表1 六对曲张静脉和正常静脉组织中差异表达的LncRNA和mRNA数量
Tab.1 The differential expression of LncRNA and mRNA in 6 pairs of varicose veins and normal venous tissues
基因表达倍数变化(2～4)倍数变化(4～8)倍数变化>8总计LncRNA上调30021302下调24960255mRNA上调23630239下调708321741
·基础研究·
【摘要】 目的 比较大隐静脉(great saphenous vein, GSV)曲张血管与正常血管差异表达的lncRNA对大隐静脉曲张的影响，并预测其可能潜在的功能。方法 应用表达谱芯片检测6对配对的曲张静脉(varicose vein, VV)和相邻正常节段大隐静脉(normal vein, NV)组织lncRNA表达差异，以qRT-PCR对32例患者样本进行验证；同时以基因芯片lncRNAs和mRNA差异的分层聚类分析、基因本体及通路分析注释差异表达的mRNA通路。结果 在6对VV和NV中，存在557个lncRNAs和980个mRNA表达差异；其中6个通路与代谢相关，均得到了qRT-PCR验证。编码-非编码基因共表达网络提示，这6个lncRNA中有4个可能与11个mRNAs相关，且可能与8个代谢通路有关。结论 曲张大隐静脉中存在lncRNA异常表达，为lncRNAs生理功能和静脉曲张病理发生提供了新视角。
【关键词】 大隐静脉曲张； 长链非编码RNA； 基因芯片
静脉曲张是一常见多发病，很多因素会导致大隐静脉曲张的发生。其分子机制包括： 瓣膜功能不全[1]、白细胞渗出和炎症、内皮细胞损伤等。很多通路参与了静脉曲张的病理过程，包括HIF-1α、JAK-STAT、NF-κB、PARP、Bax、ICAM-1、IL-1α和TNF-α[2-3]。但还有更多的机制需要进一步阐明；与静脉曲张发生可能相关的长链非编码RNA分子(lncRNAs)和micro-RNA亦有待进一步的筛选和验证。
LncRNAs是一类长度超过200核苷酸的长链非编码RNA[4]。lncRNAs与癌症[5-6]、阿尔茨海默病、脊髓小脑共济失调(spinocerebellar ataxia， SCA)[7]和心血管疾病[8-9]的发生、发展有关。然而，lncRNAs与静脉曲张之间的关系仍不清楚。
本研究应用基因芯片对静脉曲张的lncRNA进行筛选，并进行qRT-PCR验证，探讨静脉曲张有关的mRNA与通路的相关性，确定差异表达lncRNA对大隐静脉曲张的影响，并预测其可能潜在的功能。
收集32例在同济大学附属东方医院行大隐静脉切除的原发性大隐静脉曲张患者的32个大隐静脉标本。利用临床、病因、解剖和病理因素分析系统(clinical, etiological, anatomic and pathological factors analysis system， CEAP)对慢性下肢静脉疾病(chronic venous disease， CVD)进行分类[10]。男性患者14例，其中有1例CEAP 6级和1例CEAP 5级，其余患者为CEAP 4级，女性患者18例，均为CEAP 4级。
采用配对的曲张静脉(varicose vein, VV)和相邻正常节段大隐静脉(normal vein, NV)组织来评估表达的差异水平。NV标本取自距离VV标本3～4cm处。6对取自6例患者的标本被用于lncRNAs表达谱芯片，所有32例样本均采用qRT-PCR进行验证。
根据操作说明，利用TRIzol(Invitrogen公司)提取32对冰冻样品中的总RNA。样本标记和基因芯片杂交按照改进版本Agilent One-Color Microarray Based Gene Expression Analysis (安捷伦科技公司)的步骤进行。
冷冻静脉标本中的总RNA通过TRIzol提取，使用PrimeScript TM反转录试剂盒(TaKaRa公司)进行反转录。VV和NV组织中lncRNA表达通过在Sequence Detection System(ABI PRISMH 7900)上利用Power SYBRH Green PCR Master Mix试剂盒(安捷伦科技公司)进行qRT-PCR检测。
通过Feature Extraction软件(安捷伦科技公司)进行lncRNAs和mRNA数据分析。利用GeneSpring GX(安捷伦科技公司)进行聚类分析。选取6对有明显差异(P<0.05，差异≥2倍)表达的lncRNAs标本进行PCR验证。利用t检验进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。通过基因本体(GO)分析与通路分析识别具有差异表达的mRNA通路。利用最新版本的(KEGG)Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes数据库和GO分类网站(www.geneontology.org)进行通路分析。利用Cytoscape绘制编码非编码基因共表达网络关系图，其中网制皮尔森系数(|r|)>0.99[11]。
在6对组织标本中，共检测到12264个lncRNAs和14862个mRNA，存在2426个差异表达lncRNAs和3029个差异表达mRNA；其中，557个lncRNAs(302个上调、255个下调)和980个mRNAs(239个上调、741个下调)表达出现明显差别(>2倍)，见表1。在5个差异最显著的lncRNAs中，BC041954上调最明显(23.1倍)，AK023929下调最显著(4.84倍)，见表2。5个差异表达最显著的mRNAs见表3。
表1 六对曲张静脉和正常静脉组织中差异表达的LncRNA和mRNA数量
Tab.1 The differential expression of LncRNA and mRNA in 6 pairs of varicose veins and normal venous tissues
基因表达倍数变化(2～4)倍数变化(4～8)倍数变化>8总计LncRNA上调30021302下调24960255mRNA上调23630239下调708321741
表2 基因芯片中差异最大的前5个LncRNAs
Tab.2 The Top 5 differentially expressed LncRNAs in gene microarray
LncRNA编号变化倍数变化来源FDRsBC041954上调23.1misc_RNA0.01840.0334chr10:127700955-127703336上调4.25lncRNAdb0.00120.0194AK097695上调4.18RNAdb0.00190.0194ENST00000424739上调3.97Ensembl0.00200.0194ENST00000484962上调3.77Ensembl0.00890.0274AK023929下调4.84NRED0.00450.0218AK126867下调4.57misc_RNA0.00920.0278uc002bmd.2下调4.39UCSC_knowngene0.00390.0200ENST00000427890下调4.28Ensembl0.02230.0368AK126761下调4.11misc_RNA0.04620.0487
FDR： 伪发现率
表3 基因芯片中差异最大的前5个mRNAs
Tab.3 The Top 5 differentially expressed mRNAs in genes microarray
mRNA基因名NCBI编号变化倍数变化FDRsPOSTNNM_001135936上调5.990.00951.92PRNDNM_012409上调4.850.00921.84POSTNNM_001135935上调4.410.00831.77PPARGC1BNM_133263上调4.050.04551.71FAM64ANM_019013上调3.770.02341.41MYOCNM_000261下调8.460.01081.92CUL2NM_003591下调6.810.01271.81CNN3NM_001839下调6.520.01372.657-SepNM_001011553下调6.190.00771.69SRP54NM_003136下调5.890.00771.54
FDR： 伪发现率
对9个lncRNAs进行PCR验证，结果显示： 7个显示和基因芯片相同的变化趋势，6组差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。
图1 基因芯片数据和qRT-PCR数据的比较
Fig.1 Comparison of microarray data and qRT-PCR data
倍数均值为log2(VV/NV)，短横线代表标准误，基因芯片数据与qRT-PCR数据变化趋势相同；*P<0.05,**P<0.01
对6对VV和NV组织中存在显著差异表达的lncRNAs和邻近mRNA进行qRT-PCR验证，最终获得有效的22个lncRNAs。在这22个lncRNAs中，9个lncRNAs进行了适当的qRT-PCR引物设计(用Primer3并在NCBI验证)和qRT-PCR检测，其中7个显示与基因芯片相同的上调或下调结果，6组差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。表明基因芯片和qRT-PCR检测结果的一致性(图2)。
图2 丰度值>2的异常表达mRNA的通路分析结果
Fig.2 Pathway analysis of mRNAs with Abnormal expression of abundance>2
丰度值为显著集中通路统计学P值的lg值；白色横条代表上调的mRNA相关的通路，蓝色横条图代表下调的mRNA相关的通路，结果提示静脉曲张是代谢相关疾病
对6个验证过的显著差异表达lncRNAs进行编码非编码基因(CNC)网络分析，结果共有11个显著异常表达mRNAs与4个经验证的lncRNAs相关，构建了4个独立中心网络节点，见图3。通过大隐静脉相关mRNA代谢途径(糖酵解/糖异生途径，脂肪酸代谢，酪氨酸代谢，嘧啶代谢，过氧化物酶体和青少年发病的成人型糖尿病)预测了6个经验证lncRNAs的潜在功能，其相关性标准为共表达基因对的|r|>0.9(P<0.01)。结果表明，8个mRNAs与特定lncRNA相关(uc.345与NME7；G36810与POLR3F、IDH1和ALDH2；AF119885与ENTPD1、SLC25A17和PDHA1；NR_027927与NEUROG3)。
图3 4个LncRNAs编码非编码基因共表达网络
Fig.3 4 LncRNAs coding-non-coding gene coexpression networks
网络中只显示了相关系数(|r|)>0.99的共表达基因；有蓝绿色线条的节点代表LncRNAs，没有线条的节点代表蛋白编码RNA(mRNA)，红色的节点代表上调，蓝色的节点代表下调s；☆代表从天然HOXC4基因反义链转录来的蛋白编码RNA
本研究对下肢原发性静脉曲张异常表达lncRNAs和mRNAs以及与lncRNAs相关的mRNAs和通路进行了探索，对6个潜在的致病性lncRNAs进行了qRT-PCR验证，并预测了6个lncRNAs(AK021444、 AF119885、 uc.345-、 NR_027927、 G36810、 NR_027830)的潜在功能。提示这6个候选lncRNAs可能在原发性大隐静脉曲张的发病和病理变化中发挥一定作用[12]。这是对大隐静脉曲张相关lncRNAs在全基因组RNAs表达水平的第一个系统性筛选和验证，但仍需作进一步研究确认。
生物信息学分析表明，许多lncRNAs与邻近mRNAs表达相关，这与lncRNA与mRNAs相关的提议相一致[6]。6个验证过的lncRNAs中有4个与11个存在显著差异mRNAs相关。但它们与相应lncRNAs如何相互联系又如何影响静脉曲张患病率仍然未知。在表达差异明显的mRNAs影响大隐静脉曲张病理生理的7个通路中，6个是代谢途径；这些通路包括溶酶体、过氧化物酶、糖酵解、糖尿病和酪氨酸代谢。这些结果提示生物代谢过程也参与到大隐静脉曲张的发病和病理过程中[13]。
本研究的优势在于，用配对的组织标本评估曲张大隐静脉和相邻正常大隐静脉中存在lncRNAs和mRNA差异。该研究不受遗传背景差异、环境暴露或生活方式相关的混杂因素影响。但也存在一些局限性，如因验证不足不能证明潜在的致病性lncRNAs和个别mRNA或mRNA相关通路间的联系；静脉曲张常有炎症组织，mRNA和lncRNA的变化可能反映的是组织炎性反应引起的病理变化[14]。而且，本检测未去除组织中可能附带的额外淋巴组织和结缔组织，故不能辨别是否是炎性组织导致富集的lncRNAs和mRNA。故需作进一步的研究。
总之，本研究系统筛选、验证和功能预测了原发性下肢大隐静脉曲张中异常表达的lncRNA，这为了解大隐静脉的生理病理特性提供了新的视野。
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【Abstract】 Objective To identify aberrantly expressed lncRNAs in great saphenous vein (GSV) varicosity and their potential functions. Methods Six pairs of samples of varicose vein and normal vein were used for lncRNAs expression microarray and 32 samples were used for quantitative qRT-PCR validation. Hierarchical clustering was performed. Gene ontology analysis and pathway analysis were performed to identify mRNA pathways. Results Total 557 lncRNAs and 980 mRNAs that differed between the varicose veins and normal veins were identified in six pairs of samples. These lncRNAs were sub-grouped and mRNAs expressed at different levels were clustered into several pathways with six focused on metabolic pathways. qRT-PCR validated six lncRNAs were consistent with the results of microarray. A coding-non-coding gene co-expression network revealed that four of these six lncRNAs might be correlated with 11 mRNAs and pathway analysis revealed that they might be correlated with another 8 mRNAs associated with metabolic pathways. Conclusion Aberrantly expressed lncRNAs for GSV varicosity have been systematically screened and validated and their functions predicted. These findings provide novel insight into the physiology of lncRNAs and the pathogenesis of varicose veins for further investigation. These aberrantly expressed lncRNAs may serve as new therapeutic targets for varicose veins.
【Key words】 varicosis of great saphenous veins； long non-coding RNAs； gene microarray
doi： 10.16118/j.1008-0392.2017.05.007
收稿日期： 2017-03-11
基金项目： 同济大学青年优秀人才培养行动计划(2014KJ081)
【中图分类号】 R 543.6
【文献标志码】 A
【文章编号】 1008-0392(2017)05-0033-04