·基础研究·
【摘要】 目的 探讨Wnt/β-catenin信号通路对人神经干细胞(neural stem cells, NSCs)衰老的调控作用。方法 将人胚胎干细胞分化为NSCs，经MPTP(1-甲基- 4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)处理后，检测细胞的衰老表型和Wnt/β-catenin相关蛋白表达变化。分别应用AR-A014418、DKK1蛋白激活、抑制Wnt/β-catenin通路后，检测Wnt/β-catenin信号通路改变对细胞衰老表型的影响。检测各实验组和对照组中促炎因子CCL3、CXCL10、CXCL11、TNF-α的表达变化。结果 经MPTP处理后，NSCs显示衰老表型，表现为SA-β-gal阳性细胞明显增多，胞内ROS水平明显升高、细胞增殖活性受到抑制(P<0.01)。同时，Wnt1、β-catenin蛋白表达降低，磷酸化GSK3β表达升高。AR-A014418激活了Wnt/β-catenin通路，缓解了细胞的衰老表型；DKK1蛋白抑制了Wnt/β-catenin通路，加重了细胞的衰老表型。Wnt/β-catenin通路能调控NSCs衰老过程中促炎因子的表达。结论 Wnt/β-catenin信号通路能够调控MPTP诱导的NSCs衰老过程。
【关键词】 神经干细胞； 衰老； Wnt/β-catenin信号通路； 促炎因子
神经干细胞(neural stem cells, NSCs)能够自我更新，维持大脑稳态；还可分化为神经元，对促进认知功能的发展有重要作用[1]。随着机体的衰老，NSCs的增殖能力下降，出现衰老表型，导致老年性认知缺陷，如嗅觉功能障碍、空间记忆受损以及神经退行性疾病等[2]。目前，关于NSCs衰老机制的研究较少。MPTP广泛用于建立帕金森病的疾病模型，其代谢产物能抑制电子传递链的复合物I，导致线粒体功能障碍，引发衰老[3]。研究[4]发现，MPTP能损伤小鼠SVZ(subventricular zone)区成体NSCs的增殖和分化能力，显示类似衰老的表型。但是，他们对其衰老表型并没有进一步研究。另有研究[5]证明，在大脑衰老过程中，Wnt信号活性降低，进而导致了NSCs分化异常。本研究首先将人胚胎干(embryonic stem, ES)细胞分化为纯度均一、可稳定传代的NSCs，之后用MPTP处理NSCs，模拟其衰老过程，并探索NSCs衰老的分子调控机制。
1.1.1 细胞 采用人ES细胞系H9及分化后的NSCs。
1.1.2 试剂 MPTP购自美国Sigma公司，用 ddH2O 配制，工作浓度为400μmol/L；AR-A014418购自美国MCE公司，用DMSO配制，工作浓度为 1μmol/L；DKK1蛋白购自上海英基公司，用0.1% BSA配制，工作浓度为100ng/ml；SA-β-gal染色试剂盒、胞内ROS检测试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司；Nestin抗体购自美国Sigma公司；Sox2抗体购自美国Millipore公司；Tuj1抗体购自美国Santa Cruz公司；GFAP抗体购自丹麦Dako公司；Ki67抗体购自美国Thermo Fisher公司；Wnt1抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；磷酸化GSK3β抗体购自上海英基生物科技有限公司；反转录试剂盒、荧光实时定量PCR试剂盒购自购自天根生化科技(北京)公司；ECL超敏化学发光试剂盒、β-catenin抗体购自上海威奥生物科技有限公司。
1.2.1 人ES细胞诱导分化为NSCs 人ES细胞在胚胎干细胞培养基(含DMEM/F12培养基、20% KSR、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、0.1% β-巯基乙醇、10ng/ml bFGF)中培养，每天换新鲜培养基。将人ES细胞吹打成拟胚体(embryoid body, EB)，在不含bFGF的培养基中悬浮培养7d，每天半量换液。换为NSCs培养基(含DMEM/F12培养基、1% N2添加物、1%非必需氨基酸、10ng/ml EGF、10ng/ml bFGF)，培养14d，隔天换液，细胞会自动贴壁，并逐渐分化为rosette结构。将rosette结构的细胞吹打下来，接种至基质胶包被过的培养板中继续贴壁培养，待细胞长满后可进行传代。传代时，加入Accutase(细胞消化液)消化1min，离心收集细胞，吹打后接种。使NSCs在含1% FBS的培养基中生长，隔天半量换液，7～10d后，其自发分化为神经元和神经胶质细胞。
1.2.2 药物处理NSCs的实验 (1) MPTP诱导人NSCs衰老： 使用400μmol/L MPTP处理NSCs，36h 后，检测细胞的衰老情况。Wnt/β-catenin信号通路激活： 在细胞培养液中添加AR-A014418来激活Wnt/β-catenin信号通路。AR-A014418与MPTP同时添加，处理36h后，检测细胞的衰老表型。(2) 抑 制Wnt/β-catenin信号通路： DKK1可以阻断Wnt信号向胞内的传递，达到抑制该通路的功能[6]。DKK1蛋白与MPTP同时添加，处理36h后，检测细胞的衰老表型。
1.2.3 检测胞内ROS水平的变化 胞内ROS是在细胞代谢过程中产生的，ROS水平升高已成为衰老的重要标志之一。按照胞内ROS检测试剂盒操作步骤进行DCF-DA(2′，7′-二氯荧光乙酰乙酸盐)染色，使用荧光显微镜观察绿色荧光(激发波长 490nm，散发波长530nm)的强度，并使用Image-Pro Plus软件定量分析荧光强度。
1.2.4 检测SA-β-Gal阳性细胞 SA-β-gal染色是检测衰老细胞的经典方法。按照SA-β-Gal检测试剂盒操作步骤进行染色，在光学显微镜下观察和计数： 表达衰老特异性β-半乳糖苷酶的细胞为阳性细胞，呈现蓝色。
1.2.5 免疫荧光染色 将细胞铺至含有载玻片的24孔板中，加4%多聚甲醛，固定20min，用PBS润洗3遍。加入封闭液，封闭1h。加入含有待检测基因抗体的一抗稀释液，4℃过夜，用PBS润洗3遍。加入含有荧光二抗的稀释液，室温放置2h。最后10min加入DAPI，再用PBS润洗3遍。取出染色后的载玻片，轻轻放在透明封片剂上。干燥后，置于荧光显微镜下观察。
1.2.6 实时荧光定量PCR 收集药物处理组和对照组细胞，提取RNA，按照反转录试剂盒的步骤将RNA反转录成cDNA。按照定量PCR试剂盒的步骤进行实时荧光定量PCR，在ABI Prism 7500系统上进行扩增。以GAPDH为内参，应用相对定量法(2-ΔΔCt)进行定量分析。引物序列如下。GAPDH正向引物： 5′-GTGGACCTGACCTGCCGTCT-3′，反向引物： 5′-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3′；CCL3正向引物： 5′-AGTTCTCTGCATCACTTGCTG-3′，反向引物： 5′-CGGCTTCGCTTGGTTAGGAA-3′；CXCL10正向引物： 5′-GTGGCATTCAAGGAGTACCTC-3′，反向引物： 5′-TGATGGCCTTCGATTCTGGATT-3′；CXCL11正向引物： 5′-GACGCTGTCTTTGCATAGGC-3′，反向引物： 5′-GGATTTAGGCATCGTTGTCCTTT-3′；TNF-α正向引物： 5′-CCTCTCTCTAATCAGCC-CTCTG-3′，反向引物： 5′-GAGGACCTGGGAGTA-GATGAG-3′。
1.2.7 Western印迹法检测 收集细胞，提取细胞总蛋白，按照BCA蛋白定量试剂盒步骤测定蛋白浓度，煮沸变性。经过SDS-PAGE电泳，转膜，BSA封闭1h，一抗4℃孵育过夜，二抗孵育1h，用ECL化学发光法检测蛋白的表达，应用ImageQuantTM LAS 4000凝胶图像分析系统扫描分析结果。
采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，实验组与对照组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，每组3个样本。P<0.05为差异有统计学意义。
免疫荧光染色结果显示，经人ES细胞分化而来的NSCs表达特异性标记物Nestin和Sox2，说明NSCs建系成功，见图1A。NSCs自发分化5d后，表达神经元标记物Tuj1和星形胶质细胞标记物GFAP，并能显示很好的神经元和星形胶质细胞的形态，验证了其神经分化潜能，见图1B。
图1 MPTP诱导人NSCs发生衰老
Fig.1 Administration of MPTP induced significant senescent phenotypes in human ES-derived neural stem cells
A： 免疫荧光染色检测NSCs表达特异标记蛋白Nestin和Sox2；B： 免疫荧光染色检测NSCs的自发分化结果；C： SA-β-gal染色检测MPTP处理后SA-β-gal阳性细胞比率的变化；D： DCF-DA染色检测MPTP诱导的胞内ROS水平变化；E： 免疫荧光染色检测Ki67在MPTP诱导下的表达情况；与对照组相比，*P<0.01；标尺： 100μm
SA-β-gal染色结果表明，经MPTP处理后，NSCs的SA-β-gal阳性细胞明显增多(P<0.01)，见图1C。统计结果显示，在未处理组，SA-β-gal阳性细胞比率约为5%，处理组的阳性细胞比率升高至约18%。经MPTP处理后，NSCs的胞内绿色荧光强度显著升高，表示其胞内ROS水平在氧化压力下明显升高(P<0.01)，见图1D；Ki67阳性细胞比率明显降低(P<0.01)，见图1E。以上结果共同证明了NSCs在MPTP诱导的氧化压力下发生了衰老。
Western印迹法结果显示，在MPTP诱导的氧化压力下，细胞内Wnt1、β-catenin蛋白表达降低，而下游的磷酸化GSK-3β表达明显升高，见图2。上述实验结果提示Wnt/β-catenin信号通路异常可能是造成NSCs衰老的重要原因。
SA-β-gal染色结果显示，在MPTP处理后，添加AR-A014418组的NSCSA-β-gal阳性细胞比率比未添加组降低(P<0.05)，添加DKK1组的SA-β-gal阳性细胞比率比未添加组升高(P<0.05)，见图3A。而胞内ROS检测结果也显示，经MPTP处理后，添加AR-A014418组的胞内ROS水平比未添加组降低(P<0.05)，添加DKK1组的胞内ROS水平比未添加组升高(P<0.05)，见图3B。经MPTP处理后，添加AR-A014418组的Ki67阳性细胞比未添加组增加(P<0.05)，添加DKK1组的Ki67阳性细胞比未添加组减少(P<0.05)，见图3C。表明Wnt/β-catenin通路能调控NSCs衰老过程的增殖活性，进一步提示其会影响细胞衰老过程。
图2 Wnt/β-catenin信号通路在NSCs衰老过程中出现异常
Fig.2 Wnt/β-catenin pathway was suppressed during aging process of neural stem cells
图3 Wnt/β-catenin通路能调控NSCs衰老表型变化
Fig.3 Wnt/β-catenin pathway modulates aging phenotypes of neural stem cells
A： SA-β-gal染色检测改变Wnt信号通路后SA-β-gal阳性细胞比率变化；B： DCF-DA染色检测Wnt通路改变后胞内ROS水平变化；C： 免疫荧光染色检测Wnt信号通路改变后细胞Ki67的表达变化；
*P<0.05；标尺： 100μm
实时荧光定量PCR检测结果显示，经MPTP处理后，NSCs促炎因子CCL3、CXCL10、CXCL11、TNF-α的表达量明显升高(P<0.05)，而添加AR-A014418能抑制促炎因子的表达，添加DKK1组能增加促炎因子的表达(P<0.05)，见图4。这些结果证明，Wnt/β-catenin信号通路可能通过调控NSCs促炎因子的表达，以此来影响其衰老过程。
图4 Wnt/β-catenin信号能调控神经干细胞促炎因子的表达
Fig.4 Wnt/β-catenin pathway regulates the expression of proinflammatory cytokines
*P<0.05,**P<0.01
本研究将人ES细胞分化为NSCs，并用MPTP处理，探索NSCs的衰老过程及其分子调控机制。本研究发现，经MPTP处理后，NSCs显示衰老表型： 如胞内ROS水平升高、SA-β-Gal阳性细胞增多、增殖能力下降——细胞增殖缓慢是细胞衰老的重要特征[7]。同时，Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达也发生变化。并且，激活Wnt/β-catenin信号通路能够减轻衰老表型，抑制Wnt/β-catenin信号通路能够加重其衰老。这些实验结果证实了在NSCs中，Wnt/β-catenin信号通路能够调控NSCs的衰老，Wnt信号活性降低是其发生衰老的重要原因。
NSCs能够分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞，在大脑发育过程中发挥重要作用[2]。随着机体衰老，大脑成体NSCs的增殖和分化能力逐渐降低，成体NSCs的异常也损害了神经元再生能力[8]，引发各种神经系统疾病，如嗅觉受损、记忆和认知能力下降、抑郁和焦虑以及神经退行性疾病等[1，9]。而目前对于NSCs的衰老过程及其相关的分子调控机制研究较少。人ES细胞的分化全能性克服了获得人NSCs的困难，有利于对人NSCs衰老过程的研究[10]。
Wnt信号通路参与细胞的增殖、分化、机体的生长发育、肿瘤发生等过程，GSK-3β是Wnt通路上一个重要的负性调控因子，其活性升高可抑制Wnt通路。目前，多篇报道[5，11-12]已证实，Wnt信号通路对不同组织的衰老过程起到了调控作用。有报道[5]指出，在大脑中的衰老过程中，Wnt信号的活性降低，进而导致了NSCs分化的功能障碍；Hofmann等[12]发现，正向调节Wnt信号通路的Tle1和Lef1表达量的下降及Wnt配体胞外抑制剂Frzb的增加，最终会导致Wnt信号的减弱。然而，在另一些组织中，Wnt信号反而随着年龄的增加而被激活[13-14]。Liu等[13]报道，在加速老化的Klotho缺陷小鼠模型中祖细胞的衰老增加，可能是由Wnt信号活性的上调来介导的；并且体内、体外实验都证实，外源性Wnt的加入促进了细胞的衰老。Brack等[14]也证实，在老化的骨骼肌中，Wnt信号的增加抑制了肌细胞生成；不仅如此，用经典Wnt信号通路抑制剂Sfrp3处理骨骼肌干细胞之后，增加了细胞增殖，复苏了肌细胞生成。这些报道说明，Wnt信号确实在不同组织的衰老过程中起到了调控的作用。并且，相关研究[5]表明，神经组织似乎受Wnt信号影响更加明显。
有文献指出，促炎因子在细胞衰老过程中有重要促进作用[15]，Wnt信号也参与了炎症发生过程的调控[16-17]。Blumenthal等[18]发现Wnt5α在人类巨噬细胞免疫应答过程中上调，通过其受体Fzd5参与了促炎因子形成的调节；Pereira等[19]观察到败血症患者Wnt5α也出现了上调，并证实了人单核细胞中促炎因子是由Wnt5α诱导的。与Wnt5α不同的是，Wnt3α显示出了抗炎的功能。Wnt3α是激活Wnt/β-catenin通路的Wnt同源物，外源性的添加可介导抗炎反应[20]。Neumann等[17]发现，在使用GSK-3β抑制剂时，Wnt/β-catenin通路起到了抑制促炎因子表达的作用；同时，炎症反应诱导了Fzd1的表达，它是Wnt/β-catenin通路的诱导性受体，可增加细胞对该通路的敏感性。这些证据说明了Wnt/β-catenin通路可能作为反馈机制来限制过度炎症。除了其自身功能外，Wnt/β-catenin通路还与NF-κB信号通路有相互联系——通过抑制或增强NF-κB信号通路来达到抗炎或者促炎的功能；而NF-κB信号通路也能够对Wnt/β-catenin通路进行正向或者负向的调节，它们组成了一个复杂的调控网络，交叉调控，共同参与机体的炎症反应[16]。本研究证明，Wnt/β-catenin通路能调控NSCs衰老过程中促炎因子的表达，推测其可能是以此来影响细胞衰老过程。本试验的结论丰富了Wnt/β-catenin信号通路在神经组织中调控功能的研究，为NSCs衰老分子机制的研究提供了重要的理论基础。
【参考文献】
[1] WINNER B, KOHL Z, GAGE F H. Neurodegenerative disease and adult neurogenesis[J]. Eur J Neurosci, 2011,33(6)： 1139-1151.
[2] MING G L, SONG H. Adult neurogenesis in the mammalian brain： significant answers and significant questions[J]. Neuron, 2011,70(4)： 687-702.
[3] CHEN L J, GAO Y Q, LI X J, et al. Melatonin protects against MPTP/MPP+-induced mitochondrial DNA oxidative damage in vivo and in vitro[J]. J Pineal Res, 2005,39(1)： 34-42.
[4] L′EPISCOPO F, TIROLO C, TESTA N, et al. Wnt/β-catenin signaling is required to rescue midbrain dopaminergic progenitors and promote neurorepair in ageing mouse model of Parkinson’s disease[J]. Stem Cells, 2014,32(8)： 2147-2163.
[5] JESSBERGER S, CLARK R E, BROADBENT N J, et al. Dentate gyrus-specific knockdown of adult neurogenesis impairs spatial and object recognition memory in adult rats[J]. Learn Mem, 2009,16(2)： 147-154.
[6] 胡光辉，赖鹏，刘欢，等.Dickkopf- 4激活Wnt/PCP通路促进肾透明细胞癌的增殖及侵袭[J].同济大学学报(医学版),2015, 36(1)： 18-23.
[7] CHINTA S J, LIEU C A, DEMARIA M, et al. Environmental stress, ageing and glial cell senescence： a novel mechanistic link to Parkinson’s disease?[J]. J Intern Med, 2013,273(5)： 429-436.
[8] LUO J, DANIELS S B, LENNINGTON J B, et al. The aging neurogenic subventricular zone[J]. Aging Cell, 2006,5(2)： 139-152.
[9] DRAPEAU E, MAYO W, AUROUSSEAU C, et al. Spatial memory performances of aged rats in the water maze predict levels of hippocampal neurogenesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(24)： 14385-14390.
[10] PATANI R, LEWIS P A, TRABZUNI D, et al. Investigating the utility of human embryonic stem cell-derived neurons to model ageing and neurodegenerative disease using whole-genome gene expression and splicing analysis[J]. J Neurochem, 2012,122(4)： 738-751.
[11] FUJIMAKI S, WAKABAYASHI T, TAKEMASA T, et al. The regulation of stem cell aging by Wnt signaling[J]. Histol Histopathol, 2015,30(12)： 1411-1430.
[12] HOFMANN J W, MCBRYAN T, ADAMS P D, et al. The effects of aging on the expression of Wnt pathway genes in mouse tissues[J]. Age (Dordr), 2014,36(3)： 9618.
[13] LIU H, FERGUSSON M M, CASTILHO R M, et al. Augmented Wnt signaling in a mammalian model of accelerated aging[J]. Science, 2007,317(5839)： 803-806.
[14] BRACK A S, CONBOY M J, ROY S, et al. Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis[J]. Science, 2007,317(5839)： 807-810.
[15] CAMPISI J, ANDERSEN J K, KAPAHI P, et al. Cellular senescence： a link between cancer and age-related degenerative disease?[J]. Semin Cancer Biol, 2011,21(6)： 354-359.
[16] MA B, HOTTIGER M O. Crosstalk between Wnt/β-catenin and NF-κB signaling pathway during inflammation[J]. Front Immunol, 2016,7： 378.
[17] NEUMANN J, SCHAALE K, FARHAT K, et al. Frizzled1 is a marker of inflammatory macrophages, and its ligand Wnt3a is involved in reprogramming Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages[J]. FASEB J, 2010,24(11)： 4599-4612.
[18] BLUMENTHAL A, EHLERS S, LAUBER J, et al. The wingless homolog WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation[J]. Blood, 2006,108(3)： 965-973.
[19] PEREIRA C, SCHAER D J, BACHLI E B, et al. Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008,28(3)： 504-510.
[20] SCHAALE K, NEUMANN J, SCHNEIDER D, et al. Wnt signaling in macrophages： augmenting and inhibiting mycobacteria-induced inflammatory responses[J]. Eur J Cell Biol, 2011,90(6-7)： 553-559.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of Wnt/β-catenin signal pathway on aging process of human neural stem cells. Methods Human neural stem cells were induced from human embryonic stem cells. After MPTP (1-methyl- 4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin) treatment, the senescent phenotypes were detected and the expression of genes in Wnt/β-catenin pathway were examined. AR-A014418 and DKK1 proteins were used to activate or inhibit Wnt/β-catenin pathway，respectively. The effects of Wnt/β-catenin pathway on cell aging phenotypes were studied, the expression of proinflammatory cytokines CCL3, CXCL10, CXCL11 and TNF-α were detected. Results MPTP induced significant senescent phenotypes in neural stem cells, such as elevated SA-β-gal staining and intracellular ROS levels, compromised proliferation (P<0.01). Meanwhile, the expression of Wnt1 and β-catenin was inhibited and p-GSK3β protein levels increased significantly during this process of aging. Stimulation of Wnt/β-catenin pathway with AR-A014418 alleviated the aging phenotypes. Inhibition of Wnt/β-catenin pathway with DKK1 proteins aggravated premature aging process. Wnt/β-catenin pathway regulated the expression of proinflammatory cytokines. Conclusion Wnt/β-catenin signal pathway regulates the aging process of neural stem cells induced by MPTP treatment.
【Key words】 neural stem cells； aging； Wnt/β-catenin pathway； proinflammatory cytokine
doi： 10.16118/j.1008-0392.2017.05.001
收稿日期： 2017-06-12
基金项目： 国家自然科学基金(31471029)
【中图分类号】 R 741
【文献标志码】 A
【文章编号】 1008-0392(2017)05-0001-06