图1 牙胚发育启动期(E11.5)β-catenin的表达(×200)
Fig.1 Expression of β-catenin in tooth initial stage (E11.5) (×200)
A为H-E染色，B为免疫组织化学染色；箭头示牙源性上皮
·基础研究·
【摘要】目的 检测β-catenin在小鼠下颌第一磨牙牙冠形成的表达，探讨其在小鼠牙胚发育过程中的作用。方法 取孕11天(E11.5)、孕13.5天(E13.5)、孕14.5天(E14.5)、孕16.5天(E16.5)、孕18.5天(E18.5)的ICR胎鼠及出生后24h、出生后3天及出生后7天(PN0、PN3、PN7)的小鼠，常规组织学处理并制备下颌第一磨牙冠状或矢状切片，用免疫组织化学实验方法检测β-catenin在下颌第一磨牙相关组织中的表达情况。结果 β-catenin在小鼠下颌第一磨牙早期发育不同阶段呈现特异性的表达模式。在E11.5，上皮层可检测到β-catenin的表达；在E13.5，β-catenin的表达集中在向下方间充质凹陷的牙蕾上皮；在E14.5，在内釉上皮层及釉结节可以检测到β-catenin的强阳性表达；在E16.5、E18.5，在内外釉上皮、第二釉结节及邻近上皮的成牙本质细胞层可检测到β-catenin的表达。从出生后开始，在冠方的成牙本质细胞层、成釉细胞层，以及根方邻近上皮根鞘和上皮隔的牙乳头中的成牙本质细胞层内，可观察到β-catnein的阳性表达。结论 在牙胚发育过程中，β-catenin在牙源性上皮、釉结节及成牙本质细胞、成釉细胞中强表达，与牙冠形态发育及间充质细胞向成牙本质细胞分化密切相关。
【关键词】β-catenin； Wnt信号通路； 牙胚发育； 磨牙； 小鼠
牙齿的生长发育是牙源性上皮和其下方间充质之间相互作用的结果[1]。牙胚的发育从牙板上皮的增厚开始，历经蕾状期、帽状期、钟状期等几个阶段[2]，随后矿物质沉积逐渐形成牙冠，直至牙根发育完成。整个生长过程，受到了许多信号通路的调控，由β-catenin参与介导的Wnt经典信号通路在其中发挥了重要的作用[3]。
研究表明，Wnt/β-catenin信号通路和胚胎发育中细胞的增殖、分化、组织形成等生物过程密切相关。在牙齿发育方面，Wnt/β-catenin在牙上皮的增殖发育以及成牙本质细胞的生长分化过程当中都起到了重要的作用[4]。然而相关的研究较为局限，且并未完全包含牙齿早期发育的各个阶段。本实验通过免疫组织化学染色的方法，检测小鼠牙发育期间下颌第一磨牙牙冠形成阶段牙胚中β-catenin的表达情况，探究Wnt/β-catenin信号通路在小鼠牙发育过程中具体的生物学作用。
1.1 实验动物与材料
实验使用ICR孕鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供；H-E染色试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；鼠单克隆抗β-catenin连环蛋白一抗(sc-7963)购自Santa Cruz公司；山羊抗鼠二抗(ab102446)SABC购自Abcam公司；DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 标本制备
将出现阴道栓的当日清晨定为孕0天(E0，embryonic day 0),分别取孕11天(E11.5)、孕13.5天(E13.5)、孕14.5天(E14.5)、孕16.5天(E16.5)、孕18.5天(E18.5)的胎鼠作为研究对象；将小鼠出生当日定为出生0天(PN0，postnatal day 0)，取出生后24h、出生后3天及出生后7天(PN0、PN3、PN7)的小鼠作为实验研究对象。乙醚麻醉，脱颈处死孕鼠，剖腹取出孕鼠腹中胎鼠；或直接取出生后小鼠，分离鼠头。4%多聚甲醛(pH 7.4)室温下固定20h，石蜡包埋组织。切取厚度为5μm的冠状或矢状方向切片，60℃烤片16h，4℃冰箱保存。常规H-E染色，光学显微镜观察标本，确定牙胚发育阶段。
1.3 H-E染色及免疫组织化学染色实验
本实验采用SABC法进行β-catenin的免疫组化染色，具体操作如下： 常规脱蜡至水；0.2%Triton X-100室温孵育10min裂解细胞膜；3%过氧化氢溶液室温孵育10min以灭活组织中的内源性过氧化物酶；将切片浸没于枸橼酸钠缓冲溶液中，微波炉热修复法进行抗原修复，常温彻底冷却，重复3次；5%BSA室温孵育30min；加入鼠单克隆抗β-catenin一抗，4℃冰箱中孵育过夜(或常温孵育2h)；室温生物素山羊抗鼠IgG二抗孵育20min；滴加SABC(链霉亲和素标记的过氧化物酶)反应,室温20min；DAB显色，苏木精复染。中性树胶封片剂封片，镜检拍照。
实验结果显示，从牙胚发育起始阶段(E11.5)至出生后牙冠发育基本完成时(PN7)，β-catenin在牙胚组织中呈现时间-空间特异性表达。
2.1 牙胚发育启动期(E11.5)β-catenin的表达
在E11.5，牙胚的发育启动。牙源性上皮增厚并凹入其下方的间充质，邻近增厚区的间充质细胞发生聚集，见图1A。免疫组织化学染色结果显示： 在增厚的上皮处可以检测到β-catenin的阳性表达，而其邻近的间充质细胞处则没有阳性染色结果。牙板上皮处β-catenin的表达也呈强阳性，见图1B。
图1 牙胚发育启动期(E11.5)β-catenin的表达(×200)
Fig.1 Expression of β-catenin in tooth initial stage (E11.5) (×200)
A为H-E染色，B为免疫组织化学染色；箭头示牙源性上皮
2.2 牙胚蕾状期(E13.5)β-catenin的表达
在E13.5，牙胚发育位于蕾状期。上皮继续增殖并侵入其下方间充质，继而快速膨大形成牙蕾状结构，此时成釉器形成。邻近间充质发生明显凝集，包饶在牙蕾周围，见图2A。免疫组织化学染色结果显示： β-catenin在末端牙蕾上皮呈现中度表达，而在其邻近间充质以及牙板上皮处呈现弱表达，见图2B。
图2 牙胚蕾状期(E13.5)β-catenin的表达(×400)
Fig.2 Expression of β-catenin in bud stage (E13.5)(×400)
A为H-E染色，B为免疫组织化学染色；箭头示上皮蕾
2.3 牙胚帽状期(E14.5)β-catenin的表达
在E14.5，牙胚发育进入帽状期，上皮细胞持续增生并且整个上皮结构发生折叠。成釉器分化为三层，分别是内釉细胞层、星网状层及外釉细胞层。与此同时，牙源性间充质分化为牙乳头和牙囊。在这个时期，内釉上皮处形成了临时信号中心-原发性釉结节，见图3A。免疫组化染色结果显示： β-catenin在内釉上皮特别是第一釉结节处呈现强阳性表达，并且在内外釉上皮以及星网状层处也可检测到其阳性表达，而在牙囊细胞处则未观测到β-catenin的染色，见图3B。
2.4 牙胚钟状早期(E16.5)β-catenin的表达
在E16.5，小鼠下颌第一磨牙牙胚发育处于钟状期早期。此时成釉器继续分化形成内釉上皮层，外釉上皮层，中间层和星网状细胞，成釉器基本发育完成。在未来牙尖发育的部位，形成继发性釉结节，未来牙冠的形态初现。内外釉上皮连接处颈环形成，见图4A。免疫组化染色结果显示： 在内外釉细胞和釉结节处β-catenin染色较为明显；而在邻近成釉上皮的牙乳头和星网状层细胞处，也可观测到其表达；在牙囊细胞处则β-catenin染色呈阴性，见图4B。
图3 牙胚帽状期(E14.5)β-catenin的表达(×400)
Fig.3 Expression of β-catenin in cap stage (E14.5) (×400)
A为H-E染色，B为免疫组织化学染色；箭头示星网状层；星号示釉结节，三角箭头示牙乳头
图4 牙胚钟状期(E16.5)β-catenin的表达(×200)
Fig.4 Expression of β-catenin in bell stage (E16.5) (×200)
A为H-E染色，B为免疫组织化学染色；箭头示内釉上皮，星号示釉结节
2.5 牙胚钟状晚期(E18.5)β-catenin的表达
在E18.5，小鼠第一磨牙牙胚发育进入钟状晚期，未来牙冠形态基本确定。邻近上皮的牙乳头细胞分化形成成牙本质细胞，而与间充质接触的上皮细胞则分化为成釉细胞，见图5A。此时β-catenin染色结果和钟状早期(E16.5)相类似，在内外釉上皮处均可检测到β-catenin的表达，在牙乳头内成牙本质细胞处也有β-catenin的表达，见图5B。
图5 牙胚钟状晚期(E18.5)β-catenin的表达(×200)
Fig.5 Expression of β-catenin in late bell stage (E18.5)(×200)
A为H-E染色，B为免疫组织化学染色；箭头示内釉上皮，星号示成牙本质细胞
2.6 新生鼠(PN0)牙胚β-catenin的表达
在PN0，小鼠牙胚发育位于钟状期末期，仅在牙冠的牙尖处，可以观察到硬组织的形成，见图6A。其中β-catenin的表达主要集中在内釉细胞，成牙本质细胞层也可观察到，见图6B。
图6 新生鼠牙胚(PN0)β-catenin的表达(×200)
Fig.6 Expression of β-catenin in neonatal stage (PN0)(×200)
A为H-E染色，B为免疫组织化学染色；箭头示内釉上皮，星号示成牙本质细胞
2.7 出生后(PN3)牙胚β-catenin的表达
在PN3，小鼠牙冠形态发育，硬组织沉积即将完成，牙根的发育启动。颈环处的内外釉上皮增生，形成上皮根鞘。上皮根鞘继续生长，离开牙冠向牙髓方向弯曲，形成盘状上皮隔，见图7A。此期β-catenin在成牙本质细胞层表达呈阳性。在上皮根鞘和上皮隔相邻的成牙本质细胞处特异的可检测到β-catenin的强阳性表达，在成釉细胞层也可检测到β-catenin的强阳性表达，在牙乳头层有β-catenin的广泛表达，见图8B。
图7 出生后(PN3)β-catenin的表达(×100)
Fig.7 Expression of β-catenin in postnatal stage (PN3)(×100)
A为H-E染色，B为免疫组织化学染色；箭头示成牙本质细胞，星号示成釉细胞，三角箭头示牙乳头
2.8 出生后(PN7)牙胚β-catenin的表达
在PN7，小鼠下颌第一磨牙牙根处于发育早期，牙冠形态基本形成，在颈环处形成了由内外釉上皮组成的Hertwig’s上皮根鞘，见图8A。在成牙本质细胞层，特别邻近上皮根鞘的成牙本质细胞处，可检测到β-catenin的强阳性表达；在成釉细胞层也可检测到β-catenin的强阳性表达；牙乳头内也有β-catenin的广泛阳性表达，见图8B。
图8 出生后(PN7)β-catenin的表达(×100)
Fig.8 Expression of β-catenin in postnatal stage (PN7)(×100)
A为H-E染色，B为免疫组织化学染色；箭头示成牙本质细胞，星号示成釉细胞，三角箭头示牙乳头
β-catenin作为犰狳家族蛋白成员之一，参与了细胞的增殖、分化、迁移、成熟等过程，并且在胚胎发育和组织自我稳态平衡的调控中扮演了重要的角色[5]。Wnt信号通路已知包括有三条传导途径，而由β-catenin介导的Wnt信号通路是目前研究最为透彻的一条Wnt信号通路经典途径。牙齿的生长发育是牙源性上皮和其下方间充质相互作用而产生的一个长期连续的复杂过程，其中涉及了多条信号通路的共同参与。Wnt/β-catenin信号通路作为胚胎发育过程中重要的信号通路之一，在牙胚发生发育过程当中同样起到了关键的作用。
国内外学者[6-7]运用不同的实验方法，先后对哺乳动物正常牙胚生长发育过程中，牙体组织内β-catenin的表达情况进行了检测。但是相关的检测时期不全面，仅能部分地了解β-catenin在牙胚内的表达情况，对于其在牙胚生长发育过程中起到的作用仍无法得出系统性的概括。故本实验以小鼠下颌第一磨牙牙冠发育阶段为研究模型，通过免疫组化的实验方法，对β-catenin在牙冠形成阶段小鼠牙胚各个时期的表达进行了系统的检测，为进一步研究β-catenin在牙胚发育过程中的具体作用提供参考。
早在E11.5，小鼠下颌第一磨牙牙胚发育启动时，β-catenin就开始在增厚的牙板上皮中表达。这一阶段上皮增殖迅速，并朝深层的间充质生长。研究[8]表明，在牙发生的早期阶段抑制Wnt/β-catenin通路的表达将使得牙胚的发育停滞；若在此期激活Wnt/β-catenin信号通路，将会促进细胞增殖，抑制细胞分化甚至诱导多生牙的发生。亦有学者[9]发现，在牙胚发育早期阶段，Wnt10a的缺失可诱导少牙畸形的发生。推测Wnt/β-catenin可能协同Wnt10a一起参与了牙胚发生的启动过程。
从蕾状期(E13.5)直至钟状早期(E16.5)，β-catenin的表达主要集中在上皮层以及其邻近的间充质细胞中。作为牙胚发育过程中的临时信号中心，釉结节为牙齿的形态发生提供了具体的位置信号，继而调控了牙尖的形态大小。在该阶段的釉结节处，可以特异地检测到β-catenin的强阳性表达。近年来，文献[10]报道，Wnt信号通路的抑制性配体Wif-1在帽状期及钟状期的釉结节呈强阳性表达，并且特异性敲出Wif-1将会导致牙胚发育的停滞。β-catenin和Wif-1在本阶段一起在信号中心釉结节的表达提示在磨牙牙冠发育过程当中，两者一起介导了上皮和间充质之间的信号传递。
到了钟状期晚期(E18.5)时，牙冠形态基本形成，邻近上皮的牙乳头细胞和与间充质接触的上皮细胞分别分化为具有分泌牙本质能力的成牙本质细胞和可分泌形成釉质的成釉细胞。此期β-catenin在成釉细胞及成牙本质细胞层呈现强表达。体外细胞实验也已经表明，lncRNA DANCR通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的表达抑制了牙髓干细胞向成牙本质细胞细胞的分化[11]。Wnt10a亦被证明和牙髓干细胞向成牙本质细胞分化相关[12]。研究[13]发现，调节因子PKP1通过与β-catenin类似的作用机制，介导Wnt/β-catenin信号通路，进而调控成釉细胞的分化成熟。本研究认为，Wnt/β-catenin信号通路和牙发育相关细胞的分化过程紧密相关。
从出生后开始，成牙本质细胞和成釉细胞逐渐分化成熟，牙根的发生紧接着牙冠的发育完成进行。PN1至PN7，牙冠方β-catenin在上皮层内的广泛表达逐渐减弱，在成牙本质细胞层处呈逐渐增强的阳性表达；在牙根方向，邻近上皮根鞘和上皮隔的成牙本质细胞中，同样检测到了β-catenin的特异性表达。上皮根鞘和其邻近间充质之间的相互作用和冠方上皮和间充质之间的作用类似，对于牙根发育至关重要。国外有学者[14]利用成牙本质细胞特异的CTNNB(编码β-catenin)基因敲除小鼠进行实验，证明了β-catenin介导的Wnt信号调节了成牙本质细胞的增殖和分化，参与了上皮根鞘对牙根发育的调控过程。在其他文献[15]中，同样存在类似的实验探究，共同支持这一结论。据此，本研究推测由β-catenin参与介导的Wnt信号通路通过对成牙本质细胞分化以及上皮根鞘和邻近牙乳头的影响，调控了牙本质的发育成熟、牙根的形成。后续研究将进一步探究β-catenin在牙根发育过程中发挥的具体作用。
由β-catenin介导的Wnt经典信号通路，已经被证明在脊椎动物胚胎发育时期许多器官的形态发生过程中起决定性作用。本研究采用免疫组化方法验证了β-catenin在小鼠磨牙牙冠发育过程中呈特异性的时空表达模式，特别是其在成釉器的分化成熟、牙尖的形成过程以及牙根发育早期过程中的特异性表达提示其可能与牙冠的形态发生及牙根的发育密切相关。β-catenin可能协同Wnt10a、Wnt5a、Wif-1等一起介导Wnt/β-catenin信号通路，调控小鼠磨牙牙冠的发育。
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Expression of β-catenin in mouse first mandibular molar tooth germs
【Abstract】Objective To detect the expression pattern of β-catenin in the first mandibular molar tooth germs of mice and its relation to early tooth development. Methods Serial paraffin sections of the first mandibular molars at different development stages of mice(E11.5，E13.5，E14.5，E16.5，E18.5，PN0，PN3，PN7)were made. The expression of β-catenin was analyzed by immunohistochemistry. Results The expression patterns of β-catenin in the first lower molars varied among the mice with different development stages. It was positively expressed in the dental epithelium at tooth initiation stage; and it was detected in the central areas of the tooth bud during the bud stage, while the immunostaining was focused on the inner and outer enamel epithelium, especially on the enamel knot, during the cap stage. At the bell stage, the β-catenin was strongly expressed in the outer and inner enamel epithelium and the second enamel knot. During the early postnatal stage, the expression of β-catenin was detected in the areas where the ameloblasts or the odontoblasts were located. Conclusion The expression of β-catenin was in a temporal-spatial specific pattern; particularly, it is strongly expressed in the dental epithelial, enamel knot and odontoblasts with the development of tooth germ. This result indicates that-catenin may be involved in tooth morphogenesis of the mouse molars and the biological process of the odontoblast differentiation.
【Key words】β-catenin; Wnt signaling pathway; tooth germ development; molar; mice
doi：10.16118/j.1008-0392.2017.03.004
收稿日期：2016-09-16
基金项目：上海市科委医学引导项目(124119a7400、15411965800)
【中图分类号】R 780.1
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2017)03-0019-06