·综 述·
【摘要】 角膜基质注射是临床上较为少用的一种眼部给药途径，主要用作常规给药疗效较差的各种角膜病的补充治疗。随着近年来对多种难治性角膜病认知力的提高，国内外学者对角膜基质注射治疗在近年来做了大量研究，本文从角膜基质解剖结构、生理特点、注射的药代动力学、注射的要点、临床及科研应用、存在问题及治疗展望等几方面进行综述。
【关键词】 角膜； 角膜基质层； 角膜基质注射； 给药途径； 角膜病
角膜病是我国主要的致盲眼病之一，主要有感染、先天遗传、外伤、变性、营养不良和肿瘤等，其中感染性角膜炎占重要地位[1]。传统上会采用局部给药，如滴眼液、眼膏，使药物直接在局部起效，或是全身给药，如口服或静脉给药，使药物随血液循环到达眼部病灶，抑或是手术治疗，如清创术、角膜移植术等。近年来随着对角膜基质性质特点认识的转化，尤其是角膜手术中对角膜基质各种处理所表现的现象，如白内障超声乳化术毕采用角膜基质注射使切口达到水密状态，此法可减少传统缝线闭合法带来的损伤、散光、不适等问题[2]。对角膜基质认识的转变使角膜基质注射被认为在某些角膜病治疗上有极其重要作用，主要源于其给药更为直接、局部有效药物浓度维持时间更长、注射术后对角膜透明度影响较小等因素。
1.1 角膜基质的解剖
角膜内组织排列规则，无血管、无淋巴管组织，可分为角膜上皮层、前弹力层、角膜基质层、后弹力层及内皮细胞层，营养及代谢物质通过渗透作用进出角膜。完整的角膜上皮细胞和泪膜、基质层胶原纤维束的规则排列、角膜无血管以及“脱水状态”共同维持角膜透明性。而角膜基质作为重要的屈光间质，是人体最规整、最透明，同时又具有稳定屈光力的一种组织结构，由胶原纤维、角膜纤维细胞、黏蛋白等构成。角膜基质对维持角膜透明性有重要作用，角膜瘢痕组织继发于基质纤维的病理性改变，会使角膜失去透明性，从而影响视力和美观。
1.2 角膜的生理特点
角膜各层对局部使用药物的通透性不同，脂溶性物质易于通过上皮层，水溶性物质易于通过基质层。人体内还存在血眼屏障，包括血房水屏障、血视网膜屏障等，它使全身给药时药物在眼球内难以达到有效浓度，因此大部分眼病的有效治疗为局部给药。脂溶性或小分子药物比水溶性或大分子药物容易通过血眼屏障。例如，伏立康唑具有良好的血-眼屏障穿透功能,无论口服、局部滴眼、角膜基质内注射及玻璃体注射,均能在房水和玻璃体腔中达到治疗的有效浓度。Wu等[3]每小时局部使用10mg/ml伏立康唑滴眼液治疗淡紫拟青霉菌性角膜炎，炎症在1个月内得到控制，视力明显提高；Lekhanont等[4]角膜基质联合前房注射50μg/0.1ml伏立康唑治疗焦腐病菌性角膜炎，病变在1个月内得到缓解；Mithal等[5]回顾性研究12例丝状真菌性眼内炎病例，发现联合伏立康唑和两性霉素B玻璃体腔给药7个月后，患者保留眼球的同时视力有所提高。选择有良好血-眼屏障穿透功能的药物，采用局部给药方式可提高角膜组织中有效药物浓度，提高治疗效果。
1.3 角膜基质注射的药代动力学
角膜基质注射是经表面麻醉后通过微细注射针将药物从周边角膜注入深度约为1/2～1/3角膜厚度的基质内。微细注射针的粗细、注入的角度、剂量都会影响疗效。角膜基质注射常用于治疗感染性角膜病，尤其是真菌性角膜炎。注射后药物会逐步向深层和表层角膜扩散，可通过角膜渗透进入前房，也可通过房水循环分布于内眼，后经房水循环排除，其在体内代谢主要依靠多种酶[6]。
2.1 角膜基质注射应用于建立动物模型
运用角膜基质注射建立各种角膜病相关的动物模型意在模拟人眼多种角膜病，通过对所建立模型的种种干预，有助于了解相关角膜病的发生发展，或是某些治疗措施的疗效。例如，为了探究棘阿米巴性角膜炎血清抗体滴度，Wung等[7]利用角膜基质注射棘阿米巴滋养体和包囊建立棘阿米巴性角膜炎动物模型；为了探究替加环素对于耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌性角膜炎的治疗效果，Goktas等[8]利用角膜基质注射耐甲氧西林金黄色葡萄球菌建立了实验性细菌性角膜炎模型。此法操作方便，成功率高。
2.2 角膜基质注射治疗真菌性角膜病
真菌性角膜病多由浅入深，由点及面引发多种难治性角膜溃疡，是致盲率较高的一种感染性角膜病。在我国，抗生素和激素的广泛使用使其治疗更加艰难，普通的局部、口服和静滴治疗都难起效，疾病最后往往会演变成前房积脓、穿孔、眼内炎等，甚至最终摘除眼球。其问题在于： (1) 致病真菌对临床常用药物不敏感。(2) 即使部分药物有效也难在病灶处达到有效浓度。而运用角膜基质注射直接给药对后者疗效确切。
2.2.1 三唑类抗真菌药物 氟康唑与伏立康唑都是三唑类抗真菌药，在抗真菌感染方面有着肯定的作用，对人和动物的真菌感染均有治疗作用，将它用于角膜基质注射治疗难治性真菌性角膜炎疗效显著。Kalaiselvi等[9]对局部联合应用5%那他霉素及1%伏立康唑治疗无效的25例真菌性角膜炎(浸润超过1/2基质厚度)患者，采用角膜基质注射 50μg/0.1ml伏立康唑，分成5等份注射到角膜溃疡浸润灶周围，视情况重复注射，结果证实这种靶向给药方式可有效控制顽固性真菌性角膜炎进展，缩小溃疡灶。陈伟[10]对57例角膜溃疡直径为2～ 6mm 的真菌性角膜炎患者先采用0.02%氟康唑液反复清洗刮除表面坏死物，后避开光学区在角膜溃疡和卫星灶周围健康角膜部位做3～4个切口，角膜基质注射0.2%氟康唑2ml至切口侧壁，将药物注入角膜基质的同时也使角膜切口达到水密状态，再用0.02%的氟康唑液清洗患眼，术后用0.5%氟康唑滴眼液及妥布霉素滴眼液滴眼，直到溃疡边缘浸润现象完全消失以及溃疡直径<2mm时可停止重复注射。结果此法可有效促进溃疡愈合，且无患者并发角膜切口感染及内皮失代偿。
2.2.2 多烯类抗真菌药 与三唑类抗真菌药效用相似，两性霉素B是从链霉菌培养液中分离得到的多烯类抗真菌药，通过影响细胞膜通透性发挥抑制真菌生长，常用于治疗真菌感染。姚涛[11]对12例经抗真菌滴眼液滴眼辅以伊曲康唑口服治疗2周无明显疗效的真菌性角膜炎患者，先行角膜溃疡灶清创，再用注射用水稀释脂质体性两性霉素B，后用5%葡萄糖配置为0.2mg/ml浓度溶液(1ml注射液抽取0.05ml，实含10μg两性霉素B),1ml注射器接27/30G针头于病灶处角膜基质注射进行治疗，1周后视情况重复注射，所有患者感染得到控制。Huang等[12]报道了一个既往农作物接触史的真菌性角膜炎病例，确诊后立即每小时给予局部抗真菌治疗，数天后角膜浸润更加严重，并出现前房积脓。经病原菌检测为白色隐球菌感染后调整治疗为局部使用两性霉素B及氟康唑，辅以口服氟康唑，结果发现新浸润灶。随即采用角膜基质注射： 在无菌条件下先按0.5%的浓度配比将注射用两性霉素B粉末溶于蒸馏水，再与平衡盐溶混合获得浓度为100μg/0.1ml两性霉素B盐溶液，用1ml注射器连接30G针头抽取溶液将其注射至角膜基质内，术后继续局部抗真菌治疗。多次注射后角膜浸润好转，前房积脓逐渐消退，视力逐渐提高。Niki等[13]比较角膜基质注射伏立康唑治疗7位真菌性角膜炎患者的效果。其中4位为酵母菌感染，3位为丝状真菌感染。首先将伏立康唑用生理盐水稀释至浓度为1.0%，用 1ml 结核菌素注射器连接30G针头抽取0.1ml，注射入3～5处病灶周围健康角膜基质内。术后给予抗真菌药物口服或静滴。观察发现4位酵母菌性角膜炎患者很快被治愈，而3位丝状真菌性角膜炎患者治疗效果不理想，后行穿透性角膜移植术，治疗效果相对明显，且在移除的角膜深层基质中发现真菌。角膜基质注射抗真菌药物是治疗真菌性角膜病安全、有效的方法，但药物渗漏、代谢过快，或注入药物难以到达深层感染角膜，均可影响疗效。
2.3 角膜基质注射应用于联合手术治疗
联合治疗是使用多种治疗方法共同治疗某复杂或严重的临床疾病。学者们将角膜基质注射联合其他治疗方式，对复杂性角膜病起到积极有效的治疗作用。Haddad等[14]报道了一个顽固性枝顶孢菌性角膜炎病例，充分药物治疗3周后出现角膜溶解且即将发生角膜穿孔，以及迅速形成前房积脓的情况，立即行浅层角膜切削术，后将200mg白色冻干粉末状伏立康唑与19ml乳酸林格氏液混合获得20ml浓度为10mg/ml的伏立康唑浓缩液，再取部分用乳酸林格氏液稀释至浓度为50μg/0.1ml，用1ml结核菌素注射器连接30G针头将伏立康唑稀释液角膜基质联合前房注射，术后继予局部抗真菌治疗，3d 后患者临床症状改善，眼睑水肿及眼痛减轻，前房积脓及上皮缺损好转，6周后视力开始提高。You等[15]回顾性分析54例感染局限于1/2角膜厚度的真菌性角膜炎患者，经7d局部及全身抗真菌治疗无效后采用层状角膜切削术联合使用1ml胰岛素注射器连接30G针头进行角膜基质注射0.2%氟康唑，结果证实此法可有效提高患者视力，加速角膜溃疡愈合，且无明显并发症。复杂性角膜病的联合手术通常先将病变板层角膜去除后行角膜基质注射，去除病变板层角膜可创造良好角膜环境，使药物能较好渗透入角膜层间。
2.4 角膜基质注射治疗角膜新生血管疾病
由感染、变性、外伤等引起的角膜新生血管疾病不仅带来视力下降，也可能会造成角膜免疫功能缺失，影响角膜移植预后。近年来，角膜基质注射贝伐单抗、雷珠单抗等开始运用于治疗角膜新生血管疾病。Ahn等[16]报道1例贝伐单抗治疗无效后，雷珠单抗有效治疗角膜新生血管的病例；Kim等[17]研究认为相比于雷珠单抗，贝伐单抗能更有效和稳定的减退角膜新生血管。虽然许多学者表示角膜基质注射治疗角膜新生血管疾病疗效确切，但缘于没有大量临床和实验数据支持，其安全性及长期预后有待考证。
2.5 角膜基质注射应用于生物工程
2.5.1 基因工程 基因工程是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或异常引起的疾病。其中基因转染方式是基因治疗的关键因素之一。转染方式主要以体外转染培养细胞为主，但临床运用相对繁琐及其结果不稳定，眼科学者们机智地运用角膜基质注射的转染方式简化了操作程序，提高了结果的稳定性，达到基因治疗目的。Matthaei等[18]评估称角膜基质注射是基因载体运用的一种重要模式。Carlson等[19]将携带巨细胞病毒的腺病毒(pCMV)介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)受体基因通过角膜基质注射的方法转染至小鼠角膜基质细胞内，用活体显微镜和共聚焦三维重建分别检测到小鼠角膜基质细胞内增强型绿色荧光蛋白体内、体外均可表达。Li等[20]将miR-206注射入碱烧伤的小鼠角膜基质内，直接攻击连接蛋白43(Cx43)，可改善体内外的炎症反应，减轻角膜混浊和新生血管形成。Toyono等[21]在正常小鼠的角膜基质内注射抑制血管生成素-7表达的shRNA，结果角膜上出现大量的新生血管。
2.5.2 细胞工程 Syed-Picard等[22]用 33G 针头将成人牙髓细胞注射入小鼠角膜基质内，前者含有成人干细胞，注射后可分化，产生含有胶原及蛋白的角膜基质细胞外基质,不影响角膜的透明度，不诱导免疫反应，是角膜基质再生的新方法。
2.6 角膜基质注射应用于眼部美容
针对角膜白斑患眼，传统角膜染色需去除上皮后进行染色，可能影响其愈合。采用联合飞秒技术进行角膜染色的方法虽然提高了便捷性和安全性，但价格过于昂贵。Park等[23]对33只眼进行不连续经上皮穿刺染色，术中使用1ml一次性注射器连接30G针头将黑炭颗粒悬浮染料避开瘢痕区经上皮注射入前基质层内，注射点直径 1.5～ 2mm，间距 1mm，每只眼注射点数量不超过30个，染色效果满意。Liu等[24]为32例确诊为角膜白斑且视力恢复无望的患者定制个性化角膜染色方案： 分为经板层角膜染色(ICS)和经表层角膜染色(SCS)两种。ICS是使用虹膜恢复器做一个达角膜基质层，深为1/5～1/2角膜厚度的切口，用虹膜恢复器将墨水置入切口中；SCS是运用23G针头从角膜表面穿刺将墨水注射入角膜基质。随访至36周所有患者染色成功，无并发症，无墨水漏出或渗漏到前房，无前房炎症，达到良好的眼部美容效果。
角膜基质注射是眼科治疗途径的重要辅助手段，但其应用中也存在一些问题。角膜内有丰富的感觉神经末梢，注射可能引发患者疼痛及不适。在其运用中常常需要重复注射，作为有创操作,会对角膜产生机械损伤。另外，注射的药物可能对眼内组织存在毒性作用。Qu等[25]研究表明，角膜基质注射两性霉素B的浓度为5、10μg/0.1ml时，不引起角膜毒性；当注射浓度为20μg/0.1ml时可诱导角膜水肿、角膜上皮糜烂和新生血管的出现。 Mimouni等[26]比较角膜基质注射联合局部应用5%那他霉素对兔镰刀菌性角膜炎的疗效，结果兔眼结膜充血、角膜浸润的大小及程度均显著改善，但前房积脓和角膜新生血管加剧。王军华等[27]给予碱烧伤角膜新生血管动物模型角膜基质注射25mg/ml阿瓦斯汀，1次/周，4周后角膜新生血管抑制良好、混浊减轻,但角膜超微结构损伤重于局部滴眼组和结膜下注射组。
综上所述，角膜基质注射起初作为一种辅助的角膜给药途径，主要用于感染性尤其是真菌性角膜炎症的治疗，新近在角膜新生血管、生物工程以及角膜美容方面也都有新的拓展应用，但在操作技术、适应症及药物种类及使用浓度等方面尚需规范。
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Progress on the application of corneal intrastromal injection
【Abstract】 Corneal intrastromal injection is not a widely used ocular drug administration route, mainly applied as a supplementary method for corneal diseases with poor efficacy after conventional administrations. With the increasing understanding of various refractory corneal diseases, the corneal intrastromal injection has been studied extensively in recent years. In this article, the anatomical and physiological characters of corneal stroma; pharmacokinetics, clinical and scientific research applications, related problems and treatment prospects of corneal intrastromal injection are reviewed.
【Key words】 cornea; corneal stroma; corneal intrastromal injection; administration route; corneal disease
doi： 10.16118/j.1008-0392.2017.04.026
收稿日期： 2016-06-03
基金项目： 国家自然科学基金项目(81470028)；教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-13-0420)；中央高校基本科研业务费专项资金资助(1508219071)
【中图分类号】 R772.2
【文献标志码】 A
【文章编号】 1008-0392(2017)04-0128-05