·基础研究·
【摘要】目的 分析隐匿性胆囊癌的病理学特点及P53、CEA和Ki67等在其鉴别诊断用的应用价值。方法 回顾性分析55例隐匿性胆囊癌的临床表现、巨检特征、组织学特点和预后等，分析肿瘤标志物P53，CEA和Ki67在鉴别诊断中的价值。结果 (1) 本组隐匿性胆囊癌55例，发生率为0.40%(55/15042)。男女比例2∶3，年龄34～85岁，中位年龄65岁。(2) 肉眼观，见胆囊增大，囊壁局限性增厚，平均厚度0.9cm;或呈囊状扩张，或与正常胆囊无明显差别，亦可见孤立性息肉样病变。所有胆囊均可见黏膜粗糙，31例患者伴有胆囊结石。镜下4例为乳头状管状腺瘤癌变，肿瘤与周围组织截然分界，6例为黏膜内癌伴微浸润，3例为黏膜内癌，肿瘤与周围组织有过度并可见胆道上皮内瘤变，10例为囊内乳头状肿瘤伴浸润性癌，其余32例为浸润性癌，其中普通型腺癌28例，黏液腺癌2例，鳞状细胞癌1例，印戒细胞癌1例。(3) 本组P53和CEA在不同类型的肿瘤中具有差异性表达。P53在38.7%(12/31)的胆囊浸润性腺癌中强表达，而在形成罗-阿窦的腺体表达阴性；CEA在61.3%(19/31)的胆囊浸润性腺癌中强表达，在周围正常黏膜上皮和罗-阿窦的腺体中表达阴性；同样Ki67增殖指数在浸润性癌中明显高于黏膜内癌和囊内乳头状肿瘤。(4) 本组50例获得随访资料，随访时间1～71个月，平均随访27.4个月，6例患者出现复发和肝脏转移，14例患者死亡，中位生存时间35.6个月。结论 隐匿性胆囊癌的发病率极低，好发于老年女性患者，绝大多数伴有胆囊结石。肉眼观病变局限，腺癌是最主要的组织学类型，其次为伴有浸润的囊内乳头状肿瘤。P53，CEA和Ki67有助于评判异型腺体的浸润深度和对鉴别肿瘤性腺体浸润、罗-阿窦形成和胆囊腺肌症有重要意义。大部分IGC临床分期较早，单纯手术切除能达到预期效果，TNM分期和高Ki67增殖指数是影响其预后的主要的因素。
【关键词】隐匿性癌； 囊内乳头状肿瘤； 乳头状肿瘤； 组织学； 免疫表型
胆囊癌是一种高度恶性肿瘤，其侵袭性强，易出现早期浸润和转移，预后差。肿瘤的组织学类型、浸润深度和局部侵袭以及远处转移是影响预后的重要因素[1-2]。而隐匿性胆囊癌(incidental gallbladder cancers， IGC)是指术前、术中均未获诊断，因良性病变行胆囊切除，术后病理证实为恶性。此类患者病程隐匿,约15%～30%的患者无明显临床症状，因胆囊良性病变偶然被发现，约占因胆石症而切除的胆囊患者的0.05%～2.9%[3-4]。IGC患者缺乏特征性的临床表现和特异性术前检查手段，而术中肉眼检查病灶无特征性，使术者常常与良性病变相混淆。本研究旨在分析IGC的临床病理特点、影像学检查特征和免疫表型以及预后因素，为提高IGC的认识以及后续治疗提供有价值的信息。
1.1 材料来源
2010年1月至2015年12月，同济大学附属东方医院腹腔镜手术切除的胆囊标本15042例，凡术前怀疑或术中证实的胆囊癌均排除在外，最终55例术后被诊断为隐匿性胆囊癌(IGC)，根据UICC胆囊TNM分期，其中0期(原位癌)3例，Ⅰ期20例，Ⅱ期22例，Ⅲ期10例。
1.2 方法
搜集患者的临床资料(性别、年龄、合并疾病、随访资料等)，分析患者影像学特点、大体表现及组织学特点。所有病例标本经中性福尔马林固定，2μm 切片，H-E染色。免疫组化EnVison法检测P53、CEA和Ki67的表达，所用抗体均为即用型单克隆抗体，购自福州迈新公司。患者进行电话随访，记录患者复发转移以及生存时间。患者生存时间从手术日开始计算，记录患者的死亡和随后一次随访时间，患者总体生存时间(overall survival， OS)是指从手术时间到因胆囊癌死亡时间或随后一次随访时间。
1.3 统计学处理
用软件SPSS 13.0进行统计分析，计数资料采用χ2检验，生存情况采用Kaplan-Meier生存分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 临床特点
55例IGC患者均出现上腹部隐痛，伴腹胀等症状，发病年龄34～85岁，中位年龄65岁，男性22例，女性33例，男女比例2∶3。本组患者均行腹腔镜下胆囊切除术。术前诊断： 慢性胆囊炎伴胆囊结石31例，胆囊息肉8例，胆总管结石5例，急性胆囊炎2例，慢性胆囊炎6例，胆管炎及胆源性胰腺炎3例。52例患者实验室肝脏功能检查在正常范围，有3例患者出现胆红素水平异常和ALT异常。
2.2 影像学特点
所有患者术前均行腹部B超检查，均提示有胆囊炎，10例胆囊大小正常，余45例胆囊壁轻度增厚，其中11例发现胆囊扩增，内壁毛糙，8例提示合并胆囊息肉。所有患者中31例伴有胆囊结石，5例合并有胆管结石，3例行薄层CT扫描发现胆囊壁不规则增厚，提示腺肌症可能。
2.3 病理学检查
本组患者均为单纯胆囊切除标本，发病部位： 胆囊颈部5例，体部33例，底部16例，1例为体低部弥漫性病变。肉眼观，16例胆囊大小较正常胆囊无明显异常，胆囊壁与正常胆囊类似；25例患者发现胆囊增大，囊壁厚薄不均，局限性增厚，胆囊壁厚0.6～1.8cm，平均厚度 0.9cm。增厚区范围大小不一，切面呈灰白色，质地韧。而4例大体表现为息肉样或菜花样隆起，不规则，边界不清，基底部宽，呈孤立性生长，或可呈乳头状，见图1A。10例可见胆囊呈囊性增大，扩张，黏膜粗糙，呈粗或细乳头状，浆膜面光滑。显微镜下观察，32例为浸润性癌，见图1B。其中普通型腺癌28例，黏液腺癌2例，印戒细胞癌1例，鳞状细胞癌1例；肿瘤浸润性生长，多数浸润肌层，易见神经侵犯，少数病例可见促纤维增生反应，肿瘤与周围黏膜截然分界。黏膜内癌为主，少部分为浸润性癌6例。单纯黏膜内癌3例，肿瘤局限于黏膜内，可呈头状生长，细胞复层化，极性紊乱，核拥挤，腺体异型性明显，并易见核分裂像，可累及正常腺体，部分病例突破基底膜，向黏膜下和浅表肌层浸润，促纤维增生反应不明显，胆囊颈管切缘均未见癌浸润。周围可见胆道上皮内瘤变(biliary intraepithelial neoplasia, BiIN)，伴有非典型增生，形成凸向囊腔的乳头结构,见图1C。非典型细胞表现为核浆比增大，极性消失，核染色质增粗等。乳头管状腺瘤癌变4例，肿瘤形成于幽门腺型腺体和肠型腺体，伴高级别上皮内瘤变，并出现浸润。囊内乳头状肿瘤伴浸润性癌10例，肿瘤细胞呈乳头状生长，可形成复杂的乳头结构(图1D)。但很少有微乳头结构，成于胆道型上皮，呈立方或矮柱状生长，亦或为肠型上皮，可见杯状细胞或潘氏细胞，细胞呈中-重度异型，核分裂像易见到。
图1 隐匿性胆囊癌的大体和组织学观察
Fig.1 The macroscope and histology of incidental gallbladder carcinoma
A： 胆囊管状腺瘤大体观，见局限性增生性病灶，基底较宽，表面呈粗乳头状；B： 浸润性腺癌，中分化，可见腺腔内坏死(H-E染色,×200)；C： 肿瘤周围黏膜呈乳头状增生，伴轻度异型性(H-E染色,×100)；D： 囊内乳头状肿瘤，上皮呈中-重度异型增生(H-E染色,×100)
2.4 免疫表型
P53在管状腺瘤中阳性率为75%(3/4)但表达较弱，在38.7%(12/31)浸润性腺癌中呈较强阳性表达，而囊内乳头状肿瘤中均为阴性或较弱表达，其差异具有统计学意义(χ2=11.447，P=0.010)。CEA的表达强度在不同类型的肿瘤中亦具有差异性，在腺瘤癌变的病例中CEA呈阴性或微弱表达、囊内乳头状肿瘤中仅有1例(3.2%)为较强阳性表达(χ2=14.743，P=0.002)，见表1。Ki67增殖指数在不同类型的肿瘤中仍具有差异性(χ2=15.916，P=0.0142)。同样，胆囊癌中的P53、CEA表达强度和Ki67增殖指数亦高于癌旁异型增生腺体和肌层罗阿窦腺体(图2)，差异有统计学意义。这对于鉴别肿瘤性腺体具有一定的意义。
表1 P53、CEA和Ki67在不同类型胆囊癌中的表达
Tab.1 Expression of P53,CEA and Ki67 in different types of IGC
项目浸润性腺癌伴微浸润的黏膜内癌伴浸润癌的ICPN腺瘤癌变P53阴性或弱表达199104高表达12000CEA阴性或弱表达12894高表达19110Ki67<10%406210%～50%10632>50%17310
2.5 随访
本组有4例患者进行二次扩大手术，随访1～71个月(平均27.4个月)，2例患者失访，失访率3.6%(2/55)，14例患者死亡，其中1例因非肿瘤因素死亡。中位生存时间35.6个月，3例患者因随访时间较短而无统计学意义。
图2 P53 和CEA及Ki67在胆囊癌和周围黏膜中的表达
Fig.2 The expression of P53, CEA and Ki67 in IGC and adjacent mucus
A： P53在肿瘤组织中弥漫性强阳性表达；B： P53在周围黏膜和R-A窦中不表达；C： Ki67在肿瘤组织中呈现高增殖状态；D： Ki67在正常腺体中增殖极低；E： CEA在肿瘤组织中呈强阳性表达；F： CEA在周围异型增生的上皮中弱至中度表达
胆囊癌是消化系统第六大常见恶性肿瘤，其侵袭性强，预后较差，目前约50%的胆囊癌是因胆囊炎或胆囊结石而被发现[5]，而隐匿性胆囊癌是由于缺乏有效的术前检查手段和指标，外观多数正常，在常规病理检查中偶然发现。对其组织学特征，免疫表型和影响预后的因素尚缺乏深入的认识。本组研究通过回顾性分析隐匿性胆囊癌的临床特点，形态学特征和免疫表型并分析其影响预后的因素，加强对该类疾病的认识，以便为临床的进一步诊治提供依据。
本组隐匿性胆囊癌的发病率为0.4%，低于其他亚洲国家的报道[6]而与欧洲国家的报道相近[7]。好发于老年人，女性较多，与经典的症状性胆囊癌类似，其临床表现不具有特异性，症状和体征常类似于慢性胆囊炎的患者，绝大多数患者表现为右上腹部疼痛。本组65.5%的患者伴有胆囊结石，Randi等[8]报道该组隐匿性胆囊癌患者约75%合并胆囊结石。IGC患者的术前尚缺乏有效的检查手段，Waghmare等[9]报道该组胆囊切除标本中，7例被证实为隐匿性胆囊癌，其中6例在超声影像检查发现胆囊壁增厚。同样，本组超声影像检查中81.8%(45/55)的患者发现胆囊壁不均匀增厚，回声略增强，部分并发息肉样病变，甚至胆囊腔扩张，对提示肿瘤可能具有一定的意义，但其表现不具有特征性。关于IGC的影像表现，尚需要大样本的研究分析。但经过流行病多中心的研究分析，有学者提出对于亚裔或亚非裔的老年女性患者，尤其是伴有碱性磷酸酶升高的患者，术中要充分检查需要排除胆囊癌的可能性[10]。然而国内尚缺乏类似的大规模研究。但本组的研究结果提示术中发现胆囊壁不均匀性增厚，质地偏硬时，建议送术中冰冻病理会诊，及时对患者进行有效的诊治。
胆囊癌最常见的组织学类型是腺癌，除了浸润性生长，IGC病变中较少出现促纤维增生反应，这可能也是临床症状不明显、分期较早的原因之一。然而在10例Ⅲ期病例中，均发现促纤维增生反应和坏死，提示该形态学特征与肿瘤预后的可能有关。1例乳头状腺癌的病例在部分区域见微乳头结构，虽然在隐匿性胆囊癌该组织特点的病理意义尚不明确，但参照肺、乳腺等部位，本研究认为有必要在病理报告中指出所占比例。而腺瘤癌变占本组病例0.73%，同样提示腺瘤在胆囊癌的发生作用甚微[11]。
与消化系统的食管和胃黏膜内癌相似的是，胆囊黏膜内癌同样局限于黏膜固有层，没有肌层侵犯，然而与其不同的是胆囊黏膜内癌多为平坦型增生性病变，在肿瘤周围可见其前驱病变，即BiIN,可见不同程度的异型上皮细胞复层排列，可形成凸向囊腔的小乳头状结构。BiIN3等同于黏膜内癌，肿瘤细胞表型可以为胆道型，肠型，胃小凹型，黏液型和幽门型。本组黏膜内癌中5例为胆道型上皮，2例为肠型上皮，1例为幽门型，因而提示胆囊癌的发生源于其前驱病变BilN，而仅有少数源于胆囊腺瘤。而胆囊囊内乳头状肿瘤(intracyctic papillary neoplasm, ICPN)在2010版WHO消化系统肿瘤中首次提出，是本组隐匿性胆囊癌的次要部分，ICPN同样被认为是胆囊癌浸润前病变，与胰腺导管内乳头状肿瘤和肝外胆道的导管内乳头状肿瘤具有类似的特征，肿瘤凸向囊内生长，形成乳头结构，单纯依靠影像学检查难以评价肿瘤的囊壁浸润，主要是依靠病理学检查。对于此类肿瘤病理应当充分取材，以评价有无浸润等情况，本组10例ICPN病理均发现浸润灶。
P53和CEA以及Ki67在上述三组肿瘤中表达具有差异性，P53和CEA的表达范围和强度明显高于周围正常黏膜以及BiIN，由于IGC中浸润性癌在肌层浸润较少伴有促纤维增生反应，两者的表达对于鉴别肿瘤性浸润和罗-阿窦具有重要意义。经典型腺癌中58.06%的病例Ki67增殖指数高于50%，而在黏膜内癌和伴有浸润的囊内乳头状肿瘤中，Ki67的增殖指数介于10%至50%。
本组患者进行1～71个月的随访，随访中6例患者出现肝脏转移，3例患者在术后5～7年并发胆管癌，有2例患者同时患有结肠癌。有学者提出胆道系统可同时出现多中心性癌[12]，因此对于隐匿性胆囊癌患者同时提醒临床要注意检测肝内外胆管、壶腹部、胰腺等部位是否有异常表现。
隐匿性胆囊癌总体临床分期较早，则预后较好，本组研究分析显示肿瘤的TNM分期和Ki67高增殖指数是影响肿瘤预后的主要因素，而年龄、肥胖、胆囊多发性息肉也可能是影响其预后的独立因素[13]。
本组39例患者在随访中无复发转移，提示此类病变行单纯胆囊切除术能达到外科治疗的目的。但是否需要二次手术进行胆囊床清扫、肝十二指肠韧带周围淋巴结清扫，有学者认为部分肝脏切除和肝门部淋巴结的清扫对于I期患者的远期预后收效甚微[14]。近期有学者指出，对于病理诊断隐匿性胆囊的患者有必要进行PEC-CT检查，评价胆囊周围和肝脏的边缘情况，有助于协助临床医生评价后续治疗的选择[15]。
随着腹腔镜技术的不断进步，经腹腔镜胆囊切除标本中隐匿性胆囊癌的检出率不断增加[16]，然而其发病率极低，国外有作者提出并非所有腹腔镜切除的胆囊都需要病理检查，可根据患者的危险因素，术中所见再进行必要的病理检查，以降低患者的医疗费用，避免不必要的医疗资源浪费[17-18]，然而本组研究结果提示隐匿性胆囊癌临床分期较早，预后好于经典的症状性胆囊癌，进行病理学检查不仅能发现此类病变，而且能发现黏膜内癌和BiIN等病变，对于肿瘤的早期诊断和患者的后续治疗有重要的临床意义。对于中老年女性，超声提示胆囊增大，囊状扩张，胆囊壁粗糙合并息肉病等患者，临床医生需要高度关注，因此推荐所有的胆囊切除标本都应当进行病理学检查，尤其对胆囊颈、体及底部充分取材，如是ICPN病例需要充分取材，避免对合并浸润性癌的漏诊，如同时发现胆囊颈体部肿大的淋巴结，也要充分取材，以便于后续的临床分期，以更好的为患者制定最佳的治疗方案。
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Clinicopathological features of incidental gallbladder carcinoma
【Abstract】Objective To analyze the clinical and pathological features in incidental gallbladder cancers. detected after laparoscopic cholecystectomy. Methods In 15042 laparoscopically resected samples, preoperatively undiagnosed gallbladder cancer was detected by pathological examination in 52 cases (0.40%). The clinical and pathological features of 52 cases of incidental gallbladder carcinoma (IGC) were retrospectively analyzed. The expressions of P53, CEA and Ki67 in tissue samples were detected by immunohistochemistry EnVison method. Results Among 52 IGC cases, the male to female ratio was 2∶3 and the mean age was 65 years (34 to 85). Macroscopically, the gallbladders were enlarged with focally thicken wall or dilated with cysts with an average thickness of 0.9cm; solitary polyp was also found; gallbladder stone was detected in 31 cases. Microscopically there were 4 cases of papillary-tubular adenoma with high grade intraepithelial neoplasm and focal invasive adenocarcinoma; 3 cases of intramucosal carcinoma and 6 cases of microinvasive adenocarcinoma with biliary intraepithelial neoplasia (BiIN) adjacent the tumor; 32 cases of invasive carcinoma including invasive adenocarcinoma, mucinous carcinoma, squamous cell carcinoma and signet ring cell carcinoma. P53 was expressed in 38.7% (12/31) invasive adenocarcinoma, while it was negative expressed in R-A glands. CEA was expressed in 61.3% (19/31) invasive adenocarcinoma, while it was negative expressed in R-A glands and the adjacent mucus. Ki67 index was higher in invasive adenocarcinoma than intramucous carcinoma and intracyctic papillary neoplasm (ICPN). Among 50 patients who were followed up for 1 to 71 months, 6 patients relapsed with liver metastasis, 14 patients died during the following up. The middle survival time was 35.6 months. TNM stage and high Ki67 index were prognostic factors. Conclusion IGC is rare, it is likely occurs in old-aged female with gallbladder stones. The lesion is often limited with thickness of the wall. Invasive adenocarcinoma is the major histology type followed by ICPN with invasive carcinoma. P53, CEA and Ki67 index are helpful in differential diagnosis in neoplastic glands and the R-A glands. Most of the IGC are in early TNM stage and the patients could receive curative treatment.
【Key words】incidental carcinomas；gallbladder carcinoma; intracyctic papillary neoplasm; histology; immunophenotype
doi：10.16118/j.1008-0392.2017.02.009
收稿日期：2016-08-17
【中图分类号】R 730.23
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2017)02-0045-06