， 陈 晋·临床研究·
高荣， 陈 晋
【摘要】目的 评估GeneXpert Mtb/RIF检测技术在临床耐药结核病诊断中的应用效果。方法 收取240例结核病住院患者的晨痰样本分别进行痰涂片镜检、MGIT960液体培养及GeneXpert Mtb/RIF快速检测，对于MGIT960液体培养与GeneXpert同为阳性的样本进一步进行MGIT960药敏检测。以MGIT960液体法作为金标准，评估GeneXpert Mtb/RIF检测技术的敏感性和特异性以及Kappa值。结果 224例有效样本中涂片镜检阳性检测率为26.8%，MGIT960液体培养阳性检出率为45.1%，GeneXpert检测阳性检出率为46.9%；以MGIT960液体培养作为金标准，涂片镜检法的敏感度为59.4%，特异度为75.0%，GeneXpert检测法敏感度为91.1%，特异度为92.4%；以MGIT960药敏检测为金标准，GeneXpert检测法与之相比两种方法的一致性为96.7%，敏感度为92.3%，特异度为98.5%。结论 GeneXpert Mtb/RIF检测技术是一个敏感、特异和快速有效方法，有利于结核病的早期诊断。
【关键词】GeneXpert； 结核病； 耐药； 快速诊断
结核病是一种严重危害人类健康的慢性传染性疾病。近年来，耐药结核病特别是耐多药结核病(multi-drug resistant TB， MDR—TB)的流行给结核病的防控工作带来了新的挑战。我国是耐多药结核病最严重的国家之一，卫生部统计数据显示，我国涂阳肺结核患者的总耐药率为37.79%，耐多药比例高达8.32%[1-3]。与普通结核病相比，耐药结核病的治疗时间长，治愈率低，因而具有更高的传播风险[4]，现已成为我国结核病防控工作中亟待解决的难题。
目前我国结核病实验室常用的细菌学诊断方法仍然以涂片镜检、培养(固体法或液体法)和传统药敏试验为主。涂片镜检方法的敏感度相对较低，培养和药物敏感性试验耗时较长，均难以实现对结核病患者的早期正确诊断和治疗[5]。随着分子生物学诊断技术的不断发展，越来越多的分子诊断技术被应用于结核病实验室诊断。GeneXpert Mtb/RIF(以下简称“GeneXpert”)检测技术作为一种核酸扩增检测技术已经受到国内外广泛的关注，GeneXpert是一种半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术，可检测结核分枝杆菌及其rpoB基因是否发生突变。本研究对240例住院肺结核患者晨痰样本采用GeneXpert Mtb/RIF系统进行结核分枝杆菌及其对利福平耐药性的检测，并与传统的结核分枝杆菌涂片镜检、MGIT960液体培养和药敏试验方法作对比分析，以评价GeneXpert MTBMtb/RIF系统在肺结核诊断中的价值。
1.1 一般资料
1.1.1 标本来源 选取同济大学附属肺科医院2014年12月期间结核病住院患者晨痰样本240例。H37Rv标准株(ATCC27294)由中国疾病预防控制中心结核病参比实验室提供。
1.1.2 试剂与仪器 GeneXpert Mtb/RIF仪器设备及其配套检测试剂盒均由中国全球基金结核病项目办公室赠与。MGIT960全自动分枝杆菌鉴定系统购自BD医疗器械(上海)有限公司。结核分枝杆菌抗原检测(胶体金法)试剂盒购自杭州创新生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 痰涂片镜检、液体培养及药敏检测 按照《结核病实验室诊断技术培训教程》[6]中的标准化操作程序执行。
1.2.2 菌型初筛 从阳性培养管中吸取待测样本100μl滴到检测板的样本下部，15min后观察检测板的判定部，检测线(T)及质控线(C)双方都确认出现紫红色条带为阳性，即结核分枝杆菌复合群；检测线(T)处没有出现紫红色条带，只是在质控线(C)出现紫红色条带为阴性，即非结核分枝杆菌。
1.2.3 GeneXpert检测 接种后的痰标本消化液按照GeneXpert Mtb/RIF(Cepheid公司，美国)操作说明书上的步骤进行。无菌吸管移取1.0ml的痰液至螺旋盖试管中并加入2.0ml的GeneXpert样品试剂(SR)，在涡旋振荡器上振荡10s，室温放置15min，然后使用GeneXpert提供的专用吸管转移样本至专用的样本反应盒(GeneXpert Mtb/RIF Car-tridge)，将样本反应盒放入GeneXpert Dx(美国Cepheid公司)仪器的样本舱中，进行DNA提取、PCR扩增和结果的检测，通过专用软件判读结果。
1.3 统计学处理
应用SPSS 17.0统计软件对GeneXpert与不同检测方法进行敏感度和特异度分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 病例纳入
240例住院结核患者的晨痰样本分别进行痰涂片镜检、MGIT960液体培养以及GeneXpert检测，液体培养阳性菌液进行进一步菌型初筛和MGIT960药敏检测。其中2例样本在GeneXpert检测中报错，14例样本菌型初筛为非结核分枝杆菌，为体现方法可比性将其删除，最终纳入为224例。
2.2 224例样本三种方法检测结果
涂片镜检阳性检测率为26.8%(164/224)，MGIT960液体培养阳性检出率为45.1%(123/224)，GeneXpert检测阳性检出率为46.9%(119/224)。
2.3 以MGIT960液体培养作为金标准[7]三种方法比较
涂片镜检法的敏感度为59.4%，特异度为 75.0%，差异有统计学意义(P<0.001)。GeneXpert检测法敏感度为91.1%，特异度为 92.4%，差异有统计学意义(P<0.001)。其中GeneXpert检测法的Kappa值为0.80，大于0.70，说明GeneXpert与金标准有着较好的一致性，见表1。
表1 以MGIT960液体培养为金标准三种方法的比较
Tab.1 Comparison of three methods based on MGIT960 as a golden standard
方法MGIT960液体培养阳性阴性敏感度%特异度%Kappa值χ2值P值涂片镜检59.475.00.6299.8<0.001阳性600阴性41123GeneXpert91.192.40.80144.4<0.001阳性9213阴性9110
2.4 以MGIT960药敏检测为金标准两种方法比较
将MGIT960液体培养与GeneXpert检测同为阳性的样本进一步进行MGIT960药敏检测，以MGIT960药敏检测为金标准[7]，GeneXpert检测法与之相比两种方法的一致性为96.7%，敏感度为92.3%，特异度为98.5%，差异有统计学意义(P<0.001)。
近年GeneXpert检测技术已在多个国家和地区进行了验证评估[8-10]，由于其高敏感度和高特异度，为世界卫生组织推荐检测结核病和对利福平耐药结核病的方法[11]。本研究将结核病住院患者的晨痰样本同时进行痰涂片镜检、MGIT960液体培养以及GeneXpert检测，其中GeneXpert阳性检出率最高；以MGIT960为金标准，GeneXpert检测敏感度与特异度显著高于涂片镜检法，差异有统计学意义(P<0.001)。同时以MGIT960药敏检测为金标准，GeneXpert检测法的敏感度与特异度分别为92.3%和98.5%，差异有统计学意义(P<0.001)。以上研究结果与其他研究结果相符[12-13]。在涂片镜检阴性MGIT960液体培养阳性的41例样本中，GeneXpert检测阳性为35例，阳性检出率为85.4%，说明GeneXpert检测法对于结核病特别是涂阴结核病具有较高的检出率，临床应用价值较大。
GeneXpert为全球唯一的全自动一体化半巢式实时荧光定量PCR检测系统，该系统整合了基于定量PCR的分子遗传检测所需的三个步骤(样品准备、DNA扩增、检测)，除痰标本标本前处理外整个过程均在封闭的反应盒内进行，且全部检测过程仅需要2h，与MGIT960液体培养及药敏(4～6周)相比，大大缩短了检测时间，实现结核病和利福平耐药的快速检测。GeneXpert设计了2个质量控制点，样本质量控制和探针信号控制，前者监测DNA提取过程的正确性及检测样本对实时定量PCR的干扰性；后者则是检测探针的荧光信号监测PCR反应是否正常进行确保检测结果的稳定可靠。相对涂片、培养药敏等检测，GeneXpert检测对实验室生物安全要求较低，适合在各种级别的实验室内开展。
GeneXpert检测需要相应昂贵的仪器设备的支持，但是在中国全球基金结核病项目中,国家项目办为全国多家单位配备了此设备，范围覆盖至省、地市以及区县级实验室，这为GeneXpert检测法的推广运用提供了可能。总之，GeneXpert检测法敏感性高，特异性好，操作简便，检测时间短，为结核病的早期诊断和治疗提供了可能，值得在各级结核病实验室在条件许可的情况下推广应用。
【参考文献】
[1] 中华人民共和国卫生部.全国结核病耐药性基线调查报告(2007—2008年)[M].北京： 人民卫生出版社，2010： 27-39.
[2] 中国防痨协会临床专业委员会.结核病临床诊治进展年度报告(2013)(第一部分结核病临床诊断)[J].中国防痨杂志，2014，36(8)： 714-740.
[3] 全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组、全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室.2010 年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志，2012，34(8)： 485-508.
[4] HU Y， HOFFNER S， JIANG W， et al. Extensive transmission of isoniazid resistant M. tuberculosis and its association with increased multidrug-resistant TB in two rural counties of eastern China： a molecular epidemiological study[J]. BMC Infect Dis， 2010，10(43)： 1-8.
[5] 赵雁林，姜广路.痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册[M].北京： 中国协和医科大学出版社，2009.
[6] 中国防痨协会基础委员会.结核病实验室诊断技术培训教程[M].北京： 人民卫生出版社，2014： 12-36.
[7] World Health Organization. Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis： emergency update 2008[C]. Geneva： World Health Organization， 2008.
[8] BLAKEMORE R， STORY E， HELB D， et al. Evaluation of the analytical performance of the Xpert Mtb/RIF assay[J]. J Clin Microbio1， 2010，48(7)： 2495-2501.
[9] HELB D， JONES M， STORY E， et al. Rapid detection of Mlvcobacterim tuberculosis and rifampin resistance by use of on_demand， near patient technology[J]. J Clin Microbiol， 2010，48(1)： 229- 237.
[10] BOEHME C C， NABETA P， HILLEMANN D， et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance[J]. N Engl J Med， 2010，363(11)： 1005- 1015.
[11] World Health Organization. Rapid implementation of theXpert Mtb/RIF diagnostic test： technical and operational‘HOW to’， practical considerations[C]. Geneva： World HealthOrganization， 2011.
[12] 李辉，谭耀驹，李洪，等.利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术的诊断效果对比研究[J].中国防痨杂志，2014，36(6)： 472-476.
[13] 赵冰，欧喜超，夏辉，等.Xpert Mtb/RIF检测技术在结核病诊断中的应用评价[J].中国防痨杂志，2014，36(6)： 462-466.
Application of GeneXpert Mtb/RIF assay for diagnosis of drug-resistant tuberculosis
【Abstract】Objective To evaluate the application of GeneXpert MTB/RIF for clinical diagnosis of drug-resistant tuberculosis(TB). Methods Morning sputum samples from 240 TB inpatients were collected and tested with AFB smear， MGIT 960 system liquid culture and GeneXpert MTB/RIF. Drug susceptible testing(DST) was performed for samples with both positive MGIT960 liquid method and GeneXpert MTB/RIF assay. The liquid method was used as the gold standard to evaluate the sensitivity， specificity and the Kappa value for GeneXpert MTB/RIF assay. Results Among 224 valid samples， the positive detection rates were 26.8% for smear test， 45.1% for MGIT960 and 46.9% for GeneXpert MTB/RIF. With MGIT 960 liquid culture method as gold standard， the sensitivity and specificity of smear method were 59.4% and 75.0% while the sensitivity and specificity for GeneXpert MTB/RIF were 91.1% and 92.4% respectively. Compared with MGIT 960 DST testing， the concordance of GeneXpert MTB/RIF was 96.7%， with a sensitivity of 92.3% and a specificity of 98.5%. Conclusion GeneXpert Mtb/RIF is a rapid and effective method for diagnosis of drug-resistant TB cases.
【Key words】GeneXpert； tuberculosis； multidrug-resistant； rapid diagnosis
doi：10.16118/j.1008-0392.2017.02.022
收稿日期：2016-03-07
【中图分类号】R 521
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2017)02-0106-04