图1 不同浓度DDP、CpG-ODN刺激后细胞生长曲线
Fig.1 Cell growth curve after stimulation by different concentration of DDP and CpG-ODNA: DDP; B: CpG-ODN
·基础研究·
【摘要】目的 研究CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)对肺癌A549细胞化疗的影响，并探讨其可能的作用机制。方法 将肺癌A549细胞分为空白对照组、DDP组、CpG-ODN组、DDP+CpG-ODN组、CpG-ODN+DDP组。采用CCK-8比色法检测细胞的增殖情况，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，RT-PCR检测TLR9 mRNA的表达，Western印迹法检测TLR9信号通路中MyD88、AP-1的表达。结果 TLR9激活CpG ODN后，能显著提高细胞的增殖能力(P<0.05)；CpG-ODN与CpG-ODN+DDP两组细胞生长无明显差异(P>0.05)；CpG-ODN+DDP组细胞凋亡率较DDP组低(P<0.05)，DDP+CpG-ODN组细胞凋亡率较DDP组明显升高(P<0.05)；DDP+CpG-ODN组TLR9 mRNA较DDP组明显升高(P<0.05)；DDP+CpG组AP-1蛋白表达上调(P<0.05)。结论 CpG-ODN激活TLR9信号通路后，可协同DDP促进细胞凋亡，提高顺铂化疗的敏感性。
【关键词】非小细胞肺癌； CpG寡聚脱氧核苷酸； 化学疗法
近年来，肺癌的发病率呈现快速上升趋势，位居我国癌症发病率前列，且大部分肺癌患者发现时已失去手术治疗机会。据中国肿瘤登记中心2015年报数据，肺癌年新增患者约73.33万，年死亡患者数62.02万[1]。目前，化疗仍是肺癌的主要治疗手段。但肺癌对化疗并不敏感，其有效率仅有20%～40%，中位生存在约8～10个月[2]。顺铂是常用的肺癌一线化疗药物，但后期易产生耐药性。如何提高其化疗敏感性成为亟待解决的的问题。近年来，新兴的免疫靶向治疗显现出良好的发展潜力。Toll样受体(Toll-like receptor, TLRs)是一种特殊的免疫受体家族，可以诱导保护性免疫反应的发生。TLRs在先天和获得性免疫、抗感染、疫苗佐剂、抗肿瘤等方面都发挥着重要的作用。目前，TLR9激动剂——CpG-ODN在多项临床试验中均显示出良好的放化疗佐剂或单药抗肿瘤疗效。本研究通过体外实验，将CpG-ODN协同顺铂作用于人肺腺癌A549细胞，观察CpG-ODN对顺铂化疗后肿瘤细胞的影响，并探讨其可能的机制。
1.1 材料
1.1.1 细胞 人肺腺癌细胞A549细胞由同济大学附属东方医院中心实验室提供，用含10%胎牛血清、100μmol/ml青链霉素的F-12K培养液在5%CO2、37℃条件下培养。A549-DDP购自上海肯强生物工程公司，用含10%胎牛血清、100μmol/ml青链霉素的DMEM高糖培养液在5%CO2、37℃条件下培养。
1.1.2 主要试剂 D型CpG-ODN(序列: 5′-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3′)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，全硫代磷酸化修饰，PAGE纯化；胎牛血清、F-12K培养液、DMEM高糖培养液均购自Gibco公司；CCK-8试剂盒购自同仁化学研究所；TLR9单克隆抗体购自CST公司；MyD88、AP-1单克隆抗体购自eBiscience公司；顺铂购自Sigma公司；RT-PCR试剂盒及反转录试剂盒购自TaKaRa公司。
1.2 方法
1.2.1 CCK-8法检测DDP、CpG-ODN处理后对A549细胞的增殖影响 取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液后，细胞计数,将细胞浓度调整为2×104/ml,然后接种到96孔板上，每孔加入0.1ml细胞悬液，待细胞完全贴壁后加入DDP、CpG-ODN，使DDP终浓度为0.5、1、2、4μg/ml，CpG-ODN终浓度为5、10、20、40μg/ml，各浓度点设置3个平行样。实验开始0、18、36、54、72h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，作用2h，测量450nm处各孔的光密度值(D450)。实验重复3次，取平均值。
1.2.2 DDP、CpG-ODN联合作用对细胞增殖影响的测定 取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液后，细胞计数将细胞浓度调整为2×104/ml,然后接种到96孔板上，每孔加入0.1ml细胞悬液，待细胞完全贴壁后，分为： 空白对照组、DDP组、CpG-ODN组、DDP+CpG-ODN组、CpG-ODN+DDP组。方法同1.2.1。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 取指数生长期的A549细胞，接种在6孔板中(每孔4×105个细胞)，培养24h，随机分为如上5组，分组同1.2.2。用胰酶消化和收集各组细胞(包括上清液中的细胞)，冷PBS清洗3遍，加入100μl缓冲液重悬，再加入5μl Annexin Ⅴ 和5μl PI溶液，轻轻振匀，室温避光反应15min，再加入300μl缓冲液。振匀，上流式细胞仪检测，以平均荧光强度(MFI)表达细胞凋亡水平。
1.2.4 RT-PCR 采用RT-PCR检测肿瘤细胞TLR9 mRNA的表达，提取细胞总RNA并合成cDNA第一条链。PCR反应体系为： cDNA 1.5μl, 5μmol/L的上、下游引物各5μl,SYBR荧光染料实时PCR反应混合液 12.5μl，用去离子水将总体积补至25μl。在定量PCR仪上按以下条件扩增： 95℃ 15s, 58℃ 15s, 72℃ 30s共40个循环，同时记录熔解曲线。上述各组试验均重复3次。
1.2.5 Western印迹法检测 MyD88、AP-1蛋白质的表达： 细胞刺激72h后,用冷PBS溶液洗涤细胞,各孔加入适量细胞裂解液(100mmol/L TrisCl,pH 6.8，40g/L SDS，200g/L甘油，10mg/L leupeptin，10mg/L aprotinin)，冰上孵育20min,细胞刮棒刮下并收集裂解物,超声匀浆,4℃,离心半径 24cm,6500r/min,离心 10min,取上清液，-20℃保存。用BCA法测定蛋白质浓度,取相同量蛋白质用于 100g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移至PVDF膜30g/L牛血清白蛋白和50g/L脱脂奶粉溶液(溶于TBST缓冲液： 10mmol/L TrisHCl，pH 7.5，100mmol/L NaCl，1ml/L Tween20)室温封闭2h,兔抗MyD88、AP-1抗体(1∶1000),小鼠抗β-actin抗体(1∶1000)4℃孵育过夜,TBST溶液洗膜4次,每次15min。室温下相应加入羊抗兔IgG抗体或羊抗小鼠IgG抗体(1∶5000)孵育2h,同前法洗膜4次,用增强化学发光法显色,X线片曝光显影,凝胶成像分析系统摄像分析。
1.3 统计学处理
实验数据经SPSS 17.0软件分析，对各组实验数据组间差异进行单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 DDP、CpG-ODN诱导后各组A549细胞的增殖水平
CpG-ODN(10μg/ml)诱导48h后，A549细胞增殖较明显(P<0.05)；顺铂(2μg/ml)诱导36h后，细胞抑制作用开始增加(P<0.05)，见图1。由此确定下一步分组实验中DDP浓度为 2μg/ml，CpG-ODN浓度为10μg/ml。进一步采用CCK-8法检测空白对照组、DDP组、CpG-ODN组、DDP+CpG-ODN组(DDP诱导 36h 后加入CpG-ODN)、CpG-ODN+DDP组(CpG-ODN诱导48h后加入DDP)对A549细胞的增殖影响力。实验结果显示： CpG-ODN能够激活肿瘤细胞中TLR9信号通路，促进细胞生长，而CpG-ODN与CpG-ODN+DDP两组细胞生长无明显差异，可能TLR9信号通路激活后，细胞能够耐受顺铂化疗,而接受DDP化疗的肿瘤细胞再加入CpG-ODN后，细胞生长不明显，见图2。
图1 不同浓度DDP、CpG-ODN刺激后细胞生长曲线
Fig.1 Cell growth curve after stimulation by different concentration of DDP and CpG-ODNA: DDP; B: CpG-ODN
图2 DDP(2μg/ml)、CpG-ODN(10μg/ml)诱导后各组细胞的增殖水平
Fig.2 The proliferation of cells after induction by DDP(2μg/ml)and CpG-ODN(10μg/ml)
2.2 细胞凋亡率
CpG-ODN诱导后，CpG-ODN+DDP组细胞的凋亡率与单独DDP化疗组凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)，说明CpG-ODN激活TLR9通路后，激活的肿瘤细胞耐受顺铂诱导的细胞凋亡。DDP+CpG-ODN组细胞凋亡率较DDP组明显升高(P<0.05)，说明CpG-ODN能协同DDP促进肿瘤细胞凋亡，见图3。
2.3 TLR9 mRNA的表达
DDP+CpG-ODN组TLR9 mRNA较DDP组明显升高(P<0.05)，说明DDP作用肿瘤细胞后，CpG-ODN仍可激活TLR9信号通路，上调TLR9的表达，见图4。
2.4 MyD88、AP-1蛋白的表达
各组细胞MyD88的表达量无明显差异；CpG组、CpG+DDP组AP-1的表达明显低于对照组(P<0.05)，而DDP+CpG组AP-1蛋白的表达量却高于对照组(P<0.05)，见图5。
图3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况
Fig.3 Cell apoptosis by Flow cytometry
图4 各组细胞TLR9 mRNA的表达量
Fig.4 The expression of TLR9 mRNA
图5 Western印迹法检测蛋白表达情况
Fig.5 Protein expression detected by Western blotting
1： 对照组；2： CpG-ODN；3： DDP+CpG-ODN；4： CpG-ODN+DDP；5： DDP
近年来，我国肺癌的发病率和死亡率都呈现快速上升。据统计，国内大中城市男性中肺癌的发病率已占所有恶性肿瘤的首位，女性也上升到第2位，仅次于乳腺癌[3]。虽然随着对肿瘤的深入认识，肺癌的靶向药物和免疫治疗等方面快速发展，但化疗仍做为肺癌治疗的首选。顺铂作为肺癌的常规化疗药物，在临床中广泛应用，但其疗效并不十分令人满意，因此如何提高化疗敏感性成为值得深入探讨的问题。
1995年，Krieg等[4]发现，CpG ODN是病原体DNA免疫刺激活性的基础结构，能被TLR9特异性识别，通过TLR9的识别作用启动信号转导级联反应。TLR9具有广泛的免疫调控功能，促进固有免疫反应并调控适应性免疫。TLR9表达于多种肿瘤细胞，并且TLR9信号的活化与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移以及治疗抗拒等的关系密切[5-8]。本研究也发现，NSCLC A549细胞高表达TLR9，其配体CpG ODN激活后能够显著提高细胞的增殖能力。同时，本研究发现CpG ODN激活TLR9信号通路后，CpG ODN+DDP组细胞凋亡率较DDP组明显降低，可能细胞能够耐受顺铂化疗，而DDP+CpG-ODN组细胞凋亡率较DDP组明显升高，说明CpG ODN能明显促进肿瘤细胞凋亡，提高顺铂化疗的敏感性。Wang等[9]发现，在体外实验或动物实验中，CpG-ODN可通过多种途径进入不同组织中，并且在肿瘤组织中浓度达到最高，在MCF-7荷瘤动物模型中，低剂量的CpG-ODN即可抑制肿瘤生长达40%，而作为免疫调节剂与抗肿瘤抗体药物赫赛汀联用，可抑制超过96%的肿瘤生长。由此可见，CpG-ODN或许可作为一种独特的免疫调节剂应用于肺癌抗肿瘤治疗。2008年，Manegold等[10]报道了K型ODN(PF-3512676)联合紫杉烷和铂类治疗晚期NSCLC的Ⅱ期临床试验的研究结果。试验共111例初治ⅢB或Ⅳ患者，随机分为单纯化疗组(紫杉烷+铂类)和ODN联合化疗组，化疗组接受4～6次为期3周的化疗，联合化疗组除了使用化疗药物外还于每个化疗周期的第8天和第15天皮下注射ODN，剂量为0.2mg/kg。单纯化疗组和联合化疗组的客观反应率(RECIST法评价)分别为19%和38%，中位生存时间分别为6.8个月和12.3个月，1年生存率分别为33%和50%。2012年，Manegold等[11]报道了一项随机对照Ⅲ期临床试验结果，评估ODN(PF-3512676)对吉西他滨联合顺铂治疗晚期NSCLC患者疗效的影响。839例未接受化疗的ⅢB或Ⅳ期患者随机分为化疗组和ODN联合化疗组，ODN的剂量与用药方法同Ⅱ期临床试验。两组患者的临床数据相似，但总生存率相似(11.0个月vs 10.7个月，P=0.98)，无进展存活均为5.1个月。可见，Ⅱ期、Ⅲ期临床试验的结果并不如细胞及动物试验数据那么令人满意。
TLR9的激活始于受体与配体的结合，胞质内TLR9与其配体CpG DNA/ODN结合后，空间结构发生变化，通过胞内TIR区域募集衔接蛋白MyD88。MyD88可激活下游信号分子NF-κB和AP-1，进入细胞核内发挥基因表达调控[12]。活化的AP-1通过调节下游靶基因的表达参与了细胞外基质的降解、异常黏附以及转移灶新生血管生长等多个侵袭转移环节[13-15]。本研究发现，CpG-ODN激活TLR9信号通路后，MyD88的表达较对照组增高，与其他实验组差异无统计学意义。而加入CpG-ODN诱导细胞后，DDP+CpG-ODN组AP-1蛋白的表达量却高于对照组。结合DDP+CpG-ODN组细胞凋亡率较DDP组明显升高的实验结果，考虑CpG ODN在促进肿瘤细胞凋亡的同时，可能因AP-1活化增强了肿瘤的侵袭转移性。
虽然进展期NSCLC患者在ODN联合化疗治疗中未获得良好的预期效果，但CpG-ODN的抗肿瘤作用是明确的。原因可能是： 不同种类的CpG ODN抗肿瘤性质不同；CpG-ODN使用的时机不对；在早期NSCLC患者治疗或新辅助化疗中,CpG-ODN的治疗效果更佳；临床阳性和阴性结果取决于TLR9信号系统的复杂性。因此，继续探索化疗后肿瘤细胞TLR9功能的变化以及CpG-ODN对肿瘤细胞化疗敏感性的影响，将有利于ODN在临床治疗中的合理应用。
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CpG-ODN enhances sensitivity to chemotherapy in lung cancer cell line A549
【Abstract】Objective To investigate the effect of TLR9 activator CpG-ODN on chemosensitivity of lung cancer A549 cells. Methods Cultured lung cancer A549 cells were divided into control group, DDP group, CpG-ODN group, DDP+CpG-ODN group, CpG-ODN+DDP group. Cell proliferation was analyzed with CCK-8 method; cell apoptosis was examined with flow cytometry; the mRNA expression of TLR9 was detected with RT-PCR; and the protein expression of MyD88 and AP-1 was detected with Western blotting. Results The cell proliferation was improved in CpG-ODN groups(P<0.05); there was no significant difference between CpG-ODN and CpG-ODN+DDP groups(P>0.05). The apoptosis rate of CpG-ODN+DDP was lower than that of DDP(P<0.05), and the apoptotic rate of DDP+CpG-ODN was significantly higher than that of DDP(P<0.05). The expression of TLR9 mRNA in DDP+CpG-ODN was higher than that in DDP group(P<0.05). The expression of AP-1 in DDP+CpG group was up-regulated(P<0.05). Conclusion The data indicate that the CpG-ODN can increase cell apoptosis and enhance the sensitivity of lung cancer cells to cisplatin chemotherapy.
【Key words】non-small cell lung cancer; CpG-ODN; chemotherapy
doi：10.16118/j.1008-0392.2017.03.003
收稿日期：2017-03-06
基金项目：国家自然科学基金(81372347)；上海市浦东新区卫生系统重点学科建设项目(PWZx2014-10)
【中图分类号】R 734.2
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2017)03-0014-05