±s表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。·基础研究·
【摘要】目的 探讨内源性硫化氢(hydrogensulfide, H2S)对二乙基二硫代氨基甲酸盐(diethyldithiocarbamate, DDC)诱导的大鼠胰腺纤维化模型的影响。方法 健康雄性Wistar大鼠48只，随机分成对照组、模型组、NaHS组和PAG组，每组各12只。其中模型组间大鼠腹腔内注射10%DDC溶液(700mg/kg)，隔日1次，共注射15次；NaHS组于造模的同时再注射H2S供体硫氢化钠(sodium hydrosulfide, NaHS)(56μmol/L)，1次/d；PAG组于造模的同时再注射DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine, PAG)(45μmol/L)，1次/d；对照组和模型组则注射同等体积的生理盐水，1次/d。实验后第30天，处死各组大鼠，留取动脉血和胰腺组织;采用H-E染色，在光学显微镜下观察胰腺组织学变化;采用Masson染色，测胶原纤维含量并进行病理学评分；采用ELISA法检测胰腺组织中Ⅰ型胶原、TGF-β1含量；采用Western印迹法检测胰腺组织中Smad7蛋白的表达，并检测血浆H2S含量。结果 模型组、NaHS组和PAG组大鼠胰腺组织病理学评分、胶原纤维含量、Ⅰ型胶原和TGF-β1明显高于对照组(P<0.05)，而模型组明显高于NaHS组(P<0.05)，PAG组明显高于模型组、NaHS组(P<0.05)。对照组、模型组和PAG组血浆H2S含量明显低于NaHS组(P<0.05)，模型组明显低于对照组(P<0.05)，PAG组明显低于模型组(P<0.05)。模型组、NaHS组和PAG组胰腺组织中Smad7蛋白表达明显低于对照组(P<0.05)，NaHS组、模型组明显高于PAG组(P<0.05)，NaHS组明显高于模型组(P<0.05)。结论 在DDC诱导的大鼠胰腺纤维化模型中，内源性H2S能够有效抑制实验性大鼠胰腺纤维化，其机制可能是通过TGF-β1/Smad信号通路上调胰腺组织中Smad7蛋白的表达及下调TGF-β1的表达。
【关键词】胰腺纤维化； 硫化氢； Ⅰ型胶原； 转化生长因子-β1； Smad7蛋白； 大鼠
慢性胰腺炎纤维化的本质是细胞外基质(extracellular matrix, ECM)，主要是Ⅰ型胶原的产生过多而降解相对不足，使过多的ECM成分沉积在胰腺组织，最终导致胰腺纤维化[1]。而Smad7蛋白是TGF-β1/Smad信号转导途径的主要抑制性调控蛋白，其大量表达能够改善胰腺纤维化[2]。内源性硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是继NO和CO之后的第3类气体信号分子。研究[3-5]发现，H2S在肝脏、肾脏和肺等组织器官中均具有一定的抗纤维化作用，但H2S对慢性胰腺炎组织是否起抗纤维化保护作用至今鲜有报道。本实验通过腹腔内注射二乙基二硫代氨基甲酸盐(diethyldithiocarbamate, DDC)建立大鼠胰腺纤维化模型，采用PAG溶液、NaHS溶液干预，观察各组大鼠胰腺组织中Ⅰ型胶原、TGF-β1和Smad7蛋白含量的变化，探讨H2S在大鼠慢性胰腺炎纤维化中的作用及其可能机制。
1.1 实验动物
健康雄性Wistar大鼠48只，7～8周龄，体质量220～240g，由上海交通大学附属第六人民医院动物实验中心提供，饲养于SPF级环境中，适应性饲养 3d，自由取食和饮水，光/暗12h循环，随机分为4组： 对照组、模型组、NaHS组、PAG组，每组各12只。
1.2 主要试剂
硫氢化钠(sodium hydrosulfide, NaHS)、醋酸锌、对苯二胺盐酸盐、三氯化铁、三氯乙酸购自美国Sigma公司；DDC、DL-炔 丙基甘氨酸(DL-hydroxylamine, PAG)试剂购自上海笃玛生物科技有限公司；COL I、TGF-β1 ELISA试剂盒购自武汉优尔生商贸有限公司；HRP标记的GAPDH优质内参购自上海康成生物有限公司；Smad7一抗购自Abcam公司；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自Southern Biotech公司。
1.3 模型制备
实验采用分次DDC腹腔内注射制作大鼠胰腺纤维化模型[6]。实验前大鼠禁食12h，自由饮水。除对照组以外的其他各组大鼠腹腔注内射10% DDC溶液700mg/kg(体质量)，隔日1次，共注射15次；NaHS组各大鼠于造模的同时再向腹腔内注射NaHS溶液56μmol/kg，1次/d；PAG组各大鼠于造模的同时再向腹腔内注射PAG溶液 45μmol/L，1次/d；对照组和模型组腹腔内注射同等体积的生理盐水，1次/d。各组大鼠每次给药1h后，自由饮水进食。每日观察记录各组大鼠饮食、大小便、皮毛、活动情况、精神状态和体质重变化，记录死亡情况。实验后第30天，以颈椎脱臼法处死大鼠。
1.4 数据采集
1.4.1 胰腺病理学检查 4%多聚甲醛固定胰腺组织，常规石蜡包埋，连续切片，用苏木精和H-E染色，光学显微镜下观察；并对切片行Masson染色，数字成像，每张切片随机观察5个不重叠视野，利用图像分析软件计算蓝染区(胶原纤维沉积)占整个切片总面积的百分比，取平均值(单位： %)，进行组织学评分，评分标准[2，7-8]如下。(1) 炎性细胞浸润程度： 5个HP视野内均值<5个为0分，6～20个为1分，21～40个为2分，>40个为3分；(2) 坏死程度： 无为0分，小灶性坏死为1分，小片状坏死为2分，大片状坏死为3分；(3) 结构破坏： 无为0分，灶性结构破坏为1分，部分结构破坏为2分，大部分结构破坏为3分；(4) 有无黏液水肿： 无为0分，有为1分；(5) 有无细胞萎缩： 无为0分，有为1分；(6) 纤维化程度： 5个HP视野内胶原纤维所占的面积均值<1.0%为0分，1.1～5.0%为1分，5.1～10.0%为2分，10.1～20.0%为3分，>20.0%为4分。以上分值之和0～3分为正常，4～6分为轻度CP，7～9分为中度CP，>9分为重度CP。
1.4.2 血清H2S含量测定 各组大鼠处死前，心脏穿刺采血0.5～1ml，注入含肝素抗凝的密封真空采血管中。静置2h后，离心半径 16cm，3000r/min，低温离心10min，分离血浆，收集上清液，采用去蛋白法[7]测定血浆H2S含量，使用分光光度计在670nm处测定吸光度值(D670)。根据H2S标准曲线计算出上清液中H2S的含量(单位： μmol/L)。
1.4.3 ELISA法测定胰腺组织中Ⅰ型胶原、TGF-β1的含量 制备病变胰腺组织匀浆，4℃，离心半径 16cm，1000r/min,离心 20min，收集上清液，参照ELISA试剂盒说明书进行操作，根据标准曲线分别计算各组胰腺组织中Ⅰ型胶原和TGF-β1的含量。
1.4.4 Western印迹法测定胰腺组织中Samd7的含量 取各组大鼠胰腺组织加入冷生理盐水制备成10%匀浆，4℃，离心半径16cm，2000r/min,离心 8min，留取上清液，提取蛋白，用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离，积层胶电压80V恒压50min，分离胶电压120V恒压电泳至溴酚蓝刚出胶底部止。将PVDF膜平衡后，在100V恒压下转印60～120min；将PVDF膜进行5%脱脂奶粉溶液室温封闭；兔抗鼠Smad7多克隆抗体(1∶1000稀释)37℃孵育2h；二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶20000 稀释)；ECL化学发光显色，暗室中拍片。以GAPDH作为内参。将结果扫描成电子图像，以Image Pro Plus 5.0图像分析软件分析，计算出吸光度值，取前后两者的比值作为Smad7蛋白的相对表达量。
1.5 统计学处理
应用SPSS 19.0统计软件分析，计算资料数据均采用 ±s表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 一般情况
从实验开始至实验结束，各组大鼠体质量均有增加，以对照组增长最多，其次是NaHS组、模型组，增长最少的是PAG组。从实验第2周至实验结束，除对照组以外的其他各组大鼠均出现不好动、毛发无光泽、精神不佳。PAG组死亡2只大鼠，模型组死亡1只。PAG组、模型组和NaHS组大鼠均出现眼眶和鼻出血伴震颤；与模型组比较，PAG组较重，NaHS组较轻。
2.2 病理结果
在光学显微镜下，对照组大鼠胰腺组织无明显组织学损伤的表现，个别仅见轻微出血和少量炎性细胞浸润；模型组胰腺组织可见炎症细胞浸润、纤维组织增生，腺泡细胞间隔增宽；NaHS组胰腺组织可见少量的炎症细胞浸润和纤维组织增生；PAG组胰腺组织腺泡细胞萎缩变形、部分腺泡细胞萎缩并被脂肪组织代替，纤维组织增生，炎症细胞浸润最明显。模型组、NaHS组与PAG组大鼠胰腺组织损伤评分及胶原纤维面积百分比明显高于对照组(P<0.05)；模型组明显高于NaHS组(P<0.05)；PAG组明显高于模型组和NaHS组(P<0.05)，见表1、图1。
表1 各组组织学评分和胶原纤维面积百分比
Tab.1 The macroscopic score, collagen area of all groups 
±s)
组别n组织学评分/分胶原面积百分比(%)对照组122.00±0.6 17.77±3.79 模型组117.82±0.98*43.36±7.22*NaHS组124.08±0.79*#28.69±5.31*#PAG组109.10±0.74*#△60.96±9.89*#△
与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05；与NaHS组相比，△P<0.05
2.3 胰腺组织中Ⅰ型胶原、TGF-β1及血浆H2S含量
模型组、NaHS组和PAG组胰腺组织中Ⅰ型胶原、TGF-β1含量显著高于对照组(P<0.05)；PAG组显著高于模型组和NaHS组(P<0.05)；模型组显著高于NaHS组(P<0.05)。对照组、模型组和NaHS组血浆H2S含量明显高于PAG组(P<0.05)；NaHS组明显高于对照组和模型组(P<0.05)；模型组明显高于PAG组(P<0.05)，见表2。
2.4 胰腺组织中Smad7蛋白含量
模型组/GAPDH、NaHS组/GAPDH和PAG组/GAPDH胰腺组织中Smad7蛋白含量明显低于对照组/GAPDH(P<0.05)；模型组/GAPDH明显低于
NaHS组/GAPDH(P<0.05)；PAG组/GAPDH明显低于模型组/GAPDH、NaHS组/GAPDH(P<0.05)，见表3、图2。
表2 胰腺组织Ⅰ型胶原、TGF-β1和血浆H2S含量
组别nⅠ型胶原/(ng·ml-1)TGF-β1/(pg·ml-1)H2S/(μmol·L-1)对照组1223.71±1.35 61.18±8.9029.68±2.96 模型组1175.12±5.97*229.98±19.82*18.97±1.88*NaHS组1245.87±2.36*#114.87±15.06*#83.75±7.68*#PAG组1098.81±8.55*#△497.56±26.49*#△12.60±1.27*#△
与对照组比，*P<0.05；与模型组比，#P<0.05；与NaHS组相比，△P<0.05
表3 胰腺组织Smad7的相对含量
Tab.3 The relative content of Smad7 in all groups ±s)
组别nSmad7/GAPDH对照组120.593±0.031模型组110.137±0.009*NaHS组120.175±0.016*#PAG组100.085±0.011*#△
与对照组比，*P<0.05；与模型组比，#P<0.05；与NaHS组相比，△P<0.05
图1 各组大鼠胰腺组织H-E染色和Masson染色结果(×100)
Fig.1 Pancreatic pathological section of different groups(×100)
图2 各组大鼠胰腺组织中Smad7蛋白的表达水平
Fig.2 Expression levels of Smad7 protein in pancreatic tissue of all groups
H2S具有抗炎、抗氧化应激、抗细胞增殖和扩张血管等多种生物学作用[9]。而内源性H2S在哺乳动物体内主要由L-半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase, CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)催化下产生，CBS主要表达于哺乳动物的大脑和海马等中枢神经系统，CSE主要表达于肝、肾和胰腺等组织或器官[10]。Bhatia等[11]发现，PAG既可显著降低胰腺CSE mRNA表达水平，又能通过作用于CSE的磷酸吡哆醛结合位点抑制CSE活性，实现抑制H2S合成功能；NaHS在体内分解为硫氢根离子和钠离子，前者与体内氢离子可结合生成内源性H2S。本研究使用PAG作为H2S代谢抑制剂，NaHS作为H2S的供体。
本次大鼠胰腺纤维化造模参考王昱良等[6]、Matsumura等[12]、苏丽婷等[13]采用的造模方法并进行改进，通过腹腔内注射DDC溶液建立大鼠胰腺纤维化模型。该造模方法克服了以往开腹经胆胰管注射试剂动物死亡率高或实验周期短无法建立慢性纤维化模型等缺点。本研究显示，对照组胰腺组织未见明显的组织病理改变，而模型组胰腺组织炎细胞渗出，胶原纤维沉积明显，符合胰腺纤维化的病理特征，表明大鼠胰腺纤维化模型制备成功。
既往研究证实，ECM异常蓄积是胰腺纤维化形成的关键环节，胰腺内ECM的合成最主要来源于胰腺星状细胞，目前认为胰腺星状细胞的活化在胰腺纤维化进展中发挥关键作用[14]。同时氧化应激、炎症因子等因素可激活静止型的胰腺星状细胞转变为活化型，分泌大量的Ⅰ型胶原等ECM成分，其中，TGF-β1是引起胰腺星状细胞活化的关键细胞因子，其可以使胰腺星状细胞转化为活化型，使大量的Ⅰ型胶原生成，TGF-β1是目前公认的主要致纤维化因子，在胰腺纤维化中起重要作用[15]。Hong等[16]发现，H2S能够抑制Ⅰ型前胶原的合成，肝内H2S合成减少将使Ⅰ型胶原合成的抑制降低，Ⅰ型胶原的含量则大量增加。本研究发现，与模型组相比，NaHS组胰腺组织中Ⅰ型胶原含量明显减少，而PAG组则明显增多，提示内源性的H2S能够减少胶原的生成，抑制胰腺纤维化并可能参与了DDC诱导的大鼠胰腺纤维化的病理生理过程。伏桂香等[17]发现，应用外源性H2S可抑制TGF-β1的表达从而拮抗肠纤维化。本研究发现，NaHS组TGF-β1含量较模型组明显减少，PAG组则明显增多，与上述研究结果相符合。TGF-β1主要依赖于Smad蛋白的信号转导和调控而发挥生物学作用。刘理静等[18]在大鼠肺纤维化研究中发现，H2S可能通过抑制TGF-β1/Smads信号通路发挥抗纤维化作用。
Smads蛋白家族是TGF-β1下游的受体激酶的关键作用底物，充当TGF-β1的信号介导因子[19]。其中，Smad7是TGF-β信号通路中的主要抑制性调控蛋白，能够竞争性抑制R-Smads蛋白磷酸化,从而负性调控TGF-β1/Smad信号通路[20]。He等[2]在胰腺大量表达Smad7蛋白的转基因小鼠模型中发现，重复给予模型组和对照组雨蛙素，模型组小鼠胰腺组织内Ⅰ型胶原和纤连蛋白含量显著减少，而对照组小鼠胰腺组织中则明显增加。该研究表明Smad7的大量表达能够抑制胶原纤维的形成与沉积，进而抑制胰腺纤维化的形成。本研究显示，与模型组相比，NaHS组胰腺组织中Smad7蛋白表达明显增加；PAG组则明显降低，提示内源性H2S可以上调Smad7表达，进而抑制目的基因的转录从而发挥抗胰腺纤维化作用。
上述研究结果表明，在DDC诱导的大鼠胰腺纤维化模型中，内源性H2S能有效的抑制实验性大鼠胰腺纤维化。其机制可能通过TGF-β1/Smad信号通路上调Smad7蛋白的表达，下调TGF-β1的表达，从而减少胶原纤维的生成与沉积发挥抗纤维化作用。PAG溶液在将来能否进入临床用于抑制慢性胰腺炎纤维化还有待进一步的研究。
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Effect of endogenous hydrogen sulfide on pancreatic fibrosis induced by diethyldithiocarbamate in rats
【Abstract】Objective To investigate the effect of sodium hydrogen sulfide (NaHS) on pancreatic fibrosis induced by diethyldithiocarbamate (DDC). Methods Forty-eight Wistar rats were randomized into four groups (12 per group)： normal control group, model group, NaHS group and PAG group. Pancreatic fibrosis was induced by intraperitoneal injection with 10% DDC (700mg/kg); sodium hydrosulfide (56μmol/L) or DL-propargylglycine (45μmol/L) was intraperitoneally injected 1/d in rats of HaHS and PAG groups, respectively; an equal volume of saline was intraperitoneally injected in control and model groups. All animals were sacrificed on d30. The pancreas samples were harvested for the macroscopic and microscopic examinations. Collagen Ⅰ and TGF-β1 in pancreatic tissue were detected by ELISA method, Smad7 was determined by Western blotting, plasma H2S level was measured. Results Compared with the control group, the histological damage score, collagen area, the level of collagen Ⅰ and TGF-β1 were significant higher in model group, NaHS group and PAG group(P<0.05); those indicators in model group were significant higher than in NaHS group(P<0.05); those in PAG group were significant higher than in model group and NaHS groups(P<0.05). The expression of Smad7 was significant higher in control group than that in model group, NaHS group and PAG group(P<0.05); the expression of Smad7 in NaHS group was higher than that in model group and PAG group(P<0.05); the expression of Smad7 in model group was significant higher than that in PAG group(P<0.05).The level of serum H2S was significant higher in NaHS group than that in control group, model group and PAG group(P<0.05); the serum H2S level in control group was significant higher than that in model group(P<0.05); the serum H2S level in model group was significant higher than that in PAG group(P<0.05).Conclusion Hydrogen sulfide has a significant anti-fibrosis effect on pancreatic fibrosis induced by DDC in rats, which is possibly related to the up-regulation of the expression of Smad7 and down-regulation of the TGF-β1.
【Key words】pancreatic fibrosis; hydrogen sulfide; collagen Ⅰ; transforming growth factor-β1; Smad7; rat
doi：10.16118/j.1008-0392.2017.03.008
收稿日期：2016-12-19
【中图分类号】R 576
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2017)03-0040-06