±s表示，使用SPSS 16.0软件进行统计分析，各组间用配对t检验进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。·基础研究·
【摘要】目的 研究真核翻译起始因子5A2(eukaryotic translation initiation factor 5A2, EIF5A2)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)细胞株H1299中的作用和潜在分子机制。方法 采用EIF5A2干扰RNA，敲除NSCLC细胞株H1299中的EIF5A2后，评估细胞的增殖能力、细胞凋亡率、细胞迁移和侵袭能力；采用Western印迹法检测NSCLC细胞株H1299敲除EIF5A2后，肿瘤相关蛋白和E-cadherin的表达情况。结果 EIF5A2的表达在NSCLS细胞株H1299中上调。而在体外实验中，EIF5A2的沉默可以抑制肿瘤细胞生长并诱导凋亡，降低细胞的迁移和侵袭能力，上调c-Myc、Bcl-2、Rac1表达，下调E-cadherin的表达。结论 EIF5A2可以促进NSCLC细胞株H1299的增殖和转移，可能成为NSCLS药物作用新靶点。
【关键词】非小细胞肺癌； 细胞株H1299； 真核翻译起始因子5A2； RNA干扰； 上皮间叶转化； 基因敲除
肺癌是全球肿瘤相关死亡的主要原因之一，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌病理分型的85%[1]。NSCLC的5年生存率仅有15%，传统的治疗方式如手术、化疗、放疗等疗效欠佳[2]。为了改善NSCLC的疗效，深入了解肿瘤复发和转移的分子机制，发现潜在的新的治疗靶点是十分重要的。真核翻译起始因子5A2(eukaryotic translation initiation factor 5A2, EIF5A2)是一种参与多种细胞内过程的蛋白，在转录、翻译、核质互换等细胞过程中发挥重要作用[3]。EIF5A2作为可能的肿瘤转移相关基因，在多种人类肿瘤中表达异常升高，并可能参与上皮-间叶转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，从而促进肿瘤细胞迁移及侵袭。本研究采用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)转染NSCLC细胞株H1299，评估敲除EIF5A2对NSCLC细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响及其可能的分子机制。
1.1 材料和试剂
人类支气管上皮细胞株(human bronchial epithelial cell line, HBE)和NSCLC细胞株(H1299)购自中国科学院上海细胞库；RPMI-1640及胎牛血清购自美国Gibco公司；青霉素/链霉素、蛋白酶抑制剂、苯甲基磺酰氟购自美国Sigma公司；EIF5A2 siRNA购自上海吉玛基因公司；引物、超纯RNA提取试剂盒、M-MLV反转录合成试剂盒、脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；细胞计数试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8)购自日本同仁化学研究所；人工基底膜基质、膜联蛋白V(Annexin V)-FITC、碘化丙啶(propidium iodide，PI)、基质胶购自美国Bioscience公司；微孔膜购自美国康宁公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒购自美国Thermo公司；山羊抗兔抗体购自美国PerkinElmer公司；PVDF膜购自德国Millipore公司；兔抗人EIF5A2单克隆抗体购自美国Proteintech公司；兔抗人β-actin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；Vimentin、E-cadherin、Rac1、Bcl-2和c-Myc兔抗人单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；MRX II酶标仪购自美国Dynex Technologies公司。
1.2 细胞培养
用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液(含100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素)培养细胞，置于37℃、5%CO2、95%湿度的孵箱内培养。
1.3 Western印迹法检测
收集细胞，采用300μl细胞裂解缓冲液(含1×蛋白酶抑制剂、1mmol/L苯甲基磺酰氟)提取蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度。每孔 40μg 蛋白质上样，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至PVDF过滤膜，使用TBS和包含5%的牛血清白蛋白的0.1% 吐温20(TBS/T)封闭。洗膜后加一抗(兔抗人EIF5A2单抗1∶500稀释，兔抗人β-actin单抗1∶5000 稀释，E-cadherin、Rac1、Bcl-2及c-Myc各兔抗人单克隆抗体均1∶1000稀释)，4℃冰箱摇床过夜；次日洗膜，二抗(HRP标记的山羊抗兔二抗，1∶4000稀释)室温孵育1h，洗膜，行辣根过氧化物酶化学发光增强剂显色反应，显像，β-actin作为内参照，凝胶图像分析仪分析结果。
1.4 EIF5A2 siRNA转染细胞
实验分组： siRNA1组(5μmol/ml EIF5A2 siRNA)、siRNA2组(10μmol/ml EIF5A2 siRNA)、siRNA3组(15μmol/ml EIF5A2 siRNA)、阴性对照组(negative control siRNA)。转染前24h细胞分别铺板，按5×103/孔细胞数将细胞分别接种于96孔板。转染时，将EIF5A2 siRNA与脂质体LipofectamineTM2000混合，使EIF5A2 siRNA的终浓度为20nmol/L，转染 6h 后更换细胞培养液。48h 后提取蛋白进行Western印迹法检测。每隔24h换液1次，按对应时间点检测细胞增殖、细胞周期、凋亡或细胞迁移及侵袭。每组实验均重复3次。
1.5 细胞增殖实验
采用CCK-8法检测细胞增殖，分EIF5A2 siRNA转染组(siEIF5A2组)和对照组(NC组)。细胞转染24、48、72h后，每孔加入 10μl 的CCK-8溶液，然后继续在37℃下孵化3h。使用MRX II 酶标仪于450nm波长测定吸光度(D450)，评定细胞增殖情况。
1.6 细胞迁移和侵袭检测
细胞迁移能力检测： 采用Transwell法检测，分组同1.5。转染24h后，调节细胞浓度为2×105/ml，经无胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬后，将 100μl 细胞悬液加入Transwell板(下室内加入含 50ng/ml VEGF的RPMI-1640培养基)。细胞侵袭能力检测： Transwell板上室插入8μm微孔膜基底膜，基质胶包被，下室加入含有10%FBS的RPMI-1640培养基，转染 24h 后，将 100μl 密度为 2× 105/ml细胞溶液加入上室。在迁移能力和侵袭能力检测过程中，细胞均在37℃下孵化24h后，PBS清洗下室，4%的多聚甲醛固定，H-E染色，在倒置光学显微镜下观察，每孔随机观察3个高倍镜视野。
1.7 流式细胞分析
收集细胞于流式管中，用100μl结合缓冲液悬浮细胞，加入 5μl Annexin V-FITC(20μg/ml)和10μl PI(25μg/ml)，避光室温作用10min，补充结合液至300μl，上流式细胞仪分析，分别以FITC为横坐标、PI为纵坐标做荧光双参数点图，将正常、坏死、凋亡细胞区分开，共分为4个区。1区： 机械损伤细胞(FITC-/PI+)；2区： 凋亡晚期或坏死细胞(FITC+/PI+)；3区： 活细胞(FITC-/PI-)；4区： 早期凋亡细胞(FITC+/PI-)。对各区域细胞比例进行比较。
1.8 统计学处理
数据采用 ±s表示，使用SPSS 16.0软件进行统计分析，各组间用配对t检验进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 H1299细胞转染EIF5A2 siRNA
使用不同浓度EIF5A2 siRNA转染H1299细胞株，以敲除EIF5A2。Western印迹法结果显示： 与对照组相比，转染了EIF5A2 siRNA的细胞中EIF5A2的表达水平被显著抑制，且随着EIF5A2 siRNA浓度的增高，EIF5A2的表达进一步降低，从而确定了EIF5A2 siRNA的有效性，见图1A。通过对比3种浓度的EIF5A2 siRNA对EIF5A2表达水平的抑制效果，选择 10μmol/ml 作为EIF5A2 siRNA的浓度进行进一步研究。
2.2 转染EIF5A2 siRNA后细胞增殖及凋亡情况
H1299细胞株转染EIF5A2 siRNA 0 、24、48和72h后，D450分别为0.23±0.04、0.42±0.06、0.67±0.05和1.04±0.15，而转染negative control siRNA的H1299细胞株D450则分别为0.23±0.03、0.47±0.06、0.87±0.08和1.47±0.15。
在EIF5A2 siRNA转染72h后，流式细胞术检测结果显示，H1299细胞株的细胞凋亡率为(21.22±3.05)%，而对照组是(7.71±1.34)%，因此当细胞中的EIF5A2表达被显著抑制后，细胞凋亡率明显增高(P<0.05)，见图1B。
图1 两组细胞EIF5A2表达及增殖、凋亡情况对比
Fig.1 Comparison of the EIF5A2 expression level, cell proliferation and apoptosis rate between siEIF5A2 and NC groups
2.3 转染EIF5A2 siRNA后细胞迁移和侵袭能力
siEIF5A2组迁移能力和侵袭能力均低于NC组[(40.43±4.98)% vs (97.00±4.37)%，P<0.01；(32.19±4.75)% vs(98.12±5.06)%，P<0.01]，见图2。因此，EIF5A2表达下降明显抑制了细胞的迁移能力和侵袭能力。
图2 EIF5A2 siRNA转染组与对照组细胞迁移和
侵袭能力对比
Fig.2 Comparison of migration and invasion ability between siEIF5A2 and NC groups
2.4 转染EIF5A2 siRNA后检测各肿瘤相关蛋白
Western印迹法结果显示，与对照组相比，在转染EIF5A2 siRNA后的H1299细胞中，Rac1、Bcl-2、c-Myc和Vimentin的表达水平降低，而E-cadherin的表达水平升高，见图3。
图3 EIF5A2 siRNA转染组与对照组各肿瘤
相关蛋白表达水平对比
Fig.3 Comparison of the tumor-related proteins expression levels between siEIF5A2 and NC groups
EIF5A2蛋白可能作为癌蛋白在多种人类肿瘤内高表达，包括结肠直肠癌、胰腺癌、胃腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、食管鳞状细胞癌和膀胱癌等[4-12]。研究发现，高表达EIF5A2的食管鳞状细胞癌[11]、膀胱癌[12]、胰腺癌[13]的患者生存期显著缩短，高表达EIF5A2的肝细胞癌患者更易发生血管侵袭和转移[14-15]。据报道，EIF5A2的下调能反转NSCLC的EMT的发生[16]；EIF5A2表达水平增高，提示I期NSCLC患者预后不良[17]；此外，抑制EIF5A2表达可以增强NSCLC对化疗的敏感性，阻止或反转EMT，并降低NSCLC的迁移和侵袭能力[18]。
本研究发现，当EIF5A2被siRNA敲除后，NSCLC细胞株H1299的增殖能力下降，细胞凋亡率升高，迁移和侵袭能力下降，肿瘤相关蛋白Rac1、Bcl-2和c-Myc的表达下调。Rac1可通过基因、信号通路及细胞内环境等因素诱导细胞增殖及迁移[19]；Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，其阳性表达率随着肺癌细胞的分化程度降低而降低，且高分化组与低分化组相比，差异有显著性[20]；c-Myc基因是参与细胞凋亡、促进细胞分裂的基因，使细胞无限增殖。另外，EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。E-cadherin的减少或丢失是EMT最重要的标志性变化，EMT的另一个标志物为Vimentin。本实验证实，当EIF5A2被siRNA敲除后，E-cadherin表达降低，而Vimentin表达增加，说明EIF5A2表达下降能够反转EMT的发生，并使得肿瘤相关蛋白基因表达下降。
由此可见，任何一种药物，如果能够有效地抑制EIF5A2的表达，都可能成为新的治疗NSCLC的药物。但是鉴于siRNA在基因递送方面的局限性，虽然体外实验能够证实siRNA可以有效敲除EIF5A2，但是还不足以成为用于体内有效地沉默EIF5A2表达的手段。因此，可进一步研究，如何将EIF5A2 siRNA有效递送入体内的NSCLC细胞中，从而抑制肿瘤的发展。除siRNA以外，新近一项研究[21]还发现，能够通过micro-RNA 30b和micro-RNA 125b靶向EIF5A2来抑制胃腺癌和肝癌细胞。因此，任何能够增加micro-RNA 30b和micro-RNA 125b转录的化合物，也都有可能用于NSCLC治疗。另外，研究[22]还发现，N1-guanyl-1,7-diaminoheptane (GC7)是EIF5A2的直接抑制剂，也有成为NSCLC治疗药物的潜力。
由于本实验只研究了在NSCLC细胞株H1299中EIF5A2的表达情况及其调控效应，H1299并不能代表广义的NSCLC，因此后续实验还需要在多种NSCLC细胞株及动物和人组织样本中进一步验证EIF5A2的表达情况及其对NSCLC细胞的影响。
综上所述，在NSCLS细胞株H1299中，EIF5A2作为一种致癌基因，可以增加细胞增殖，抑制细胞凋亡，促进肿瘤转移,提示EIF5A2可作为NSCLS治疗的一个潜在靶点。
【参考文献】
[1] D′ADDARIO G, FRUH M, RECK M, et al. Metastatic non-small-cell lung cancer： ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up[J]. Ann Oncol， 2010,21(Suppl 5)： 116-119.
[2] ROSELL R, FELIP E, TARON M, et al. Gene expression as a predictive marker of outcome in stage ⅡB-ⅢA-ⅢB non-small cell lung cancer after induction gemcitabine-based chemotherapy followed by resectional surgery[J]. Clin Cancer Res, 2004,10(12)： 4215s-4219s.
[3] MATHEWS M B, HERSHEY J W. The translation factor eIF5A and human cancer[J]. Biochim Biophys Acta, 2015,1849(7)： 836-844.
[4] CLEMENT P M, HENDERSON C A, JENKINS Z A, et al. Identification and characterization of eukaryotic initiation factor 5A-2[J]. Eur J Biochem, 2003,270(21)： 4254-4263.
[5] ZHU W, CAI M Y, TONG Z T, et al. Overexpression of EIF5A2 promotes colorectal carcinoma cell aggressiveness by upregulating MTA1 through C-myc to induce epithelial-mesenchymaltransition[J]. Gut, 2012,61(4)： 562-575.
[6] XU X, LIU H, ZHANG H, et al.Sonic hedgehog-GLI family zinc finger 1 signaling pathway promotes the growth and migration of pancreatic cancer cells by regulating the transcription of eukaryotic translation initiation factor 5A2[J]. Pancreas, 2015,44(8)： 1252-1258.
[7] MENG Q B, KANG W M, YU J C, et al. Overexpression of eukaryotic translation initiation factor 5A2 (EIF5A2) correlates with cell aggressiveness and poor survival in gastric cancer[J]. PLoS One, 2015,10(3)： e0119229.
[8] LI S, MA Y, XIE C, et al. EphA6 promotes angiogenesis and prostate cancer metastasis and is associated with human prostate cancer progression[J]. Oncotarget, 2015,6(26)： 22587-22597.
[9] KHOSRAVI S, WONG R P, ARDEKANI G S, et al. Role of EIF5A2, a downstream target of Akt, in promoting melanoma cell invasion[J]. Br J Cancer, 2014,110(2)： 399-408.
[10] THIERY J P.Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression[J]. Nat Rev Cancer, 2002,2(6)： 442-454.
[11] LI Y, FU L, LI J B, et al.Increased expression of EIF5A2, via hypoxia or gene amplification, contributes to metastasis and angiogenesis of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Gastroenterology, 2014,146(7)： 1701-1713.
[12] WEI J H, CAO J Z, ZHANG D, et al.EIF5A2 predicts outcome in localised invasive bladder cancer and promotes bladder cancer cell aggressiveness in vitro and in vivo[J]. Br J Cancer, 2014,110(7)： 1767-1777.
[13] 韦颍昕,陈革,由磊,等.真核翻译起始因子5A2在胰腺癌中的表达及与预后的相关性[J].中国医学科学院学报,2013,35(6)： 634-638.
[14] TANG D J, DONG S S, MA N F, et al.Overexpression of eukaryotic initiation factor 5A2 enhances cell motility and promotes tumor metastasis in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2010,51(4)： 1255-1263.
[15] SHEK F H, FATIMA S, LEE N P. Implications of the Use of eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) for prognosis and treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Int J Hepatol, 2012,2012： 760928.
[16] XU G D, SHI X B, SUN L B, et al. Down-regulation of eIF5A-2 prevents epithelial-mesenchymal transition in non-small-cell lung cancer cells[J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2013,14(6)： 460-467.
[17] HE L R, ZHAO H Y, LI B K, et al. Overexpression of eIF5A-2 is an adverse prognostic marker of survival in stage I non-small cell lung cancer patients[J]. Int J Cancer, 2011,129(1)： 143-150.
[18] XU G, YU H, SHI X, et al. Cisplatin sensitivity is enhanced in non-small cell lung cancer cells by regulating epithelial-mesenchymal transition through inhibition of eukaryotic translation initiation factor 5A2[J]. BMC Pulmonary Med, 2014,14： 174.
[19] SHINTANI Y, WHEELOCK M J, JOHNSON K R. Phosphoinositide-3 kinase-Rac1-c-jun NH2-ternimal kinase signaling mediates collagen I-induced cell scattering and up-regulation of N-cadherin expression in mouse mammary epithelial cells[J]. Mol Biol Cell, 2006,17(7)： 2963-2975.
[20] 姜文霞,方建萍,樊剑芳,等.bcl-2、bax和p53在非小细胞肺癌中的表达[J].同济大学学报(医学版),2004,25(5)： 385-387.
[21] TIAN S B, YU J C, LIU Y Q, et al.MiR-30b suppresses tumor migration and invasion by targeting EIF5A2 in gastric cancer[J].World J Gastroenterol, 2015,21(31)： 9337-9347.
[22] LIU Y, LIU R, FU P, et al.N1-guanyl-1,7-diaminoheptane sensitizes estrogen receptor negative breast cancer cells to doxorubicin by preventing epithelial-mesenchymal transition through inhibition of eukaryotic translation initiation factor 5A2 activation[J].Cell Physiol Biochem, 2015,36(6)： 2494-2503.
Expression of eukaryotic translation initiation factor 5A2 in non-small cell lung cancer cell line H1299 and its role
【Abstract】Objective To investigate the role of eukaryotic translation initiation factor 5A2 (EIF5A2) in non-small cell lung cancer (NSCLC) H1299 cell line. Methods EIF5A2 iRNA was transfected into NSCLC H1299 cells. After silencing of EIF5A2, proliferation, apoptosis, migration and invasion ability of H1299 cells were determined, the expression of tumor-related proteins and E-cadherin was detected with Western blotting. Results EIF5A2 expression was up-regulated in NSCLC H1299 cells. After silencing of EIF5A2, cell growth was reduced, cell apoptosis was increased, the migration and invasion ability was inhibited in H1299 cells; meanwhile the expression of c-Myc, Bcl-2, Rac1 was down-regulated and E-cadherin was up-regulation. Conclusion EIF5A2 may be associated with the malignancy of NSCLC H1299 cells, suggesting that it might be a potential therapeutic target for NSCLC.
【Key words】non-small cell lung cancer； H1299 line； eukaryotic translation initiation factor 5A2； small interfering RNA； epithelial-mesenchymal transition； gene knockdown
doi：10.16118/j.1008-0392.2017.03.006
收稿日期：2017-01-19
【中图分类号】R 734.2
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2017)03-0030-05