±s表示。所有数据结果采用SPSS 12.0统计软件进行分析，统计分析采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。·基础研究·
【摘要】目的 探讨大气颗粒物PM2.5对人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblast， HSF)分泌IL-6和TGF-β1的影响及胶原多肽(collagen polypeptide， CP)的干预作用。方法 将HSF分为PM2.5组和CP干预组。PM2.5组用0、25、50、100、200μg/ml的PM2.5与HSF培养48h；CP干预组用100μg/ml PM2.5和0、15、30、60μg/ml CP与HSF共培养 48h。采用ELISA方法测定细胞上清液中IL-6、TGF-β1含量。结果 随着PM2.5浓度升高(0、25、50、100、200μg/ml)，PM2.5组细胞上清液中的IL-6含量也逐渐升高，TGF-β1含量则逐渐下降，两者都存在一定的剂量-效应关系，各炎性因子浓度差异有统计学意义(P<0.05)；在PM2.5浓度为100μg/ml时，随着CP浓度升高(0、15、30、60μg/ml),PM2.5+CP组IL-6浓度逐渐下降，TGF-β1含量逐渐增加，两者都存在一定的剂量-效应关系，各炎性因子浓度差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PM2.5能促进皮肤炎症，可能与上调IL-6、下调TGF-β1有关；而CP能通过抑制上述作用，缓解PM2.5对皮肤致炎作用。
【关键词】PM2.5； 人皮肤成纤维细胞； 胶原多肽； 白介素-6； 转化生长因子β1
PM2.5是指大气中直径≤2.5μm的颗粒物，是大气污染检测指标之一。目前，我国的PM2.5标准值为24h平均浓度<75μg/m3为达标，然而，这一数值仅仅是达到世界卫生组织设定的最低标准。2011年10月，研究[1]指出： 近3年来，北京、天津、河北，长三角和珠三角3大城市群每年出现灰霾的时间超过100d。2015年，北京市细颗粒物年平均浓度值为80.6μg/m3，超过国家标准1.30倍。PM2.5可影响人的呼吸、心血管、免疫、生育、神经和遗传系统，还能进入肺泡甚至血液，引起全身疾病。PM2.5的平均浓度每增加10μg/m3，人口总死亡率、心肺疾病死亡率和肺癌死亡率分别升高4%、6%和8%[2]。皮肤是人体面积最大的器官，人体免疫的第一道防线，可以帮助机体内的其他组织和器官阻挡来自外界有害物质的侵害，对人体起到非常重要的保护作用。PM2.5可能通过皮肤表面吸收和血液循环到达真皮层，而皮肤成纤维细胞是真皮层的主要的支持细胞。人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblast, HSF)在外源物质刺激下，可以释放IL-6和TGF-β1，从而调控炎症反应，严重时可使皮肤发生疾病。胶原多肽(collagen polypeptide, CP)有抗氧化、抗炎以及调节免疫系统功能，但目前有关CP能否抵御PM2.5对皮肤的损害研究较少。
1.1 材料
实验主要材料为健康青少年男性包皮环切术切除的包皮。DMEM/HIGH GLUCOSE培养液、胎牛血清、青链霉素双抗、0.25% Trypsin-EDTA购自美国Gibco公司；IL-6、TGF-β1试剂盒购自美国R&D公司。
1.2 PM2.5 染毒液的制备
本研究所使用的PM2.5在上海市中心城区收集，并制成储备液-20℃冷藏。将PM2.5贮备液(5mg/ml)，高压灭菌，-20℃保存。每次使用前4℃融化1管，使用漩涡振荡器20s后，低温水浴超声20～30min，稀释浓度为25、50、100、200μg/ml。
1.3 CP制备
本研究所使用的CP由上海市水产研究所提供。使用前取适量CP，溶解于PBS缓冲液中，分别制成浓度为15、30、60μg/ml的溶液，溶液经0.22μm微孔滤膜滤过除菌备用。
1.4 原代HSF制备
阴茎包皮环切1块，面积为2.5cm×2cm,将包皮组织用含有抗菌素的PBS液漂洗，去除多余组织及血管，将组织剪成0.5cm×1cm的大小，放入离心管中，加入2mg/ml的Ⅱ型胶原酶消化液，4℃过夜，去表皮，分离真皮，加0.25%胰蛋白酶反复吹打消化，用含有血清的DMEM培养基清洗，离心半径9.6cm，1200r/min,离心8min,弃上清液，按1×105/ml细胞浓度培养于10%的胎牛血清和青链霉素双抗的DMEM培养液中，在浓度5%、湿度95%、恒温37℃的CO2培养箱中培养。每隔3d换液1次，细胞融合80%时用0.125%胰蛋白酶消化、传代后，用于实验。本次实验为3～4代HSF。
1.5 细胞形态学观察及鉴定
待细胞铺满盖玻片的40%～60%时,取出盖玻片,用0.01mmol/L的PBS洗3次,每次5min,用冰冻丙酮∶甲醇(1∶1)室温固定 30min。一部分进行常规H-E染色后光镜观察;另一部分用体积分数为3%的过氧化氢室温孵育5min,以消除内源性过氧化物酶的活性;用0.01mmol/L的PBS漂洗,滴加即用型鼠抗人波形蛋白一抗,置 4℃ 冰箱过夜;0.01mmol/L PBS漂洗后加入羊抗鼠二抗,室温 30min;0.01mmol/L PBS漂洗后,DAB显色1min,苏木精复染。
1.6 细胞培养
取HSF，分为PM2.5组和CP干预组。PM2.5组： 用0、25、50、100、200μg/ml的PM2.5与HSF培养48h；CP干预组： 用 100μg/ml PM2.5和0、15、30、60μg/ml CP与HSF共培养 48h，离心后取上清液冻存。
1.7 ELISA法检测IL-6、TGF-β1的表达
收集细胞上清液标本。(1) 铺板： 每孔加入第一抗工作液100μl，常温过夜；(2) 洗板： 用洗涤液将反应板充分洗涤4～5次向滤纸上印干；(3) 加入封闭液室温1～2h;(4) 洗板(同上)；(5) 加入标准品(倍数稀释至第七孔)和样品100μl,每个设3个复孔，室温2h；(6) 洗板(同上)；(7) 加入第二抗体工作液100μl，室温2h;(8) 洗板(同上)；(9) 加入酶标抗体工作液100μl，避光室温20min；(10) 洗板(同上)；(11) 加入100μl底物工作液，避光室温 20min；(12) 洗 板(同上)；(13) 加入50μl终止液，避光室温10min;(14) 酶标仪在波长450nm处测吸光值(D450)。
1.8 统计学处理
所有数据资料均以±s表示。所有数据结果采用SPSS 12.0统计软件进行分析，统计分析采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 PM2.5 对HSF分泌IL-6的影响
随着PM2.5的浓度增加，细胞上清液中IL-6含量逐渐升高，各浓度间差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性，见图1。
图1 PM2.5作用于HSF 48h后对
IL-6分泌的影响
Fig.1 The effect of PM2.5 on the secretion of IL-6 by human skin fibroblasts
2.2 PM2.5对HSF分泌TGF-β1的影响
随着PM2.5的浓度增加，细胞上清液中TGF-β1含量逐渐升高，各浓度间差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性，见图2。
图2 PM2.5作用于HSF 48h后对TGF-β1分泌的影响
Fig.2 The effect of PM2.5 on the secretion of TGF-β1 by human skin fibroblasts
2.3 CP干预PM2.5对HSF分泌IL-6的影响
在PM2.5的浓度为100μg/ml时，随着CP浓度升高，细胞上清液中的IL-6含量逐渐下降，各浓度间差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性，见图3。
图3 PM2.5和CP共作用于HSF 48h后对IL-6分泌的影响
Fig.3 The effect of PM2.5 and CP on the secretion of IL-6 by human skin fibroblasts
2.4 CP干预PM2.5对HSF分泌TGF-β1的影响
在PM2.5的浓度为100μg/ml时，随着CP浓度升高，细胞上清液的TGF-β1含量逐渐上升，各浓度间差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性，见图4。
图4 PM2.5和CP共作用于HSF 48h后对TGF-β1分泌的影响
Fig.4 The effect of PM2.5 and CP on the secretion of TGF-β1 by human skin fibroblasts
近几年，随着我国经济快速发展，各个城市大气污染的情况日益加重，大气污染由传统、单一的烟煤型污染转为多种污染物共存的复合型污染[3]。大气污染中细颗粒物主要来自日常发电、工业生产、汽车尾气排放等过程中经过燃烧而排放的残留物，大多含有重金属等有毒物质，其中含有的化学成分主要包括有机碳(OC)、元素碳(EC)、硝酸盐、硫酸盐、铵盐、钠盐(Na+)等。我国大气污染尤其是细颗粒物PM2.5引起的雾霾天气逐年增多，引起我国政府和公众的广泛担忧。大气细颗粒物尤其是PM2.5因其粒径较小，且容易附着大量有害物质如有机物、重金属、细菌、病毒等，悬浮于空气中不易散去，对人体健康的影响非常大。研究表明，颗粒物直径< 2.5μm 可沉积到肺泡区域,有一部分被巨噬细胞吞噬进入淋巴系统,由淋巴液入淋巴结,后被清除或入血达全身各处，50nm以下的粒子还可穿透肺泡与血管的屏障,进入血液循环而到达其他组织，从而引起各个系统疾病[4]。关于环境污染物尤其是空气污染的最新流行病学调查发现，大气污染在皮炎、湿疹、痤疮和银屑病的发生中具有重要作用[5-8]。
本研究发现，随着PM2.5的浓度增加，细胞上清液IL-6含量逐渐升高，TGF-β1含量逐渐下降。IL-6是一种具有生物功能多样性的促炎因子，当细胞受到刺激发生炎症反应时，IL-6的含量就会升高，对机体的免疫反应进行调控，对急性反应期蛋白发生影响。IL-6参与多种炎症性皮肤病如痤疮、皮炎、毛囊炎、银屑病等。研究发现，燃油的发电厂采集的居民区油烟飞灰可导致细胞IL-6分泌增加，提示颗粒物与炎性介质的释放有关[9]。颗粒物能够通过增强促炎性细胞因子分泌，参与炎症性皮肤病的发病。德国的一项研究也发现，居住在车流量较大的区域儿童皮炎发病率明显高于车流量较少的区域[10]。临床中见到的部分青春期后痤疮可能与环境污染相关，其中特征性的代表为氯痤疮，它与职业中接触并系统吸收二噁英或其他氯化烃类等密切相关[11]。研究[12-13]已证明，痤疮患者皮损中IL-6水平较正常皮肤明显升高。近年来，国内外研究发现，大气污染与银屑病的发病率逐年增高有密切关系。TGF-β家族对细胞增殖、分化及细胞凋亡均有影响，在炎症的修复、内环境稳态的维持等方面起重要作用[14]。TGF-β1的降低会导致皮肤真皮层抗损伤能力下降。银屑病患者真皮微血管内皮细胞上TGF-β与受体结合能力降低，对内皮细胞黏附外周血单个核细胞有抑制功能，导致真皮炎症细胞浸润明显，说明TGF-β家族与银屑病的发病有一定关系[15-16]。高春芳等[17]采用免疫组化多聚复合物二步法对银屑病患者及正常人TGF-β受体Ⅰ(TGF-βR Ⅰ)和Ⅱ(TGF-βR Ⅱ)原位表达进行比较研究，结果提示银屑病患者皮损表皮处TGF-βR Ⅰ和TGF-βR Ⅱ表达减少或缺失；非皮损处和正常人表皮组织TGF-βR Ⅰ和TGF-βR Ⅱ呈阳性表达，主要在基底层和棘层下部，说明TGF-βR Ⅰ型和TGF-βR Ⅱ功能下调可能与银屑病患者的表皮过度增殖有关。PM2.5可通过改变HSF中细胞因子含量影响皮肤真皮层的稳态，从而导致皮肤疾病的产生。大气污染与呼吸道炎症、干眼症等发病率增高有关，其致病机制是否与IL-6和TGF-β1分泌有关有待进一步研究。
CP能抑制PM2.5对IL-6的上调,促进TGF-β1表达，缓解污染空气对皮肤致炎作用。CP是从鱼皮胶原蛋白中提取，据报道有抑炎作用。宋芹等[18]发现,罗非鱼鱼皮胶原蛋白寡肽具有良好的透皮吸收性能,能透过皮肤的角质层、表皮层到达真皮层。从水产动物胶原蛋白提取的免疫活性肽为一类具有抗菌、抗炎以及调节免疫系统功能的生物活性肽。目前,人们利用生物酶解技术，将鱼皮胶原蛋白水解为相对分子质量小、透皮吸收性能较好的胶原蛋白寡肽作为化妆品和功能性食品的原料。这种天然活性肽通过改善人皮肤细胞的生长和代谢，促进细胞活力的提高和细胞外基质的分泌等作用，从而发挥抗炎的功效[19]。因此，将其作为功能性化妆品和食品的主要成分来保护皮肤、抵御雾霾损害具有重要前景。
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Effect of PM2.5 on secretion of IL- 6 and TGF-β1 by human skin fibroblasts
【Abstract】Objective To investigate the effect of PM2.5 on secretion of interleukin 6 (IL-6) and transforming growth factor β1 (TGF-β1) by human skin fibroblasts (HSF), and the protective effect of collagen polypeptide (CP) from insults of PM2.5. Methods Human skin fibroblasts were co-cultured with PM2.5 0, 25, 50, 100, 200μg/ml (PM2.5 groups) or PM2.5100μg/ml plus 0, 15, 30, 60μg/ml CP (PM2.5+CP groups) for 48h. The secretion of IL-6 and TGF-β1 were measured by ELISA method. Results With increasing concentration of PM2.5, the secretion of IL-6 increased and the secretion of TGF-β1 decreased gradually in a dose-effect manner (P<0.05). Compared to PM2.5 group, with increasing concentration of CP the secretion of IL-6 decreased and TGF-β1 increased gradually in PM2.5+CP groups in a dose-effect manner (P<0.05). Conclusion PM2.5 can induce skin inflammation, which is associated with up-regulation of IL-6 and down-regulation of TGF-β1, and CP can inhibit the effect of PM2.5 and alleviate the skin inflammation.
【Key words】PM2.5 ； human skin fibroblast； collagen polypeptide； interleukin 6； transforming growth factor-β1
doi：10.16118/j.1008-0392.2017.03.007
收稿日期：2017-01-03
基金项目：上海市自然科学基金(162R1419200)
【中图分类号】R 751
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2017)03-0035-05