杜仲叶提取物对人精子膜功能损伤的保护作用

(1. 同济大学附属同济医院泌尿外科，上海 200065; 2. 同济大学附属同济医院中医科，上海 200065)

【摘要】目的探讨杜仲叶提取物对人精子膜功能氧化损伤的保护作用。方法应用梯度离心法，分离出正常精子作为模型，在采用次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)环境下，使用维生素C(0.15mg/ml)及小、中、大剂量杜仲叶提取物(150、300、600mg/L)共同孵育精子悬液，检测精子膜中的丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力，通过精子尾部低渗膨胀试验、精子顶体完整率评估精子膜功能。结果与模型组相比，维生素C和小、中、大剂量杜仲叶提取物在相同的条件下，均可提高精子悬液SOD活力，降低MDA含量(P<0.01)。与维生素C比较，小、中剂量的杜仲叶提取物对ROS所致精子膜的氧化损伤的保护作用差异无统计学意义(P>0.05)，大剂量的杜仲叶提取物明显优于维生素C(P<0.01)。与模型组比较，小、中、大剂量杜仲叶提取物组的精子顶体完整率和精子尾部低渗膨胀试验结果均有统计学意义(P<0.01)，大剂量杜仲叶提取物对精子的保护作用最显著(P<0.01)。结论杜仲叶提取物对人精子膜结构和功能损伤具有显著的保护作用。

杜仲(Cortex Eucommiae)是中国名贵的中药。杜仲叶提取物作为杜仲的主要活性物质可以清除机体内自由基、还原氧化物质等，进而达到保护机体的作用[1-2]。有研究[3]表明，杜仲叶提取物对雄性生殖系统和生殖内分泌功能有促进作用。男性不育最普遍的病因之一是精子功能缺陷，这也是治疗男性不育的一个难点。评估精子受精能力的重要指标是精子膜结构的完整性。在影响精子膜功能的诸因素中，活性氧类(reactive oxygen species, ROS)的作为主要的影响因素受到关注。ROS介导的脂质过氧化作用可引起精子膜结构与功能改变，是男性不育的一个重要病因[4]。本研究应用体外培养的方法，观察杜仲叶提取物抑制人精子膜结构和功能氧化损伤的作用,及其对精子受精能力的保护作用，进一步明确杜仲叶提取物治疗男性不育的作用机制。

1 材料与方法

杜仲叶提取物购自湖南远航生物科技有限公司;Percoll液、次黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、维生素C低渗膨胀液购自美国Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒购自南京建成生物工程研究所；伊红溶液购自美国Santa Cruze公司；WLJY-9000型伟力彩色精子质量检测系统购自北京伟力新世纪科技发展有限公司；HP7530紫外可见分光光度计购自美国安捷伦科技有限公司。

1.2 正常精子模型制备

招募20位20～32岁的有生育能力和健康自愿供精者，禁欲1周后自慰取精液，存于干燥无菌试管中，使用辅助精子分析系统分析：白细胞计数<1×105/ml，正常形态精子>70%，精子密度>70×106/ml，a级精子+b级精子>60%，a级精子>30%。采用Percoll梯度离心法制备具有正常生理功能的精子作为实验对象。在20ml离心管中先加入2ml 90%Percoll，在40%Percoll的上层轻缓加入2ml已液化的精液，将80%Percoll层和5ml的Earle液混匀，离心半径13.5cm,4000r/min,离心10min，精子数量调为30×106/ml。

将精子悬液分为6组,样本放置在5%CO2、37℃ 培养箱中孵育1h：正常组用PBS缓冲液(pH 7.4)，模型组用次黄嘌呤(2mmol/L)-黄嘌呤氧化酶(60mU/ml)产生ROS，阳性药对照组用维生素C(0.15mg/ml)+次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(浓度同模型组)、杜仲叶提取物小剂量组(150mg/L)+次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(浓度同模型组)、中剂量组(300mg/L)+次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(浓度同模型组)、大剂量组(600mg/L)+次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(浓度同模型组)。

1.4 测定精子膜的MDA含量

按试剂盒说明书操作，孵育精子悬液1h，用紫外可见分光光度计测定，用波长532nm比色。用MDA的产量来表示精子膜脂质过氧化损伤的程度。MDA含量(nmol/106)=(D样品-D空白)/(D标准-D空白)×标准品浓度(10nmol/ml)×样品稀释倍数。

1.5 测定精子膜的总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)活力

按试剂盒说明书操作，孵育精子悬液1h，用紫外可见分光光度计测定，用波长550nm比色。SOD活力单位抑制反应50%的SOD量。SOD活力(U/ml)=(D对照-D样品)/(D对照×50%)×样品稀释倍数。

1.6 精子顶体完整率

孵育各组精子悬液1h后，取样精子悬液5μl涂片，置于86%乙醇10min，置于瑞-姬氏染液染色 1min，染片置于86%乙醇中浸泡6s，再置于油镜下镜检，计算顶体完整精子所占的百分率。精子顶体完整率(%)=顶体完整的精子数/精子总数×100%。

1.7 测定精子尾部低渗膨胀

孵育精子悬液20min，加37℃低渗膨胀液 1ml，37℃水浴置30min；再加入伊红溶液0.1ml，混匀；置室温5min后取10μl于载玻片上，在200倍显微镜下计数500个精子中b～g型精子百分率。

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，检验方差齐性及分析单因素方差。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MDA含量和T-SOD活力

精子悬液孵育1h后，与正常组比较，模型组的MDA含量显著增高(P<0.01),T-SOD活力显著降低(P<0.01)；维生素C组和杜仲叶提取物小、中、大剂量组的MDA含量显著低于模型组(P均<0.01),而维生素C组和杜仲叶提取物小、中、大剂量组的T-SOD活力均显著高于模型组(P均<0.01)。小、中组杜仲叶提取物的MDA含量和维生素C组无显著差别。小、中剂量杜仲叶提取物T-SOD活力和维生素C组无显著差别(P>0.05)；和维生素C组比较，大剂量组杜仲叶提取物明显差异(P<0.01)，见表1。

与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01；与维生素C组比较，cP<0.01

2.2 精子顶体完整率

在使用次黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶体系后，精子膜和顶体结构明显受损。与正常组比较，模型组、维生素C组和杜仲叶提取物小、中、大剂量组的精子顶体完整率显著降低(P均<0.01)；维生素C组和杜仲叶提取物小、中、大剂量组的精子顶体完整率显著高于模型组(P均<0.01)；小、中剂量组杜仲叶提取物组与维生素C组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与维生素C组比较，大剂量组杜仲叶提取物的精子顶体完整率明显提高(P<0.01)，见表2。

与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01；与维生素C组比较，cP<0.01

2.3 精子尾部低渗膨胀试验结果

与正常组比较，模型组的精子总膨胀率(b～g型)和g型精子膨胀率均显著降低(P均<0.01)。与模型组比较，维生素C组和杜仲叶提取物小、中、大剂量组的精子尾部膨胀率(总膨胀率、g型精子膨胀率)显著上升(P均<0.01)。小、中剂量的杜仲叶提取物的精子尾部膨胀率(总膨胀率、g型精子膨胀率)和维生素C相比，差异均无统计学意义(P均>0.05)。与维生素C组比较，大剂量组杜仲叶提取物的精子尾部膨胀率(总膨胀率、g型精子膨胀率)差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。

与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01；与维生素C组比较，cP<0.01

3 讨论

在导致男性不育的原因中，氧化应激是普遍的病理原因，约占50%。ROS是一种重要的信号分子，它能够通过活化对氧化还原敏感的蛋白激酶和转录因子来调控基因转录，这也是许多炎症反应的重要机制[5]。ROS包括氧离子、自由基和超氧负离子，主要通过破坏精子细胞膜，降低精子活力以及和卵子结合的能力导致不育。质膜中的脂质与蛋白质是按一定的极性结构排列并参与精卵识别、精子获能和顶体反应全部生化过程,精子膜表面富含多聚不饱和脂肪酸,对脂质过氧化反应极为敏感[6-7]。

精子膜是精子引起顶体反应和完成与受精过程有关活动的基础。精子膜在有氧条件下极不稳定，易发生精子膜脂质过氧化，造成精子膜的损伤、细胞死亡。而精子膜的结构与其活动功能有着密切的关系[8]。

本研究通过次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生ROS，使其对人精子产生过氧化作用，观察杜仲叶提取物对人精子膜结构和功能氧化损伤的保护作用。结果表明，在ROS的作用下，人精子膜结构和膜功能明显损伤。小、中、大剂量组杜仲叶提取物均可降低精子悬液MDA含量，提高SOD活力，提高精子顶体完整率和精子尾部低渗膨胀，说明杜仲叶提取物对ROS所致精子膜的氧化损伤和精子膜结构、膜功能具有保护作用。与维生素C相比较，大剂量杜仲叶提取物的保护作用更显著。有学者[9]研究了不同质量浓度(100、200、400和800mg/L)杜仲叶提取物的量效关系,认为高浓度的杜仲叶提取物才能抑制新生血管的生成，从而对人结直肠癌产生治疗效果。故本次选择了质量浓度为150、300、600mg/L 的杜仲叶提取物进行实验。至于继续增加杜仲叶提取物的质量浓度能否加强其作用有待进一步研究。

杜仲叶提取物的主要成分是多糖，对羟基自由基有清除作用，具有很好的抗脂质过氧化作用[10]，可以显著提高精子存活率，降低脂质过氧化过程所导致的精子细胞的死亡。本研究发现，杜仲叶提取物对于精子细胞ROS损伤具有显著的保护作用，这种作用初步确定与清除自由基和抗脂质过氧化过程有关。

本研究说明，杜仲叶提取物能通过清除自由基及脂质过氧化产物，对精子膜结构和功能具有显著保护作用，这可能是杜仲叶提取物治疗男性不育弱精子症的作用机制之一。

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(1. Dept. of Urology， Tongji Hospital， Tongji University， Shanghai 200065， China; 2. Dept. of Traditional Chinese Medicine， Tongji Hospital， Tongji University， Shanghai 200065， China)

【Abstract】Objective To investigate the protective effect of extraction ofEucommia ulmoides oliv (eucommin) on the function of human sperm membrane under oxidative injury. Methods The normal sperms were isolated with percoll gradient centrifugation, and the reactive oxygen species (ROS) were produced with hypoxanthine-xanzine xanzine (HX-XO) system. The human sperms suspension in ROS environment was treated with vitamin C (0.15mg/ml) or different concentrations of eucommin (150, 300 and 600mg/L). The malondialdehyde (MDA) content and superoxide dismutase (SOD) activity of sperm membranes were detected. The function of sperm membrane was analyzed by sperm hypotonic expansion test and the rate of intact acrosome was detected. Results Compared with oxidative model group, SOD activity of sperm suspension was improved，and the content of MDA was reduced in vitamin C group and eucommin groups (P<0.01); the effect of high-dose eucommin group was more marked than that of vitamin C group (P<0.01). There was significant difference in the rate of intact acrosome and sperm hypotonic expansion test between model group and eucommin groups (P<0.01), and the high-dose eucommin group showed better result than other groups (P<0.01). Conclusion Eucommin has a protective effect on human sperm membrane function from oxidative injury.

作者简介：相俊(1979—)，男，主治医师，硕士.E-mail： wallyxiang@126.com

杜仲叶提取物对人精子膜功能损伤的保护作用

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

2 结果

3 讨论