也就越长。经过测算后乙腈、甲醇、水比例在90∶10∶0.5的基础上比较好。
1.3.2 柱温的选择 色谱柱温度对保留时间有较大影响。升高柱温可明显提高各组分的分离度。当温度升高时，出峰时间明显的提前。虽然在进标准液时能够减少时间，但是在进样品时，出峰的提前有可能会被样品前面的杂质峰干扰，影响实验的准确性。而且温度太高易损伤色谱柱。所以最终设定柱温为30℃。
1.3.3 流速的选择 流速是色谱条件中的重要因素。流速增加，使得分析测试时间缩短，但样品出峰早会导致与前面峰重叠，分离效果不好。同样流速过慢会使得分析测试时间增长，而且峰会拖长，峰型和塔板数都不好，因此，最终流速选定为1.0ml/min。
1.3.4 检测波长的选择 根据紫外扫描，邻苯二甲酸二辛酯在224、244nm附近都有较大的吸光度。根据液相测试，波长在224nm时的峰面积，及分离度更好，所以最终波长设定在224nm。
用自制蒸馏水将中药煎药机冲洗干净，取同一批次中药，在中药煎药机加自制蒸馏水4000ml煎煮1h，制成常规水煎汤剂封装后，取50g药液放入分液漏斗中，加10ml正己烷，剧烈震荡5min，静置30min(注意打开盖子放气，让溶剂里面的气泡减少一些)。分层后取上层的有机溶剂，而水相再加 10ml 正己烷，重复上面萃取步骤。收集有机相，用无水硫酸钠去除水分并过滤至蒸发皿中。用少量正己烷洗涤容器和无水硫酸钠，一并过滤至蒸发皿。70℃水浴中蒸干，甲醇定容至2ml。
根据优化结果，实验的色谱条件确定为： COSMOSIL 5C18-AR-Ⅱ(4.6ID×150mm)；柱温30℃；检测波长224nm；流动相乙腈∶甲醇∶水=90∶10∶0.5；流速 1.0ml/min；进样量： 对照 20μl，样品40μl。标志样品的色谱图见图1。
图1 标准样品色谱图
Fig.1 Chromatogram of standard sample
峰1为邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯
精密吸取0.507、1.05625、2.028、5.28125、10.14mg/L；浓度的系列标准样品溶液，在优化的实验色谱条件下依次进样，以峰面积为纵坐标(y)，质量浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线。回归方程为y=25.5207x+1.534566，相关系数r=0.99949。结果表明，当标准样品溶液为0.507～10.14mg/L时，质量浓度与峰面积相关性良好。相关系数在0.999之上，说明本实验方法具有较低的检测浓度，满足痕量分析要求。
2.3.1 精密度实验结果 选取特定浓度的样品溶液，进样量为40μl，重复6次，样品的加标回收率峰面积分别为75.03373、75.70837、75.56311、76.18059、75.60253、75.86279，相对标准偏差(RSD)为0.501%，说明本方法具有重复性好、准确度高的特点。
2.3.2 回收率 取空白清澈水样，加入邻苯二甲酸二辛酯浓度为84.5mg/L混匀，按照本文1.3,1.4所述方法进行处理及含量测定。平均加样回收率为101.4070%，在合理范围内，回收率良好，见表1。
表1 回收率实验
Tab.1 Recovery test
批次加入量峰面积折算浓度/(mg·L-1)回收率(%)RSD184.5mg/L2192.4240785.847632101.5948284.5mg/L2198.1613886.072442101.86090.564%384.5mg/L2174.5332885.146601100.7652
2.3.3 稳定性试验 取3份同样的供试品溶液间隔一定时间，按照本文1.3,1.4所述方法进行含量测定，计算RSD。峰面积分别为 31.46891、32.44659、31.17413；RSD为2.101%。说明供试品溶液在24h之内保持稳定。
2.3.4 空白试验 提取溶剂中的杂质、所使用的玻璃器皿和环境等均可能给中药汤剂包材中，邻苯二甲酸二异辛酯的测定带来污染，由于影响检测的各个因素经常发生变化。因此，为了较好地消除这些因素对中药汤剂包材中测定影响，使测定结果更为准确、可靠，在分析样品的同时每次均进行空白试验。操作方法是取中药汤剂不经过封装，直接灌装玻璃器皿，然后按实验方法进行处理，浓缩至2ml，制成空白溶剂。在1.3的色谱分离条件下平行测定3次，取3次测定的平均值作为该批次样品测量结果的空白校正值。经检测，未检出对应色谱峰。
邻苯二甲酸酯类增塑剂主要用于塑料的添加剂，目的是使其更为柔韧、更易塑性。其用量占增塑剂总量的80%，其中邻苯二甲酸二辛酯的用量占增塑剂总用量的43%左右。因此，对于邻苯二甲酸二辛酯的检测，显得尤为必要。邻苯二甲酸二辛酯具有较强的脂溶性，在高温状态下容易迁移。且该类物质非常容易污染试剂以及实验器皿，在整个实验过程中，应全程避免与塑料制品接触，玻璃器皿在使用前用蒸馏水冲洗，并于烘箱内200℃ 4h烘干。在实验过程中，发现邻苯二甲酸二辛酯的迁移量，与时间因素关系密切。因此，同一批次样品制作完毕后，应同时移入玻璃器皿内密闭保存备用，以免影响数据的准确性。
柱温的升高，直接影响到两相的溶解度，并使得流动相的流速增加，从而使得峰位的出现提前。但过高的温度会使得峰位与溶剂峰重叠，从而影响到分离的有效性。经过20～50℃的比对测试，发现在室温恒定在25℃的条件下，30℃的柱温既可以使出峰时间提前，又不会与杂峰重叠，影响分离度与峰型。流动相的配比是影响洗脱强度的重要因素，甲醇和乙腈在分离的选择性上有较大差异。本实验分别尝试了以下不同流动相配比： 甲醇∶水(95∶5)，甲醇∶水(90∶10)，甲醇∶水(75∶25)，乙腈，乙腈∶甲醇∶水(90∶10∶0.5)。甲醇-水的配比，出峰时间明显提前，但容易与溶剂峰混杂在一起，严重影响分离度，无法有效分离。单纯的使用乙腈，则出峰时间被拉长。增加甲醇浓度，则流动相的洗脱能力明显增强。在确保有效分离的前提下，经反复比对，乙腈-甲醇-水(90∶10∶0.5)为较佳配比，分离效果较好。
本试验采取了高效液相色谱法，建立了中药汤剂中包材中邻苯二甲酸二辛酯迁移量的测定方法，在研究过程中，对流动相配比，柱温选择，流速及检测波长的选择，均进行了优化与改进，具有较低的检出浓度，及良好的检出限与回收率。经过测定研究，DEHP会经过中药汤剂封装袋迁移进入中药汤剂中,从而影响患者的服用安全。采用上诉方法在实验过程中发现，直接与包材接触的汤剂，其中的DEHP迁移量与灌装时的汤液温度，以及灌装后的存储时间，存储条件，具有一定的关联性。由于中药汤剂成份复杂，具体迁移规律有待进一步研究。
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【Abstract】 Objective To establish an effective detection method of dioctyl phthalate(DEHP) migration contained in Chinese decoction packing materials. Methods COSMOSIL 5C18-AR-Ⅱ (4.6ID × 150mm) C18 chromatogram column separation was performed with mobile phase of acetonitrile, methanol and water (90∶10∶0.5), sample size of 20μl (for control) and 40μl (for sample), flow rate of 1.0ml/min, column temperature of 30 ℃ and detection wavelength of 224nm. The amount of DEHP migration after filling was detected. Results Mass concentration and peak area from each component had good linear relationship (r=0.99949), and the DEPH component was separated within 15min. Detection limit was 1.534566mg/L with average recovery of 101.4070%. The instrument precision relative standard deviation was 0.501%, method relative standard deviation (RSD) was 2.101%. Conclusion The established method is sensitive and convenient, suitable for detection of dioctyl phthalate migration contained in Chinese decoction packing materials.
【Key words】 Chinese decoction； dioctyl phthalate； DEHP
doi： 10.16118/j.1008-0392.2017.05.008
收稿日期： 2017-04-05
基金项目： 上海市卫计委中医药科研基金(2014Y002A)
【中图分类号】 R 94
【文献标志码】 A
【文章编号】 1008-0392(2017)05-0037-04