表示，两组间比较采用独立样本双侧t检验。P<0.05为差异有统计学意义。·基础研究·
【摘要】 目的 探讨患有自身免疫疾病的MRL/lpr小鼠作为临床干眼研究动物模型的科学性及实用性。方法 8周龄MRL/lpr及BLAB/C雌性小鼠各15只，分为实验组、对照组。分别于8、12、16、20周对各组小鼠行酚红棉线实验检测泪液分泌情况；取各组小鼠泪腺组织行H-E染色分析其淋巴细胞浸润情况；Western印迹法检测泪腺炎症因子TNF-α和IL-1β的蛋白表达情况。结果 实验组小鼠于16～20周时泪液分泌量显著少于对照组(P<0.05)，淋巴细胞浸润情况明显高于对照组(P<0.05),泪腺炎症因子TNF-α和IL-1β表达明显高于对照组(P<0.05)。结论 MRL/lpr小鼠是一种稳定、简单实用的干眼研究动物模型，可用于研究干眼炎症的发病机制。
【关键词】 MRL/lpr小鼠； 干眼； 动物模型； 炎症因子； 泪腺
干眼(dry eye disease, DED)是一种眼表潜在性损伤的多因素疾病，可导致眼部不适、视觉障碍、泪膜不稳定及泪膜渗透压增高等眼表损害[1]。全世界数百万人受干眼疾病的影响。患者生活质量低下，重症干眼患者甚至最终失明。尽管干眼病因及发病机制尚未完全阐明，但已有研究[2]证明，免疫介导的炎症反应是导致其分泌功能障碍的最重要因素，并且由于单核淋巴细胞的浸润，泪腺腺体大量损害及外分泌功能严重丧失。根据病因不同，DED可分为泪液分泌不足性干眼(aqueous tear-deficient dry eye, ADDE)和蒸发过强性干眼(evaporative dry eye, EDE)。ADDE是由于泪腺功能障碍导致泪液分泌减少所致，分为SS性干眼[2](Sjögren’s syndrome dry eye， SSDE)和非SS性干眼。SSDE是一种以泪腺进行性损害为特征的系统性自身免疫性疾病所导致的干眼[3]。MRL/lpr小鼠是一种自身免疫系统疾病性小鼠，可作为人类SSDE的模型小鼠[4]，广泛应用于系统性红斑狼疮等免疫系统疾病研究的动物模型，国内将其作为干眼模型的研究比较少见。报道[5]显示，MRL/lpr小鼠在4周龄时开始出现泪腺的淋巴浸润，2月龄时炎症浸润加重，在4～5月龄时泪腺淋巴浸润程度最严重。本研究探讨MRL/lpr小鼠作为干眼模型的可行性，研究干眼发病过程的炎症情况，明确干眼小鼠泪腺组织中调控炎症的关键炎症因子的表达。
SPF级雌性8周龄MRL/lpr小鼠及BALB/C小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，体质量25～30g，饲养于同济大学动物实验中心SPF级动物房。分为对照组(BALB/C小鼠，n=15)和实验组(MRL/lpr小鼠，n=15)。分别取8、12、16、20周为监测时间点。
用眼科显微镊夹持酚红棉线，将其置于小鼠下结膜囊中外1/3处，停留60s取出。显微镜下使用游标卡尺测量棉线湿润长度，精确到0.02mm。
采用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖显微镜下分离，取下泪腺组织。4%多聚甲醛固定，常温下低浓度至高浓度梯度乙醇脱水，二甲苯透明后浸蜡、包埋、切片，厚度为4μm。对切片进行H-E染色，染色后显微镜下观察泪腺的病理学改变。
取下泪腺组织后，液氮研磨，加入300μl的组织裂解液，裂解充分后，将液体转移至1.5ml离心管，4℃，10000r/min，离心半径16cm，离心5min，取上清液。BCA法蛋白定量后，各组取20μg总蛋白经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离，之后通过电转移(300mA转移90min)将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上,封闭；小鼠TNF-α单抗(美国Abcam公司)1∶200、兔抗人IL-1β(美国Santa Cruz公司)1∶200，室温孵育2h，洗涤，二抗为兔抗小鼠多克隆抗体及羊抗兔的多抗，室温孵育1h,洗涤，显色，曝光，洗片。
所得实验数据采用SPSS 13.0分析软件处理，计量资料所有数据均采用表示，两组间比较采用独立样本双侧t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
对照组与实验组小鼠在8、12、16、20周的泪液分泌量见表1。在12周时，实验组泪液分泌量开始减少，于16～20周达到最低值，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。在16、20周时，实验组小鼠泪液分泌并差异无统计学意义(P>0.05)。
表1 两组小鼠的泪液分泌量
Tab.1 The tear volume of two groups
组别泪液分泌量8周12周16周20周对照组9.4±0.879.05±1.029.07±1.428.51±0.82实验组10.11±0.996.97±0.063.33±0.302.63±0.46
在8、12、16、20周时，对照组泪腺腺泡细胞排列整齐，于4个时间点均未有明显的淋巴细胞浸润，见图1A、B、C、D；实验组可见已有少量淋巴细胞浸润，见图1E；其淋巴浸润范围随时间而逐渐增大，可见泪腺腺泡组织排列无规则，腺泡细胞大量破坏，大范围的淋巴细胞浸润，见图1F、G、H。
图1 泪腺病理切片
Fig.1 Pathological sections of lacrimal gland tissue
Western印迹法结果显示，实验组小鼠泪腺炎症因子TNF-α及IL-1β的表达量明显高于对照组，在8周时，差异有统计学意义(P<0.05)。随着时间增加，实验组小鼠自身免疫疾病逐渐发展，泪腺炎症因子TNF-α及IL-1β的表达也随时间的延长表达量也逐渐增大。在20周时，实验组TNF-α及IL-1β的蛋白表达量远远高于对照组，说明实验组小鼠泪腺泪腺破环程度已十分严重，见图2～3。
图2 TNF-α及IL-1β的蛋白表达量
Fig.2 Expression of TNF-α and IL-1β
图3 TNF-α及IL-1β蛋白的相对表达量
Fig.3 Relative expression of TNF-α and IL-1β
干眼发病机制复杂。1998年，Stern等[6]首次提出了泪腺功能单位的概念，即泪膜、角结膜上皮、泪腺、眼睑及其相互联系的神经支配共同形成一个功能单位，它们在解剖上相连续，并且存在共同的反馈机制，阐明了眼表和泪腺之间的关系。Rashid等[7]指出,干眼患者的炎症细胞因子(包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α)的水平较正常人高,并与干眼的严重程度成正比。强烈的免疫应答所导致的外分泌腺体细胞因子系统的改变以及组织病理学的损伤，使外分泌腺体中的促炎因子(IL-1β、TNF-α)与其他在T细胞和B细胞内激活的细胞因子均呈现过表达[8-9]。IL-1是一种重要的炎症介质，其中IL-1β与受体结合后有众多信号转导通路介导的生物效应发生，如丝裂原激活的蛋白激酶通路、蛋白激酶C通路等，参与炎症反应过程。TNF-α是细胞黏附和趋化的主要递质，可以诱导炎性细胞产生IL-l，活性氧自由基和致炎性酶分子的产生和释放。在此理论基础上，本研究对MRL/lpr小鼠的眼表泪液分泌量以及泪腺炎症因子IL-1β、TNF-α进行研究，明确该小鼠作为干眼动物模型符合目前临床常见干眼患者发病的病理生理情况。
MRL/lpr小鼠lpr基因的突变是由于在Fas/FasL凋亡通路中Fas蛋白的缺陷而导致的[10]。这种缺陷导致正常淋巴凋亡系统受损，使得存活的淋巴细胞大量异常增生，尤其是B淋巴细胞[11-12]。这些改变可以加速MRL/lpr小鼠自身免疫泪腺炎症的疾病进程，最终导致其产生干眼症状[4]。MRL/lpr小鼠在4周龄时开始出现泪腺的淋巴浸润，2月龄时其炎症浸润逐渐加重，随着年龄的增加，其泪腺淋巴浸润程度在4～5月龄时达到最明显[5]。MRL/lpr小鼠还可通过另外一条方式(即肿瘤坏死因子感受器)导致泪腺的凋亡。有研究显示该小鼠有较高表达量的TNF-α[5]。在本研究中，随着年龄的增加，MRL/lpr小鼠的泪液分泌量逐渐减少，于16、20周时的泪液分泌量达到最低，这也能直接证明MRL/lpr小鼠的泪腺分泌功能严重受损。
泪腺组织H-E染色结果显示，在8周时，实验组与对照组泪腺腺泡细胞间的淋巴细胞均不明显，二者腺泡细胞排列紧密，腺泡细胞排列规则；在12周时，实验组泪腺的淋巴浸润已经较为明显，且其泪腺腺泡细胞排列不规则，可见其泪腺的损伤已达一定程度；在16、20周时，实验组小鼠泪腺可见大量淋巴细胞浸润，腺泡细胞几乎消失，此时泪腺功能已经基本丧失。这个结果与实验组泪液的分泌量在16、20周时达到最低量也相符合。
小鼠泪腺蛋白的Western印迹法结果显示，实验组的MRL/lpr小鼠较之正常BALB/C小鼠泪腺炎症因子TNF-α以及IL-1β的表达量在8周时已经有明显的差异，可见实验组小鼠的自身免疫系统对泪腺已经开始造成的损害，但此时的泪液分泌量并未明显减少，以及H-E染色切片中的淋巴浸润也不明显，说明此时MRL/lpr小鼠的干眼并未明显表现出来。实验组在16、20周时，泪腺炎症因子TNF-α以及IL-1β的表达量明显高于对照组，此结果也与泪液分泌结果及H-E染色结果吻合。因此选用 IL-1β 及TNF-α作为干眼小鼠炎症的检测指标可检测小鼠泪腺炎症的发生发展。
综上所述，MRL/lpr小鼠作为干眼模型鼠，符合目前临床常见干眼患者发病的病理生理情况。该模型由于其自身的免疫系统损伤而稳定出现泪腺的病变且在固定的时间段出现干眼症状，泪腺的炎症因子(IL-1β、TNF-α)表达上调，泪液分泌减少，泪腺功能破坏，干眼炎症随时间呈现进行性发展，于 16～ 20周时干眼病变最为明显。
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【Abstract】 Objective To examine whether the MRL/lpr mice with autoimmune lacrimal gland disease can be used as a dry eye mouse model. Methods Thirty 8-week-old female MRL/lpr mice (n=15) and BLAB/C mice (n=15) were used as experimental group and the control group, respectively. The animals were observed at 8, 12, 16 and 20 weeks. Cotton thread test was performed and the tear volume was measured. H-E staining was performed for lacrimal gland tissues and the infiltration of lymphocytes was analyzed. The expression of TNF-α and IL-1β in lacrimal gland was detected by Western blot. Results Tear production was significantly decreased in the experimental group than that in the control group (P<0.05), especially at 16 and 20 weeks. HE staining showed more infiltrating lymphocytes in the experimental group in comparison with the control group. According to Western blot, the expression of inflammatory factors TNF-α and IL-1β in lacrimal gland was increased in experimental group(P<0.05). With the progression of the disease in MRL/lpr mice，the infiltrating lymphocytes and the TNF-α and IL-1β levels increased gradually(P<0.05). Conclusion MRL/lpr mice present the similar manifestations of human dry eye and the physiological and pathological changes in lacrimal gland, indicating that MRL/lpr mice can be used as a stable and feasible dry eye model.
【Key words】 MRL/lpr； dry eye； animal model； inflammation cytokine； lacrimal gland
doi： 10.16118/j.1008-0392.2017.05.005
收稿日期： 2017-02-28
基金项目： 国家自然科学基金青年项目(81400373)；同济大学附属杨浦医院课题(Se1201521)
【中图分类号】 R 77
【文献标志码】 A
【文章编号】 1008-0392(2017)05-0024-04