±s表示，多组计数资料使用组内两两比较，两组计数资料使用χ2检验。以组织病理学诊断为金标准，计算DNA定量分析诊断子宫内膜不典型增生和子宫内膜癌的符合度、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。P<0.05为差异有统计学意义。·临床研究·
【摘要】目的 探讨子宫内膜细胞DNA定量分析对子宫内膜癌的筛查价值。方法 选取2013年9月至2016年9月行子宫内膜细胞DNA定量分析及宫腔镜下诊断性刮宫的患者，共428例。采用子宫内膜细胞采集器直接获取子宫内膜细胞标本，结合液基薄层细胞学制片和Feulgen染色技术进行DNA定量分析，以宫腔镜下诊刮的组织病理学诊断为“金标准”，分析子宫内膜细胞DNA定量分析筛查子宫内膜癌及其癌前病变的符合度、灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。结果 子宫内膜DNA定量分析筛查子宫内膜癌及其癌前病变的符合度、灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为86.92%、91.43%、86.03%、56.14%和98.09%。子宫内膜癌的发生、发展过程中可出现异倍体细胞，少数非子宫内膜癌的病例也可出现DNA异倍体细胞，但>5c细胞大都少于3个。结论 子宫内膜DNA定量分析用于子宫内膜癌及其癌前病变的筛查，简单易行，安全无痛，准确性高，且具有客观性和可重复性。
【关键词】子宫内膜； DNA定量细胞学； 子宫内膜肿瘤； 癌前状态； 筛查
子宫内膜癌是女性生殖道常见的恶性肿瘤之一。根据美国癌症协会统计，2015年美国子宫内膜癌的新发病例数为54870例，10170例患者死于子宫内膜癌，居妇科恶性肿瘤的首位[1]。因此，子宫内膜癌的筛查受到重新审视和重视，现急需解决的问题是筛查策略[2]。目前，我国子宫内膜癌诊断主要通过分段诊刮术或宫腔镜下诊断性刮宫进行组织病理学诊断。但诊刮操作相对复杂，有子宫穿孔和感染等风险，而且患者有明显疼痛感，不适宜用于子宫内膜癌筛查；宫腔镜下手术，价格昂贵。本研究采用子宫内膜细胞采集器直接获取内膜细胞标本，结合液基薄层细胞学制片和Feulgen染色技术进行DNA定量分析，并以宫腔镜下诊刮的组织病理学诊断为“金标准”，评价其筛查子宫内膜癌及其癌前病变的临床应用价值。
1.1 一般资料
选取2013年9月至2016年9月在上海市闵行区中心医院就诊，有明确手术指征需行宫腔镜检查且接受子宫内膜细胞DNA定量分析的患者，共428例。患者年龄25～84岁，平均(49.8±5.6)岁，绝经后患者308例。阴道不规则出血162例(37.85%，162/428)，其中，绝经后患者为42例(25.93%，42/162)；绝经后阴道异常排液7例(1.64%，7/428)；绝经后无临床症状，但经阴道彩色多普勒超声提示宫腔内不均质占位或经阴道彩色多普勒超声提示子宫内膜的厚度≥5mm 有259例(60.51%，259/428)。
1.2 方法
1.2.1 纳入标准 (1) 阴道不规则出血或阴道异常排液；(2) 绝经期无临床症状，经阴道彩色多普勒超声提示宫腔内不均质占位或经阴道彩色多普勒超声提示子宫内膜的厚度≥5mm[3]；(3) 本研究获得上海市闵行区中心医院伦理委员会的批准，经知情告知愿意参加本次课题研究，且愿意配合。剔除标准： (1) 排除外阴、阴道、宫颈及卵巢病变所引起出血者；(2) 生育期由妊娠相关疾病引起的阴道出血；(3) 急性阴道炎、宫颈炎；(4) 急性或亚急性盆腔炎；(5) 急性严重性全身性疾病；(6) 手术前体温>37.5℃。
1.2.2 细胞学标本和组织病理学标本的采集 静脉麻醉后，首先用一次性细胞采集器采集子宫内膜细胞，标本放置细胞保存液中,24h内送本院细胞学中心制片并行DNA定量分析。再行宫腔镜下诊刮或占位切除术，将组织标本用常规甲醛溶液固定，送本院病理科行组织病理学检查。
子宫内膜细胞采集器(上海宇度医学科技股份有限公司)有一外套管，管芯前端有一毛刷，长(16±0.5) mm,直径(10±0.5) mm,在宫腔采集标本前和取材后将采集刷藏于套管内，以防沾染宫腔以外的细胞。将细胞采集刷在外套管保护下缓慢送入宫底，回缩外套管，暴露采集环，向同一方向(顺时针或逆时针)转动10周，回纳采集刷至套管内，退出宫颈。释放采集刷于细胞保存液[麦克奥迪(厦门)医疗诊断系统有限公司]。采用液基薄层细胞制片和Feulgen染色。
1.2.3 组织病理学检查 组织病理学切片由两位病理学专业人员独立阅片。组织病理学的诊断参考WHO2003年诊断标准[4]。根据子宫组织的病理分类标准，归为以下几类： (1) 未见异常(包括萎缩性子宫内膜、增生期或分泌期子宫内膜)；(2) 子宫内膜良性病变(包括子宫内膜息肉、子宫内膜单纯性增生过长、子宫内膜复杂性增生过长、子宫内膜炎、黏膜下肌瘤等)；(3) 子宫内膜不典型增生；(4) 子宫内膜癌。
1.2.4 细胞DNA定量分析及诊断标准 所有Feulgen染色片用麦克奥迪(厦门)医疗诊断系统有限公司的全自动细胞图像分析系统(DNA image cytometry, DNA-ICM)进行扫描处理，通过测定染色细胞核的平均光密度(integrated optical density， IOD)来判断细胞核的含量。以c(content)为单位来衡量细胞DNA含量，G1/G0为2c细胞(2倍体细胞)，而G2/M细胞为4c细胞(4倍体细胞)。正常情况下，组织细胞多处于G0期，除S期细胞可以出现异倍体外，一般不会出现异倍体细胞，只有在肿瘤等不正常的情况下，才出现这种异倍体细胞。该系统对每张玻片上6000个以上的细胞进行扫描测定。经扫描后的每个细胞核均有123个特征值，其中包括形态特征、吸光特征、具体结构特征、Markovian和非Markovian结构特征以及长度特征等。DNA-ICM根据不同细胞成分所具有的不同特征参数来自动完成细胞分类和计数过程。标准对照细胞为同张玻片上的100个正常上皮细胞和部分淋巴细胞,所测出的IOD为2c参考值，每个细胞核根据不同的参数特征值可被分类为： 正常二倍体细胞(DNA含量为2c)，增生或疑似病变细胞(DNA含量为2.5～5c)以及病变细胞(DNA含量>5c)等。对于那些出现DNA含量>5c异倍体细胞的玻片均需通过病理学专业人员在显微镜下逐一对其进行核实，以排除该系统将垃圾和重叠的细胞核误认为癌细胞或异常细胞。由于DNA含量是对二维结构测定的，它不完全反映染色体的倍数，为了避免以上差别，在测定DNA含量时用DNA指数(DNA index， DI)来表示DNA含量，即被测细胞的DNA-IOD值与正常细胞DNA-IOD值的比值。结果评价：对于DNA倍体分析结果出现DNA含量≥5c 的细胞或增生细胞占检测细胞总数的10%以上或有异倍体细胞峰即为阳性，反之为阴性[5]。DNA异倍体细胞类型按DNA含量>5c异倍体细胞个数分为4种，无：未见DNA含量>5c异倍体细胞；可见少量：1～ 2个DNA含量>5c异倍体细胞；可见：3～9个DNA含量>5c异倍体细胞；可见大量：≥10个DNA含量>5c异倍体细胞。
1.3 统计学处理
采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析,数据采用 ±s表示，多组计数资料使用组内两两比较，两组计数资料使用χ2检验。以组织病理学诊断为金标准，计算DNA定量分析诊断子宫内膜不典型增生和子宫内膜癌的符合度、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 子宫内膜细胞DNA定量分析筛查子宫内膜癌及其癌前病变的准确性
将子宫内膜癌和子宫内膜不典型增生作为筛查子宫内膜癌的指标，以组织病理学诊断为“金标准”，子宫内膜DNA定量分析筛查子宫内膜癌及其癌前病变的符合度为86.92%，灵敏度为91.43%，特异度为86.03%，假阴性率为8.57%，假阳性率为13.97%，阳性预测值为56.14%，阴性预测值为98.09%，见表1。
表1 428例子DNA定量分析与组织病理学结果比较
Tab.1 Comparison of DNA quantitative analysis and pathological diagnosis for 428 cases [n(%)]
DNA定量分析组织病理学诊断正常子宫内膜子宫内膜良性病变子宫内膜不典型增生子宫内膜癌合计阳性13(12.38)37(14.62)21(87.50)43(93.48)114(26.64)阴性92(87.62)216(85.38)3(12.50)3(6.52)314(73.36)合计105(24.53)253(59.11)24(5.61)46(10.75)428(100.00)
2.2 不同子宫内膜组织DNA定量分析图像和细胞学图片
正常子宫内膜组织DNA定量分析图像和细胞学图片见图1。大多数细胞在DI为1.0的位置,少部分细胞核在DI为1.0～2.0的位置(细胞增生)，没有细胞核的DI在超过2.5的位置。子宫内膜癌的DNA定量分析图像和细胞学图片见图2。大量的DNA异倍体细胞在DI为1.5～2.0及 3.5～ 4的部位形成2个非整倍体细胞峰。
图1 正常子宫内膜组织DNA定量分析结果和细胞学图片
Fig.1 Result of DNA quantitative analysis and cytological image in normal endometrium
A： 正常子宫内膜DNA倍体分析；B： 正常子宫内膜细胞，细胞核Feulgen染色(×40)
图2 子宫内膜癌的DNA定量分析结果和细胞学图片
Fig.2 Result of DNA quantitative analysis and cytological image in endometrioid adenocarcinoma
A： 子宫内膜癌DNA倍体分析；B： 子宫内膜腺癌细胞，细胞核Feulgen染色(×40)
2.3 不同子宫内膜组织DNA定量图像分析结果
不同子宫内膜组织中，DNA含量>5c异倍体细胞类型差异有统计学意义(P<0.05)，但两两比较显示，未见异常与良性病变之间差异无统计学意义(χ2=1.352,P=0.509)，子宫内膜不典型增生与子宫内膜癌之间差异无统计学意义(χ2=3.306,P=0.347)，而未见异常与子宫内膜不典型增生(χ2=93.719,P=0.000)、未见异常与子宫内膜癌(χ2=117.905,P=0.000)，良性病变与子宫内膜不典型增生(χ2=174.988,P=0.000)、良性病变与子宫内膜癌(χ2=218.114,P=0.000)之间差异均有统计学意义；所以DNA含量>5c细胞个数越多，则子宫内膜癌的风险越高，见表2。
表2 不同子宫内膜组织DNA含量>5c的异倍体细胞类型比较
Tab.2 Comparison of the cell types in different endometrium grouped with DNA aneuploid >5c
子宫内膜组织病变类型nDNA含量>5c异倍体细胞类型无可见少量可见可见大量未见异常105921300子宫内膜良性病变2532163430子宫内膜不典型增生2433117子宫内膜癌46361423
目前，子宫内膜癌在美国、欧洲等发达地区，已接近新发妇科恶性肿瘤的50%。近年来，随着经济发展，人们饮食结构和生活习惯也发生改变，随之代谢性疾病增加，子宫内膜癌出现了发病率升高和发病年轻化的趋势。北京、广州等经济发达的地区，子宫内膜癌已经取代宫颈癌，居女性生殖器官恶性肿瘤首位[6]。
早期(FIGO I、Ⅱ期)子宫内膜癌的5年生存率高达90%以上，而Ⅲ、Ⅳ期患者的5年生存率分别仅为57%～66%和20%～26%[7]。因此，子宫内膜癌的早期诊断是改善子宫内膜癌预后的重要举措。子宫内膜癌筛查应该受到重视。
2015年，美国癌症协会指南[8]中推荐，35岁以上具有子宫内膜癌高危因素的患者，需要每年进行筛查，可以考虑用子宫内膜活检的方式进行筛查。日本妇科肿瘤协会发布的指南[9]，针对年龄50岁以上或绝经后，最近6个月内有异常出血症状的女性进行子宫内膜癌的筛查，推荐筛查的方法为子宫内膜细胞学法。可见目前无统一的子宫内膜癌筛查方法。但子宫内膜微量组织和子宫内膜细胞学的筛查，与病理医师的主观判断息息相关，且目前仍缺乏统一的诊断标准。在我国这两种方法均没有作为子宫内膜癌的筛查方法进行推广使用。本研究应用子宫内膜细胞进行DNA定量分析来筛查子宫内膜癌及其癌前病变。
肿瘤的发生多由于DNA碱基对发生改变，即基因突变引起的。这种基因的突变往往引起染色体重组，染色体片段的丢失或增多。随着肿瘤的进一步发展，染色体的对数可发生改变，增加或减少染色体的数目，此时就可以引起异倍体细胞。DNA含量的变化要早于细胞形态的变化[10]，测定DNA含量的变化要优于观察整个细胞形态的变化。有92%的实体肿瘤细胞存在异倍体，因此检测到DNA异倍体高度提示恶性肿瘤，且有很高的特异性，细胞核DNA含量已成为肿瘤病理诊断、鉴别诊断和预后判断的一种重要方法。图像分析技术是集计算机技术和数学形态原理，准确地以数据形式表达各种图像信息技术，使病理学从传统的基于描述性质的形态学转变为定量的分析，更具有客观性和可重复性。
目前，国内外应用本研究方法筛查子宫内膜癌及其癌前病变的甚少。本研究显示，子宫内膜DNA定量分析筛查子宫内膜癌及其癌前病变的灵敏度为91.43%，特异度为86.03%，阳性预测值为56.14%，阴性预测值为98.09%，与杨曦等[11]应用子宫内膜细胞学筛查子宫内膜癌及其癌前病变基本相符。子宫内膜细胞学检查(endometrial cytology test, ECT)进行子宫内膜癌的筛查，与本研究一样具有痛苦小、出血少、操作方便、经济快捷及安全，但诊断主要依靠病理医师判读，目前仍缺乏细胞学家和病理学家一致认可的子宫内膜细胞学诊断标准。而本研究DNA定量分析具有客观性和可重复性，可降低人为主观因素的影响。
赵文波等[12]认为，子宫内膜癌的异倍体率为72%，本研究子宫内膜癌的异倍体率为91.42%，稍高于以往的研究，可能与以下因素有关： (1) 以往研究多采用石蜡包埋的子宫内膜组织或新鲜的子宫内膜组织印片，经过处理后获得子宫内膜单细胞悬液，细胞破碎多，杂质多，影响图像分析。取材时只取肿瘤的一个部位检测，无法反映肿瘤的真正特性，从而影响结果的准确性。新鲜组织经多点活检后的所得细胞其异倍体检出率较石蜡标本高很多。本研究采用子宫内膜细胞采集器采取细胞，进行液基细胞薄层制片，直接获取子宫内膜细胞，故获得的细胞数量多、细胞破碎少、组织碎片等杂质少。将细胞单层均匀分布在玻片上，能使细胞结构和细胞核内的DNA保存在很好的状态[11]，此举将增加异倍体的检出率。(2) 以往的DNA倍体的研究多采用流式细胞技术，当恶性细胞数量占所取标本细胞数量的比例很小时(不正常细胞<1%)，检测结果仍为阴性，因此流式细胞仪检测DNA含量的灵敏度不够理想。而DNA-ICM仅当样本细胞<300时进行测定可能引起误差，本研究无1例因细胞数少而无法进行检测。(3)用DNA定量分析系统进行肺癌[13]、胃癌[14]和腹水良恶性鉴别[15]等的诊断，其灵敏度为78%～94%，与本研究基本相符。
本研究中DNA定量分析对子宫内膜癌及其癌前病变漏诊的6例患者均为围绝经期有阴道不规则出血的病例。围绝经期导致不规则出血的病因大致有子宫内膜不规则增生、子宫内膜增生症(伴或不伴细胞异型性)和子宫内膜癌等。由于上述病变的本质是一个连续的疾病谱系，其为二倍体肿瘤的可能性较大。DNA定量分析无法发现二倍体肿瘤，结合免疫组化P53、PTEN基因检测等方法，以提高其准确性。
本研究也发现： 少数非子宫内膜癌病例也可出现DNA异倍体细胞，但DNA含量>5c细胞少，多为1～2个，当炎症发生时进入细胞周期的细胞增多(即S-G2-M期细胞增多)，但这种增生细胞不会超过所有细胞的10%，所以出现个别的异倍体细胞(一般5c)是正常的。而子宫内膜不典型增生和子宫内膜癌的患者中，出现≥3个(DNA含量>5c)细胞的比率明显增多。可见DNA含量>5c的异倍体细胞越多，患子宫内膜癌及其癌前病变的风险越大。
综上所述，子宫内膜DNA定量分析用于子宫内膜癌及其癌前病变的筛查，简单易行，安全无痛，准确性高，且具有客观性和可重复性。用于子宫内膜癌及其癌前病变的筛查是可行的，具有临床应用价值。尤其适用于绝经期子宫内膜癌高危人群的筛查。但本研究的病例较少，尚需要更大规模的临床数据验证。
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DNA quantitative cytology in diagnosis of endometrial cancer
【Abstract】Objective To evaluate the application of DNA quantitative cytology in diagnosis of endometrial cancer. Methods Total 428 patients underwent endometrial DNA quantitative cytology test and hysteroscopic curettage from September 2013 to September 2016．Histopathologic diagnosis was used as the gold standard for determining the accuracy of DNA quantitative cytology. Results The sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV) and accuracy of DNA quantitative cytology in diagnosis of endometrial cancer were 91.43%，86.03%，56.14%，98.09% and 86.92%，respectively． Conclusion The results indicate that DNA quantitative cytology can be a useful tool for the screening of endometrial cancer.
【Key words】endometrium； DNA quantitative cytology； endometrial neoplasms； precancerous conditions； screening
doi：10.16118/j.1008-0392.2017.03.012
收稿日期：2016-10-13
基金项目：上海市闵行区自然科学基金(2014MH2017)
【中图分类号】R 737.33
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2017)03-0060-06