·基础研究·
【摘要】 目的 构建KLF2过表达BGC823和KLF2敲减MGC803胃癌稳转细胞株。方法 克隆人源KLF2基因，连接到AgeI/AgeI酶切后GV358载体上，构建GV358-KLF2重组质粒，转染293T细胞，包装慢病毒；构建KLF2shRNA，连接到BamHI和EcoRI双酶切后的PHBLV-U6-ZSGreen-Puro载体上，经鉴定后转染293T细胞。采用RT-PCR及Western印迹法检测稳转细胞株中KLF2的表达。结果 利用慢病毒介导，重组质粒GV358-KLF2和KLF2-shRNA转导入BGC823细胞、MGC803细胞并稳定表达。RT-PCR和Western印迹法结果均显示过表达稳转株KLF2表达量明显升高(P<0.05),敲减稳转株KLF2表达量明显下降(P<0.05)。结论 成功构建了KLF2过表达BGC823细胞株和KLF2敲减MGC803细胞株，为后续KLF2功能实验奠定了基础。
【关键词】 KLF2基因； 稳转株； 敲减稳转； BGC823细胞； MGC803细胞
在我国，胃癌是常见的恶性肿瘤，严重威胁人民的健康。由于早期症状不典型且胃镜常规检查未普及，我国60%～80%[1]的胃癌患者就诊时已到晚期。现有治疗手段获益有限，预后差，晚期胃癌患者5年生存率不超过20%。因此，如何及早发现胃癌，进而预防和治疗胃癌是当前的热点问题。
Krüppel样因子(Krüppel-like factors, KLFs)是锌指样结构转录因子[2]，为锌指蛋白超家族的一个亚家族。目前，在哺乳动物中已经发现有17种KLF因子，KLF2是KLFs家族中的一员，首次在人类中肺组织中发现[3]，因此也被称为肺转录因子(lung KLF, LKLF)。KLF2是由354个氨基酸组成的蛋白质，位于染色体19p13.1，并且与小鼠基因有85%以上的同源性。近年来，关于KLF2在恶性肿瘤发生发展中的作用受到了广泛关注，但是KLF2在胃癌中的作用尚无相关报道，因此本研究拟构建KLF2过表达及敲减的胃癌稳转细胞株，为下一步研究KLF2在胃癌中的作用及其可能的机制奠定基础。
BGC823和MGC803胃癌细胞株购自中科院上海分院；293T细胞由华东师范大学生命科学学院实验室赠与；大肠杆菌菌株DH5α、DMEM、RMPI-1640培养基、胎牛血清、TRIzol购自Invitrogen公司；GV358载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司；PHBLV-U6-ZSGreen-Puro载体购自Hanbio公司；限制性内切酶AgeI/AgeI购自NEB公司；限制性内切酶BamHI和EcoRI、T4连接酶、DNA ladder、反转录试剂盒购于Fermentas公司；In-FusionTM PCR Cloning Kit购自Clontech公司；Taq polymerase购自Sinobio公司；转染试剂LipofiterTM购自汉恒生物科技(上海)有限公司；质粒抽提试剂盒购自Promega公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Axygen公司；SYBR Green PCR试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo公司；FLAG抗体购自Sigma公司；鼠源二抗购自Santa Cruz公司；KLF2抗体购自Abcam公司；GAPDH抗体购自CST公司。
PCR扩增仪购自Applied Biosystems公司；凝胶成像仪购自BIO-RAD公司；蛋白核酸测定仪购自Eppendorf公司；研究级倒置荧光显微镜及图像分析系统购自北京赛多利斯仪器系统有限公司；RT-PCR检测仪(ABI-7300)购自ABI公司。
1.2.1 KLF2目的基因PCR扩增 KLF2基因PCR扩增引物，正向引物： 5′-GAGGATCCCCGGGTACC-GGTCGCCACCATGGCGCTGAGTGAACCCATC-3′,反向引物： 5′-TCCTTGTAGTCCATACCCATGTGCC-GTTTCATGTGCAG-3′。PCR扩增体系： 正、反向引物各 1μl，dNTP 4μl，5×buffer 10μl，模板 10ng，PrimeSTAR 0.5μl，加ddH2O补充到50μl。PCR反应条件： 98℃ 5min，98℃ 10s，55℃ 10s，72℃ 90s，30个循环，72℃ 8min。扩增完成后，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后回收产物。
1.2.2 重组载体构建 将GV358载体用AgeI/AgeI内切酶酶切，酶切体系为10×CutSmart Buffer 5μl，质粒DNA 2μg，AgeI内切酶1μl，加水补充至50μl，37℃反应1h。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带(酶切后GV358载体)与KLF2目的基因交换，构建重组质粒(并设置一组不含KLF2片段的质粒作为对照组)。反应体系为： 5×CE Ⅱ Buffer 2μl，酶切后载体2.5μl，KLF2片段2μl，Exnase Ⅱ 1μl，加水补充到10μl，37℃ 30min。将产物在冰水浴中冷却5min立即加入100μl感受态细胞中进行转化，在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500μl LB培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12～16h。
挑取菌落进行PCR鉴定，鉴定引物(本对引物一个位于目的基因中，一个位于载体上)为如下。正义链： 5′-GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG-3′,反义链： 5′-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′。鉴定反应体系： 2×Taq Plus Master Mix 10μl，正反引物各 0.4μl，加入单菌落，加水补充至20μl。PCR反应条件为： 94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，22个循环，72℃ 5min。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，选取阳性克隆转化子转化，挑菌，质粒抽提，并送上海桑尼生物技术有限公司测序鉴定。目的质粒转染293T细胞后，收集蛋白，用Western印迹法检测目的基因表达情况。
1.2.3 慢病毒包装 转染前24h，将293T细胞以5×106细胞/15ml的细胞密度接种于10cm培养皿，待细胞密度达70%～80%时，向灭菌离心管中加入载体质粒20μg、pHelper 1.0载体质粒15μg、pHelper2.0载体质粒10μg，并加入相应体积转染试剂混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育 15min，然后将上述混合液缓慢加至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养，6h后换新鲜培养基，转染后48h收集293T细胞上清液，4℃，离心半径 5cm，4000r/min，离心 10min，除去细胞碎片，用 0.45μm 滤器过滤上清液于 40ml 超速离心管中，离心半径 12cm，25000r/min，离心120min后弃去上清液，加入病毒保存液，经充分溶解后，离心半径 10cm，10000r/min，离心5min，将上清液分装小管置于-80℃保存。
1.3.1 KLF2shRNA序列 为了防止脱靶效应，设计了3对shRNA序列，见表1。
1.3.2 KLF2shRNA载体构建 载体PHBLV-U6-ZSGreen-Puro用BamHI和EcoRI双酶切，酶切体系为10×buffer 2μl，BamHI和EcoRI内切酶各1μl，载体 4μl，加水至20μl，37℃反应1h，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。利用3′和5′的单链退火获得目的片段shRNA，退火体系20μl，加入10×buffer 2μl，上、下游引物各 1μl，95、75、55、35、15℃各10min。将退火产物与酶切后回收的载体连接过夜，连接体系为： 退火产物 1μl，酶切载体100ng ligase buffer 2μl，T4ligase 1μl，加水至 20μl。连接产物转化DH5a感受态细胞，涂布在抗氨苄青霉素平板上，37℃，培养过夜，挑菌，质粒抽提，进行测序鉴定。
表1 3对shRNA序列
Tab.1 Sequence of ShRNA
名称序列(5'-3')ShRNA1正义链GATCCGCGGCACCGACGACGACCTCAATTCAAGAGATTG-AGGTCGTCGTCGGTGCCGTTTTTTC反义链AATTGAAAAAACGGCACCGACGACGACCTCAATCTCTTG-AATTGAGGTCGTCGTCGGTGCCGCGshRNA2正义链GATCCGCCTACACCAAGAGTTGAATTCAAGAGATTCAGT-GCGAACTCTTGGTGTAGGTTTTTTC反义链AATTGAAAAAACCTACACCAAGAGTGAATCTCTTGAATT-CAGATGCGAACTCTTGGTGTAGGCGshRNA3正义链GATCCGCGCTGCACATGAAACGGCACAAGAGATACATGT-GCCGTTTCATGTGCAGCGTTTTTTC反义链AATTGAAAAAACGCTGCACATGAAACGATCTCTTGAATA-CATGTGCCGTTTCATGTGCAGCGCG
1.3.3 慢病毒包装 转染前24h，将293T细胞以 5×106细胞/15ml的细胞密度接种于10cm培养皿，待细胞密度达70%左右时，将72μl LipofiterTM转染试剂加入到37℃预热的Opti MEM，静置至恢复室温后，加入载体pSPAX2、pMD2G和KL2 shRNA重组pHBLVTM载体各10μg，然后将上述混合物加入293T细胞培养皿中，转染6h后换新鲜培养液，转染48h后收集293T细胞上清液，进行慢病毒浓缩、纯化。
分别将处于对数生长期的BGC823细胞经胰蛋白酶消化，按照每孔5×104个细胞的密度接种至24孔板中，放入37℃、5%CO2的培养箱中进行培养过夜。24h后，待细胞融合度达到40%～50%时，进行转染。BGC823细胞每孔分别加入5μl KLF2过表达慢病毒、0.5ml无血清培养基、0.5μl 5μg/μl polybrene的混合液；MGC803细胞每孔加入5μl KLF2干扰慢病毒、0.5ml 无血清培养基、0.5μl 5μg/μl polybrene混合液。37℃培养6h后，换成完全培养基。感染 48h 后，加入2μg/ml嘌呤霉素筛选1周左右，可见筛选克隆，反复挑取多个细胞克隆继续用嘌呤霉素筛选1周后获得稳转细胞株。设置空载体慢病毒和nonsenseshRNA阴性分别为对照组。
分别收集稳转细胞株BGC823和MGC803，按照说明用TRIzol提取总RNA，反转录得到cDNA，进行RT-PCR检测，PCR体系为： SYBR Green Mix 12.5μl，正反引物各0.5μl，cDNA 2μl，加水至 25μl，反应条件为95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 45s，40个循环， 95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s。数据采用仪器自带软件分析： ABI Prism 7300 SDS Software。KLF2正向引物： 5′-CTGCTCTGTCTGCCTCCAAG-3′，反向引物： 5′-CTGCTCTCCAGGTGGGTTTC-3′。
收集稳转细胞株BGC823和MGC803，提取总蛋白，采用BCA蛋白定量法进行蛋白定量。取 20μg 蛋白与loading buffer混合后在100℃金属水浴锅中煮沸 10min，使蛋白质变性。SDS-PAGE凝胶电泳稳压 80V，持续20min；再稳压120V，持续 60min。结束后，用半干转膜法转膜，25V转膜 30min。转膜完成后，取出NC膜，放入5%脱脂奶粉制备的封闭液中，摇床上室温封闭 1h。用封闭液按KLF2 1∶1000 稀释抗体，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次后，加入1∶1000 稀释的HRP标记的二抗，37℃孵育1h。用ECL化学发光检测法显色。
采用SPSS 20.0处理数据，多组间均数比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
KLF2的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，得到 1109bp 特异性条带，与预测的大小一致，见图1。
GV358载体用AgeI/AgeI内切酶酶切后与KLF2目的基因构建重组质粒，经转化，涂板，挑菌后进行PCR鉴定。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，得到1260bp的阳性转化子，185bp阴性转化子，阳性转化子表明KLF2过表达重组载体构建成功，见图2。进一步测序结果表明，质检基因序列与目的基因序列一致。
图1 KLF2基因扩增电泳图
Fig.1 PCR amplification of KLF2
图2 重组载体PCR产物鉴定及Western印迹法检测
Fig.2 Identification of recombinant vector and Western blotting detection
1： 阴性对照(ddH2O)； 2： 阴性对照(空载自连对照组)；3： 阳性对照(GAPDH)；4： Marker，自上而下依次为5、3、2、1.5、1kb及750、500、250、100bp；5～12： KLF2 1～8号转化子
为了防止脱靶效应，设计了3条siRNA核苷酸序列。载体PHBLV-U6-ZSGreen-Puro用BamHI和EcoRI双酶切后，与分别退火获得的3个目的片段shRNA连接过夜，转化DH5a感受态细胞，涂板，挑菌，质粒抽提，送测序鉴定，结果表明插入的片段序列与设计合成的靶向KLF2核苷酸序列一致，见图3。siRNA1： 5′-CGGCACCGACGACGACCTCAA-3′；siRNA2： 5′-CCTACACCAAGAGTTCGCATCTGAA-3′；siRNA3： 5′-CGCTGCACATGAAACGGCACATGTA-3′。
构建好的的KLF2过表达及敲减慢病毒分别感染BGC823和MGC803细胞后，经嘌呤霉素筛选获得稳转细胞株，提取RNA和蛋白质进行RT-PCR和Western印迹法检测。结果显示，与对照组相比，KLF2过表达慢病毒感染后,BGC823细胞中KLF2 mRNA和蛋白水平明显升高(P<0.05)，见图4A、4C；KLF2敲减慢病毒感染后，MGC803细胞中KLF2 mRNA水平和蛋白水平下降(P<0.05)，见图4B、4D。
由此说明，KLF2过表达的BGC823稳转细胞和KLF2敲减的MGC803稳转细胞株构建成功。
图3 KLF2敲减重组质粒测序结果
Fig.3 Sequences of KLF2 knockdown recombinant plasmids
A： KLF2 shRNA1测序结果；B： KLF2 shRNA2测序结果；C： KLF2 shRNA3测序结果
图4 RT-PCR和Western印迹法检测BGC823及MGC803稳转株中KLF2表达量
Fig.4 The expressiong of KLF2 identified by RT-PCR and Western blot
A： 1为空白对照组，2为阴性对照组，3为KLF2过表达组；B： 1为空白对照组，2为阴性对照组，3～5为KLF2 shRNA1～shRNA3干扰组；C： BGC823稳转株中KLF2 mRNA含量；D： MGC803稳转株中KLF2 mRNA含量;* P<0.05
研究[3]表明，KLF2在血管、肺的发育方面有重要作用，敲除后小鼠会因为出血以及血管异常导致胚胎死亡。目前，相关研究在肺、心脏、骨骼肌、胰腺和胎盘等[3]组织中检测到了KLF2的表达，在骨髓[4]及淋巴细胞[5]中证明了KLF2的调节作用。KLF2在血管内皮中具有抗炎[5]、抗凝[6]、抗血管生成[7]以及抗动脉粥样硬化的[8]作用，而且与淋巴细胞的增殖、分化、迁移以及功能调控密切相关[9]。KLF2在多种恶性肿瘤中表达下降，在人体中发挥抗肿瘤作用[10]。KLF2在非小细胞肺癌中表达水平显著低于其癌旁正常组织，且KLF2低表达患者预后差[11]；研究[12]在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌中发现KLF2表达水平下调；Lian等[13]的研究表明，LncIRAIN通过抑制KLF2和p15促进胰腺癌细胞增殖。这些研究提示KLF2是一个抑癌基因，但是KLF2是否与胃癌的发生发展有关尚不十分清楚。
慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，达到持久表达目的序列的作用，显著提高目的基因或目的shRNA的转导效率，从而实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定得表达。本实验通过将目的基因连接在特定载体上，获得重组质粒，并导入大肠杆菌感受态中进行大量复制，最后利用慢病毒载体在胃癌细胞中实现KLF2基因的大量表达。
本实验通过慢病毒包装系统制备了KLF2过表达和敲减慢病毒，分别转染BGC823和MGC803胃癌细胞后，成功获得了KLF2过表达和敲减的稳转细胞株，RT-PCR和Western印迹法检测均证明过表达组KLF2 mRNA和蛋白表达量明显较对照组高(P<0.05)，敲减组则较对照组下降(P<0.05)。为后续研究KLF2基因在胃癌中的发生、发展作用机制奠定了基础。
【参考文献】
[1] CHEN W, ZHENG R, BAADE P D, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2)： 115-132.
[2] MILLER I J, BIEKER J J. A novel, erythroid cell-specific murine transcription factor that binds to the CACCC element and is related to the Krüppel family of nuclear proteins[J]. Mol Cell Biol, 1993,13(5)： 2776-2786.
[3] DAS H, KUMAR A, LIN Z, et al. Kruppel-like factor 2 (KLF2) regulates proinflammatory activation of monocytes[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006,103(17)： 6653-6658.
[4] RILEY J L, MAO M, KOBAYASHI S, et al. Modulation of TCR-induced transcriptional profiles by ligation of CD28, ICOS, and CTLA- 4 receptors[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99(18)： 11790-11795.
[5] DICHTL W, DULAK J, FRICK M, et al. HMG-CoA reductase inhibitors regulate inflammatory transcription factors in human endothelial and vascular smooth muscle cells[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003,23(1)： 58-63.
[6] TAKADA Y, SHINKAI F, KONDO S, et al. Fluid shear stress increases the expression of thrombomodulin by cultured human endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1994,205(2)： 1345-1352.
[7] KAWANAMI D, MAHABELESHWAR G H, LIN Z, et al. Kruppel-like factor 2 inhibits hypoxia-inducible factor 1α expression and function in the endothelium[J]. J Biol Chem, 2009,284(31)： 20522-20530.
[8] SIDDIQUI S S, SIDDIQUI Z K, UDDIN S, et al. p38 MAPK activation coupled to endocytosis is a determinant of endothelial monolayer integrity[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2007,292(1)： L114-L124.
[9] LEE J Y, SKON C N, LEE Y J, et al. The transcription factor KLF2 restrains CD4+T follicular helper cell differentiation[J]. Immunity, 2015,42(2)： 252- 264.
[10] NIE F Q, SUN M, YANG J S, et al. Long noncoding RNA ANRIL promotes non-small cell lung cancer cell proliferation and inhibits apoptosis by silencing KLF2 and P21 expression[J]. Mol Cancer Ther, 2015,14(1)： 268-277.
[11] FANG J, SUN C C, GONG C. Long noncoding RNA XIST acts as an oncogene in non-small cell lung cancer by epigenetically repressing KLF2 expression[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016,478(2)： 811-817.
[12] TANIGUCHI H, JACINTO F V, VILLANUEVA A, et al. Silencing of Kruppel-like factor 2 by the histone methyltransferase EZH2 in human cancer[J]. Oncogene, 2012,31(15)： 1988-1994.
[13] LIAN Y, WANG J, FENG J, et al. Long non-coding RNA IRAIN suppresses apoptosis and promotes proliferation by binding to LSD1 and EZH2 in pancreatic cancer[J]. Tumour Biol, 2016,37(11)： 14929-14937.
【Abstract】 Objective To establish gastric cancer cell line with over-expressed KLF2 and knockdown KLF2. Methods The recombinant plasmid GV358-KLF2 was constructed by cloning human KLF2 gene into AgeI/AgeI enzyme-digested GV358 vector, then the GV358-KLF2 plasmid was transfected into 293T cells to pack lentivirus. Three pairs of synthesized shRNAs were inserted into BamHI and EcoRI enzyme-digested PHBLV-U6-ZSGreen-Puro vector, and packed into lentivirus. The expression of KLF2 was detected by RT-PCR and Western blot. Results Recombinant plasmids GV358-KLF2 and KLF2-shRNA were successfully transfected into BGC823 and MGC803 respectively, and expressed stably. The results of RT-PCR and Western blotting showed that the expression of KLF2 was increased in KLF2-overexpressed BGC823 cells (P<0.05), and decreased in KLF2-knockdown MGC803 cells (P<0.05). Conclusion KLF2-overexpression BGC823 cell line and KLF2-knockdown MGC803 cell line have been successfully established, which may be used for the study of KLF2 function.
【Key words】 Krüppel-like factor 2； overexpression cell line； knockdown cell line； BGC823 cell； MGC803 cell
doi： 10.16118/j.1008-0392.2017.05.004
收稿日期： 2017-04-12
基金项目： 上海市自然科学基金(16ZR1429100)
【中图分类号】 R 735.2
【文献标志码】 A
【文章编号】 1008-0392(2017)05-0018-06