·基础研究·
【摘要】目的 探讨Roux-en-Y胃旁路术(Roux-en-Y gastric bypass surgery, RYGB)对肥胖大鼠脂肪肝的影响及可能的机制。方法 将30只8周龄雄性Wistar大鼠随机分为正常饮食组(ND组)、高脂饮食组(HFD组)及高脂饮食且接受RYGB组(HFD+RYGB组)，每组10只，分别给予正常饮食、高脂饮食。饲养16周后，对HFD+RYGB组大鼠行RYGB，对ND组及HFD组行假手术。术后，ND组大鼠继续给予正常饮食,HFD组与HFD+RYGB组大鼠接受高脂饮食。术后第4周，处死大鼠，收集血样，采用ELISA法测定大鼠血清TG、TC、游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)浓度。观察大鼠肝脏外形，取肝脏组织，行H-E染色及油红O染色，显微镜下观察肝脏组织的病理学变化。采用real-time PCR检测肝组织糖类应答元件结合蛋白(ChREBP)、固醇调节原件结合蛋白-1c(SREBP-1c)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)mRNA表达水平。结果 HFD组大鼠体质量、肝脏湿重及内脏脂肪总量高于ND组(P<0.05)，HFD+RYGB组大鼠体质量、肝脏湿重及内脏脂肪总量低于HFD组(P<0.05)；HFD大鼠血清TG、TC、FFA水平高于ND组(P<0.05)，HFD+RYGB组大鼠血清TG、TC、FFA水平低于HFD组(P<0.05)；HFD组肝脏TG、TC含量高于ND组(P<0.05)，HFD+RYGB组大鼠肝脏TG、TC低于HDF组(P<0.05)；H-E及油红O染色结果显示，HFD+RYGB组干细胞脂质沉积、脂滴空泡减少；术后第4周，HFD+RYGB组大鼠肝脏中的ChREBP和SREBP-1c的mRNA的表达量较HFD组均显著降低(P<0.05)。结论 RYGB能显著缓解肝脏脂肪沉积及血脂，其机制可能与抑制脂肪酸合成途径的关键分子ChREBP和SREBP-1c有关。
【关键词】Roux-en-Y胃旁路术； 非酒精性脂肪肝； 糖类应答元件结合蛋白； 固醇调节原件结合蛋白-1c; 大鼠
随着生活水平的提高和饮食结构的改变，非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD)的患病率逐渐上升，且与2型糖尿病、代谢综合征、脂代谢紊乱、高血压及冠心病等发生密切相关，目前已经成为重要的公共卫生问题[1]。流行病学调查[2]表明，NAFLD全球平均患病率为20%。NAFLD是以TG在肝脏异位沉积为特征的临床病理综合征，是慢性肝病的最主要原因。研究[1]表明，NAFLD与胰岛素抵抗、糖尿病及代谢综合征各组分密切相关，减少肝脏脂肪沉积是一种有效的防治2型搪尿病的策略。Roux-en-Y胃旁路术(Roux-en-Y gastric bypass, RYGB)是目前临床上应用最广、最为成熟的减重手术。该术式对T2DM的治疗效果确切[3]，但RYGB对NAFLD肝内脂肪沉积的影响如何，目前尚不明确。本研究旨在观察RYGB对NAFLD的影响，并进一步阐述其机制，探讨治疗NAFLD的方法。
1.1 实验动物及材料
8周龄雄性Wistar大鼠30只,体质量180～ 200g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；real-time PCR所需试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;ELISA试剂盒购自美国Santa Cruz公司。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 所有大鼠按其代谢规律单笼饲养,大鼠不限制摄食水1周后，随机分为正常饮食组(ND组)、高脂饮食组(HFD组)及高脂饮食且接受RYGB组(HFD+RYGB组)。高脂饮食参考文献[4]。
1.2.2 手术方法 大鼠饲养16周后，参考文献[5-6]，对HFD+RYGB组大鼠行RYGB。对ND组及HFD组在与手术组相同部位切断肠道，再原位端端吻合。术后ND组大鼠接受正常饮食,HFD组与HFD+RYGB组大鼠接受高脂饮食。
1.2.3 观察指标及方法 术后第4周处死大鼠，称取体质量、肝脏湿重及内脏脂肪总量。本研究进一步定量检测了肝脏的含量，收集血样测定TG、TC、游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)，采用ELISA法测定血清浓度。观察大鼠肝脏外形，取肝脏组织，固定、切片行H-E染色及油红O染色，显微镜下观察肝脏组织的病理学变化。取肝脏组织，生理盐水冲洗后放入冻存管，液氮中保存。为了评估肝脏脂肪酸从头合成在RYGB后肝脏脂肪沉积缓解中的作用，采用real-time PCR检测3组大鼠肝脏中与脂肪酸从头合成有关的转录调控因子和关键酶的表达情况。用TRIzol提取肝脏组织总RNA，检测糖类应答元件结合蛋白(ChREBP)、固醇调节原件结合蛋白-1c(SREBP-1c)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC) mRNA表达水平。
1.3 统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 各组大鼠体质量、肝脏湿重及内脏脂肪总量比较
给予高脂饮食饲养后，HFD组大鼠体质量、肝脏湿重及内脏脂肪总量高于ND组(P<0.05)；与HFD组比较，HFD+RYGB组大鼠体质量、肝脏湿重及内脏脂肪总量明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，肝脏及内脏脂肪总量下降尤为显著，见表1。
表1 各组大鼠体质量、肝脏湿重及内脏脂肪总量比较
组别体质量肝脏湿重内脏脂肪总量ND组542.1±63.817.7±2.840.9±5.7HFD组620.3±112.0*29.2±4.6*64.0±9.4*HFD+RYGB组554.2±96.0#23.1±3.7#49.7±6.7#
与ND组比较，*P<0.05；与HFD组比较，#P<0.05
2.2 各组大鼠血清TG、TC、FFA比较
长期高脂饲料后HFD大鼠血清TG、TC、FFA水平高于ND组(P<0.05)；与HFD组比较，HFD+RYGB组大鼠血清TG、TC、FFA水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
表2 各组大鼠血清TG、TC、FFA比较
组别TGTCFFAND组0.64±0.061.58±0.120.51±0.13HFD组1.32±0.61*2.28±0.18*1.22±0.11*HFD+RYGB组0.87±0.10*1.60±0.17*0.89±0.09*#
与ND组比较，*P<0.05；与HFD组比较，#P<0.05
2.3 各组大鼠肝脏TG、TC含量比较
HFD肝脏TG、TC含量较ND组显著增加(P<0.05)；与HFD组比较，HFD+RYGB组大鼠肝脏TG、TC较HDF组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。此结果与肝脏病理结果相一致，见图1。
表3 各组大鼠肝脏TG、TC含量比较
组别TGTCND组16±3.01.8±0.2HFD组24±2.9*2.3±0.3*HFD+RYGB组18±2.1#2.0±0.3#
与ND组比较，*P<0.05；与HFD组比较，#P<0.05
图1 各组大鼠肝脏病理组织学改变
Fig.1 Pathological and histological changes of liver in each group
A、B、C为H-E染色；D、E、F为油红O染色
2.4 各组大鼠肝脏病理组织学改变
肉眼观察: ND组大鼠肝脏呈红褐色，表面光滑，体积较小，HFD组肝脏外观呈黄色，切面油腻感，体积较大，而HFD+RYGB组较HFD组外观转红，油腻感减轻。H-E及油红O染色结果表明，ND组肝细胞排列紧密成索状，肝小叶规则，细胞中央有大而圆的核，细胞质均匀，未见脂滴沉积。HFD组肝细胞肿胀、体积较正常明显增大，细胞内几乎均见大小不等的脂滴空泡，以小泡性脂滴肝细胞变性为主，严重者胞质疏松呈渔网状改变，小叶内及汇管区均未见炎症、纤维化；而HFD+RYGB组干细胞脂质沉积，脂滴空泡显著减少，见图1。
2.5 各组大鼠肝脏ChREBP、SREBP-1c和ACC的mRNA表达
手术后第4周，HFD+RYGB组大鼠肝脏中的ChREBP和SREBP-1c的mRNA的表达量较HFD组均显著降低(P<0.05)，两组中ACC的表达无显著变化(P>0.05)，见图2。
图2 各组大鼠术后组肝脏中的ChREBP和SREBP-1c的mRNA的表达情况
Fig.2 ChREBP and SREBP-1c mRNA expression in the liver of each group after operation
本研究通过高脂饲养构建了NAFLD实验大鼠模型，观察了RYGB对大鼠脂肪肝模型的影响。本研究表明： RYGB可以明显降低体质量、内脏脂肪含量和血脂水平，缓解TG和TC在肝脏中的沉积，改善肝脏的脂肪浸润和空泡变性。RYGB改善脂肪肝的机制可能与抑制脂肪酸从头合成途径的关键分子ChREBP和SREBP-1c有关。
本研究通过高脂饲养成功诱导了实验大鼠体内脂代谢紊乱及脂肪肝的发生。随着高脂饮食饲养时间的延长，高脂饲养组动物体质量、肝脏重量及内脏脂肪含量显著升高，同时血清TC、TG、FFA水平也显著增加。在生理状态下，机体多余的能量主要TG的形式储存在脂肪组织中，若能量摄入远远超过脂肪组织的负荷能力，多余的脂肪可转移到心脏、肌肉、肝脏等组织。TG等物质不能进行正常的分解代谢，在肝细胞内大量沉积，导致肝脏脂肪变性，最终影响肝脏功能，甚至导致肝纤维化的发生。本研究发现高脂饲养大鼠肝脏外观呈黄色，切面油腻感，肝内TG和TC含量显著高于对照组。病理结果与血清学等指标一致，显示存在显著的脂肪变性。血清学、病理学等结果均提示，本研究中的NAFLD模型制备成功。
RYGB可以显著改善高脂诱导的大鼠脂肪肝及脂质代谢紊乱状况。RYGB可减小胃容积，进行胃小囊一空肠吻合，旷置近端小肠，在减少食物摄入的同时，也缩小了小肠吸收面积，其并发症的发生率相对较低，这种胃肠道改建己成为世界各国减肥手术的标准术式。目前，大部分RYGB治疗肥胖症的研究多为合并2型糖尿病的肥胖个体[7]，而手术对于单纯营养性肥胖大鼠疗效及脂质代谢机制方面的报道相对较少。本研究发现，RYGB可以显著缓解高脂饲养大鼠脂肪组织中脂肪浸润，降低肝脏中TG和TC含量，同时血清中TG、TG、FFA水平也显著改善，机体的脂质代谢趋于正常。肝内脂肪沉积不仅与胰岛素抵抗密切相关，也是引起慢性肝脏疾病的重要原因。肝细胞内过度沉积的脂肪可通过复杂的机制引起肝脏的损伤，一方面肝脏内的脂肪酸可直接引起肝细胞的凋亡，另一方面肝脏内脂肪的氧化产物和过氧化产物会导致细胞膜的损伤和肝脏防御机制的下降，诱发炎症反应，并有可能导致肝纤维化、肝硬化甚至是肝癌等终末期疾病。RYGB可以控制高脂诱导的脂肪肝的发展。
目前，关于减重手术改善脂代谢的机制尚不完全清楚[8-9]。有研究[10]认为，在饮食诱导的肥胖模型中，减重手术导致体质量减轻和脂联素、瘦素的改善独立于生长素释放肽(ghrelin)水平。本研究发现，RYGB改善脂肪肝的机制可能与抑制脂肪酸从头合成途径的关键分子ChREBP和SREBP-1c有关[11]。ChREBP是肝脏中与脂肪酸从头合成有关的转录调控因子，是治疗代谢综合征的新靶点[12-13]。ChREBP在不同种属中具有高度保守性，人类、大鼠和小鼠的ChREBP基因大约有82%的碱基序列是完全一致的。本研究显示，在手术后第4周，高脂饲养肝脏内CHREBP的mRNA表达量较明显下降。相关研究也发现，持异性地抑制肝脏内ChREBP的表达，肥胖小鼠肝脏中脂肪酸合成的相关酶表达量明显降低。SREBP-1c是肝脏脂肪酸从头合成路径的一个转录调控因子。研究[14]发现,肥胖型糖尿病大鼠在减重术后2个月，其肝脏中SREBP-1c的mRNA表达量亦显著降低，这与本研究的结果一致。还有研究[15]表明，SREBP-1c不但能够调控肝脏内的脂质合成，还能影响肝脏的胰岛素信号转导改善脂肪肝。
高脂饲养可以诱导了实验大鼠体内脂代谢紊乱及脂肪肝的发生，RYGB可以显著改善高脂诱导的大鼠脂肪肝及脂质代谢紊乱，抑制脂肪酸从头合成途径的关键酶ChREBP和SREBP-1c可能是其治疗的重要机制。本研究后续将重点研究脂肪酸合成途径关键酶在蛋白水平的变化及调控脂质氧化分解的重要通路在RYGB中的作用。
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Impact of Roux-en-Y gastric bypass surgery on fatty liver in rats with high-fat diet-induced obesity and its mechanism
【Abstract】Objective To investigate the impact of Roux-en-Y gastric bypass surgery(RYGB) on fatty liver in rats with high-fat diet-induced obesity and its mechanism. Methods Thirty Wistar rats were randomly divided into three groups with 10 in each group. Rats in ND group were fed with normal diet, rats in HFD and HFD +RYGB groups were fed with high-fat diet; after 16 weeks, rats underwent sham operation in ND group and HFD group, and RYGB in HFD plus RYGB group. All rats were sacrificed after 4 weeks of operation. Total body weight, liver weight and visceral fat were measured. Serum triglyceride (TG), total cholesterol (TC), free fatty acid (FFA) concentrations were measured by ELISA. Hepatic tissues were harvested, pathological changes were observed by H-E and oil red O staining. The expressions of carbohydrate response element binding protein (ChREBP), sterol regulatory element-binding transcription factor 1c (SREBP-1c) and acetyl-CoA carboxylase (ACC) mRNA were detected by Real-time PCR. Results Total body weight, liver weight and visceral fat in HFD group were higher than those in ND group(P<0.05); compared with HFD group, those indicators were decreased in HFD plus RYGB group(P<0.05). Serum TG, TC, FFA concentrations in HFD group were higher than those in ND group(P<0.05); compared with HFD group, those indicators were decreased in HFD plus RYGB group(P<0.05). TG, TC concentrations in liver in HFD group were higher than those in ND group(P<0.05); compared with HFD group, those indicators were decreased in HFD plus RYGB group (P<0.05). H-E and oil red O staining showed that hepatic cell lipid, lipid vacuoles decreased in HFD plus RYGB group. Compared with HFD group, the expressions of ChREBP and SREBP-1c mRNA decreased in HFD plus RYGB group after 4 weeks of operation(P<0.05). Conclusion RYGB can reduce visceral fat and blood lipid, alleviate the deposition of TG and TC in the liver, improve the fatty infiltration and vacuolar degeneration in the liver, down-regulate the expressions of ChREBP and SREBP-1c mRNA in rats with high-fat diet-induced obesity.
【Key words】Roux-en-Y gastric bypass surgery; nonalcoholic fatty liver disease; carbohydrate response element binding protein; sterol regulatory element-binding transcription factor 1c; rat
doi：10.16118/j.1008-0392.2017.03.005
收稿日期：2017-01-09
基金项目：国家自然科学基金(81200244)
【中图分类号】R 656.6
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2017)03-0025-05