·基础研究·
【摘要】 目的 研究增生性瘢痕胶原结节中成纤维细胞(fibroblast， Fb)生物学行为及其意义。方法 收集瘢痕切除植皮手术中切除的瘢痕组织及剩余的正常皮肤标本，H-E染色观察正常皮肤与瘢痕组织胶原结节及非结节区域的组织形态学差异，免疫组织化学法检测正常皮肤与瘢痕组织中Ki67及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达及分布情况。结果 与正常皮肤及增生性瘢痕非胶原结节区域相比，增生性瘢痕胶原结节中可见大量Fb，Ki67及α-SMA阳性表达的Fb亦主要分布于胶原结节区域。结论 胶原结节处Fb增殖活跃，并大量分化为肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB)。MFB的大量存在提示局部组织处于高张力水平，后者可能是导致Fb功能活跃、大量存在从而形成胶原结节的重要机制之一。
【关键词】 增生性瘢痕； 胶原结节； 成纤维细胞； 肌成纤维细胞； Ki67； α-SMA
增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)好发于损伤深度深及真皮的创伤，常引起患者的不适及功能障碍，影响患者的生活质量，是临床亟待解决的难题，但其发病机制尚未阐明[1]。胶原结节是病理性瘢痕的特征性结构[2]，因瘢痕组织局部胶原纤维呈涡轮状或结节状排列而得名。胶原结节在瘢痕组织中长久存在，是胶原代谢紊乱的主要区域[3]。但对胶原结节的研究主要为早期的细胞水平，目前分子水平的研究较少，对其分子水平组织学特征的研究有助于探寻胶原结节的成因，深入了解瘢痕的形成机制。瘢痕增生与成纤维细胞(fibroblast， Fb)的生长及代谢有密切的关系，因此，本研究中主要观察HS胶原结节中Fb的生物学行为特征。
1.1 标本的采集与处理
选取瘢痕切除植皮手术中切除的人皮肤瘢痕组织及剩余的正常皮肤组织，所有标本经4%(40g/L)多聚甲醛固定，常规脱水，透明，浸蜡，包埋，制备 4μm 连续切片，黏附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上备用。
1.2 组织学观察
组织块标本经石蜡切片、H-E染色后，置光学显微镜下观察。
1.3 免疫组织化学染色
石蜡切片，常规脱蜡至水；0.05%胰蛋白酶 37℃ 消化2h；磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L， pH 7.4)漂洗3min×3次；内源性过氧化酶封闭液(3% H2O2)封闭10min，室温；PBS漂洗3min×3次，室温；20g/L牛血清蛋白封闭15min；加抗α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin， α-SMA)单克隆抗体(英国，Abcam公司，稀释度1∶200)及抗Ki67多克隆抗体(英国，Abcam公司，稀释度1∶600)，4℃过夜；PBS洗3min×3次；加鼠兔通用二抗(GTVisionTMI型聚合物)室温孵育1h；PBS洗 3min×3次；5mg二氨基苯乙胺(DAB)+PBS 10ml+0.3% H2O2 100μl，光学显微镜下控制显色；自来水冲洗终止显色，苏木精复染，脱水、中性树脂封片。免疫组化结果以棕黄色深染为阳性表达。每个检测指标均重复3次。采用Zeiss图像分析系统(德国，Zeiss公司)采集图片。
2.1 光学显微镜观察
HS非胶原结节区域胶原排列呈编织状，染色深，Fb数量少，核小而深染，接近正常皮肤组织的胶原排列及细胞形态特征(图1A、图1B)；胶原结节区域胶原染色较浅，可见大量Fb，细胞核大而淡染(图1C)，提示结节处的Fb功能活跃，非结节区域瘢痕组织相对趋于成熟。
图1 光镜下人正常皮肤组织及HS不同区域的组织形态学比较(H-E， ×20)
Fig.1 Histological comparison between normal skin and different parts of hypertrophic scar(H-E， ×20)A： 人正常皮肤组织，胶原呈编织状排列，Fb核小而深染；B： HS非胶原结节区域，胶原染色深，呈编织状排列，Fb数量少，核小而深染，接近正常皮肤组织；C： HS 胶原结节区域(箭头所示)，胶原染色较浅，可见大量Fb，核大而淡染
2.2 Ki67的表达及分布
通过免疫组织化学法检测正常皮肤组织及HS不同区域Fb中增殖细胞核抗原Ki67的表达。Ki67阳性细胞多数为核着色，呈棕黄色，少数为较弱的细胞质染色。正常皮肤组织Fb中少有Ki67表达(图2A)；HS中Ki67表达阳性的Fb主要分布于胶原结节部分，而非结节部分仅有少量Fb呈阳性表达(图2B、图2C)。提示HS胶原结节区域Fb增殖活跃。
2.3 α-SMA的表达及分布
本研究通过免疫组织化学法检测人正常皮肤组织及HS不同区域α-SMA的表达。正常皮肤组织α-SMA阳性表达仅见于血管，Fb中并无阳性表达(图3A)；瘢痕组织非结节区域除血管呈强阳性染色外，Fb几乎不表达α-SMA，而胶原结节区域可见大量Fb呈α-SMA阳性表达(图3B、图3C)，提示胶原结节区域有大量Fb分化为肌成纤维细胞(myofibroblast， MFB)。
图2 免疫组织化学法示人正常皮肤组织及HS不同区域Fb中Ki67的表达
Fig.2 Expression of Ki67in fibroblasts of normal skin and different parts of hypertrophic scar shown by immunohistochemistry
A: 正常皮肤组织，Fb中少有Ki67表达；B: HS非结节区域，仅有少量Fb显示Ki67阳性表达；C: HS胶原结节区域，大量Fb呈Ki67阳性表达(×20)
图3 免疫组化示人正常皮肤组织及HS不同区域Fb中α-SMA的表达
Fig.3 Expression of α-SMA in fibroblasts of normal skin and different parts of hypertrophic scar shown by immunohistochemistry
A: 人正常皮肤组织，α-SMA阳性表达仅见于血管；B: HS非结节区域，除血管呈强阳性染色外，Fb几乎不表达α-SMA；C: HS胶原结节区域，箭头所示大量Fb呈α-SMA阳性表达(×20)
HS胶原排列紊乱，常在早期呈涡旋状结构，进而演变成胶原结节[4]。研究发现，小于12个月的受调人群中胶原结节的发生率为33%，而超过24个月的受调人群发生率达到81%，可见胶原结节的发生率随着时间的推移而增加[5]。通常，随着时间的推移，1年以上的增生性瘢痕往往趋于成熟，但胶原结节作为HS胶原代谢紊乱的主要区域[3]，其发生率在瘢痕趋于成熟时反而增加，令人费解。对这一现象做出合理解释，有助于我们进一步了解瘢痕过度形成机制。
创伤修复中，Fb的主要功能是合成细胞外基质。组织学上，增生性瘢痕以Fb的过度增生和细胞外基质的过度聚集为特征，因此Fb作为瘢痕形成的效应细胞就成为研究的重点。因目前为止Fb没有特异性标记物，故对其鉴别主要靠在皮肤组织中所在的部位及细胞形态特征来区分。
本研究通过H-E染色对比正常皮肤组织及HS胶原结节及非结节区域组织学特征发现，HS非结节区域在胶原的排列，Fb数量及细胞形态方面均接近于正常皮肤组织，而胶原结节区域则仍聚集了大量的Fb，核大而淡染，该结果说明，HS非结节区域已趋于成熟，而HS胶原结节区域Fb功能仍然活跃。该结果与Kischer等[6]的电子显微镜观察结果相符——胶原结节中有大量的Fb，其细胞内大量高度扩张的粗面内质网和发达的高尔基复合体显示该处Fb功能活跃。
Ki67是1983年由Gerdes等[7]发现的一种增殖细胞核抗原，存在于细胞周期中除G0期之外的所有阶段。Ki67于细胞周期的G1期开始表达，在S期及G2期表达增加，至M期达高峰，在细胞分裂晚期很快消失。因其半衰期短，脱离细胞周期后被迅速降解，故已成为检测细胞增殖活性最可靠的指标[8]。本研究对Ki67的检测结果显示胶原结节处Fb仍增生活跃，而非结节区域Fb增殖趋于稳定。该结果与H-E染色的观察结果相符，提示胶原结节区域Fb的大量存在与Fb增殖活跃有关。
正常皮肤组织中α-SMA仅表达于血管平滑肌细胞中，创伤愈合过程中，参与创伤修复的Fb中亦可见α-SMA的表达[9]，此类表达有α-SMA的Fb又称MFB。与Fb相比，MFB不仅因表达α-SMA而具有更强的收缩能力，还具有更旺盛的合成功能[10]。MFB在正常愈合的伤口中(如手术切口)只是短暂出现，创面愈合后很快消失[9]，但在病理性瘢痕中因凋亡不足而持续大量存在[11]。MFB的短暂出现可促进伤口收缩，有利于创面愈合，但其持续存在则可引发诸如瘢痕挛缩等系列问题。研究显示，Fb向MFB的分化依赖于创面的抗收缩力[12]，且α-SMA的表达水平依赖于基质张力水平[13]，高张力可促进Fb高表达α-SMA，而低张力下，即使给予TGF-β1(可促进α-SMA表达)刺激，Fb中α-SMA的表达量增加依然不明显，可见，张力水平是影响α-SMA表达的主导因素，α-SMA的表达水平是组织张力水平的间接反映。本研究结果显示，正常皮肤组织中α-SMA阳性表达仅限于血管部分，Fb并无阳性表达；而在瘢痕组织中，除血管外，Fb中亦可见α-SMA阳性表达，但主要局限于胶原结节。说明胶原结节处有大量的MFB存在。该结果提示，相对于非结节区域，胶原结节处仍处于高张力水平。皮肤组织张力是导致瘢痕过度增生的重要因素[12]。基质或组织的高张力水平不仅可促进Fb向MFB的转化，亦可促进Fb的增殖[14]。因此推测，局部组织高张力的持续存在，促进了增殖活跃、合成旺盛的MFB局部大量存在，进而导致胶原结节的形成，这可能是胶原结节发生率随着时间推移而增加的原因。而对于皮肤组织张力的来源，一方面可能与皮下肌肉组织的运动有关[6]，一方面可能与皮肤组织的固有张力密切相关[15]。
综上所述，瘢痕组织中胶原结节处Fb大量存在，增殖活跃，并大量分化为MFB。MFB的大量存在提示局部组织处于高张力水平，后者可能是导致Fb功能活跃、大量存在从而形成胶原结节的重要机制之一。由此也进一步体现了张力因素在瘢痕过度形成中的重要性。这也可以解释为何目前压力治疗仍然是治疗增生性瘢痕最有效的方法。探索更有效的缓解张力的方法将有助于增生性瘢痕的防治。
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Biological behavior of fibroblasts in collagen nodules of hypertrophic scar
【Abstract】 Objective To investigate the biological behavior of fibroblasts (Fbs) in collagen nodules of hypertrophic scar. Methods Scar and normal skin specimens were collected from patients with scar excision and skin grafting operation. The histological differences between normal skin and collagen nodules and non-nodular area were observed by light microscopy with H-E staining. The expression and distribution of Ki67 and alpha-smooth muscle actin (α-SMA) in normal skin and scar tissue were detected by immunohistochemical analysis. Results Compared with the normal skin and non-nodular area in hypertrophic scar， collagen nodules showed a large amount of Fb， and the positive expression of Ki67 and α-SMA was distributed mainly in Fbs located in collagen nodules. Conclusion Fibroblasts in collagen nodules are proliferated actively， and differentiated to myofibroblasts， leading to the high tension of local tissue， which may be an important mechanism of collagen nodules formation.
【Key words】 hypertrophic scar; collagen nodule; fibroblast; myofibroblast； Ki67; α-SMA
doi： 10.16118/j.1008-0392.2017.04.003
收稿日期： 2017-04-25
基金项目： 国家自然科学基金(81000838)
【中图分类号】 R619+6
【文献标志码】 A
【文章编号】 1008-0392(2017)04-0013-04