表示，采用最小显著差检验法(least-significant difference，LSD)对组间差异进行检验，P<0.05为差异有统计学意义。·基础研究·
【摘要】目的 探讨低剂量X射线持续照射幼年SD大鼠后对其学习记忆能力的影响及相关机制。方法 24只幼年SD大鼠随机分为对照组(0d照射组，接受假照射)、7、14d照射组，于出生后第35天起，每天接受1.0mGy 的X射线照射。照射结束次日，Morris水迷宫测试各组大鼠的空间学习记忆能力，灌注取脑后H-E染色观察海马CA1区神经元形态，透射电镜观察海马CA1区超微结构的变化。结果 定位航行实验中，7、14d照射组逃避潜伏期均较对照组延长，14d照射组长于7d照射组(P<0.05)；空间探索实验中，对照组，7、14d照射组原站台象限停留时间分别为(66.66±8.83)、(44.57±8.77)、(29.74±5.47)s，组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)；对照组，7、14d照射组穿越原站台象限次数分别为(2.75±1.16)、(2.50±1.07)、(1.13±0.64)次，组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。H-E染色对照组、7d照射组海马CA1区神经元形态未见异常，14d照射组可见核固缩。透射电镜下14d照射组神经元核固缩，线粒体空泡变，7及14d照射组均见突触后膜致密物(postsynaptic density, PSD)增多、不均匀，突触间隙显示不清，14d照射组受损更为明显。结论 幼年SD大鼠连续接受一定低剂量的X射线照射可以损伤大鼠海马CA1区神经元结构的完整性，降低大鼠的学习记忆能力，随着受照射时间的增加，大鼠的学习记忆能力受损程度增加。
【关键词】低剂量电离辐射； 学习； 记忆； Morris水迷宫； 海马； 大鼠
幼年时期的大脑组织对射线非常敏感[1]。研究表明,大剂量及较大剂量电离辐射可以导致脑组织结构异常、发育延迟、智力低下等[2-3]。颅脑照射可以导致海马依赖性的认知损害[4]。随着社会发展，低剂量电离辐射对幼儿及儿童大脑的影响，尤其是对学习记忆的影响越来越受到关注。本研究建立幼年期受不同低剂量X射线照射的SD大鼠模型，通过Morris水迷宫测试大鼠的空间学习记忆能力，并通过海马CA1区神经元形态学改变及电子显微镜下超微结构的变化来解释可能的相关机制。
1.1 动物模型建立及分组
25d龄已断乳清洁级健康幼年Sprague-Dawley(SD)大鼠雌性12只，体质量(90±5)g，雄性12只，体质量(95±5)g，购于中国科学院上海动物所，合格证号SCXK(沪)2002-0010，饲养温度为(21±2)℃，昼夜周期为12h/12h，自由摄食及饮水。待幼鼠适应环境后，分别对雌、雄两笼进行随机分组，每组8只，雌雄比例1∶1，并于35d龄时每天接受1.0mGy低剂量X射线照射及假照射(对照组)，照射组分别连续照射7、14d，即7、14d照射组。照射结束后次日采取灌注法取脑组织。
1.2 照射条件
X射线发生仪采用荷兰公司的Philips Optimus Bucky Diagnist-1医用X射线发生仪，放射线检测及计量装置为上海超奇电子有限公司RM-2030 X-γ辐射仪。将幼年SD大鼠于自然体位(俯卧位)放在X射线管下方，靶源距60cm，采用小焦点照射，中心为大鼠头部，照射条件为电压200kV，电流100mA，曝光时间800ms；吸收剂量率1.25mGy/s。
1.3 Morris水迷宫检测
水迷宫训练程序[5]： 训练分为5d，每次分2个阶段进行，每次间隔至少1h。Morris水迷宫的测试主要包括2个部分： 定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验历时4d，记录每只大鼠90s内找到站台的时间，即逃避潜伏期变化；空间探索实验中记录大鼠180s内原站台象限停留时间，观察并记录大鼠穿越原站台次数。迷宫上方安置连接显示系统的摄像机，大鼠运动轨迹及测试结果的显示和处理均采用上海移数科技信息有限公司的动物行为学软件。
1.4 大鼠海马CA1区H-E染色
对SD大鼠给予2%戊巴比妥钠45mg/kg腹腔注射麻醉后，取仰卧位，打开胸腔，从左心室插入钝针头至升主动脉，剪开右心耳，同时快速灌注4℃肝素化生理盐水150ml以冲洗血液，再灌注4℃4%多聚甲醛固定液150ml。取全脑，修块，浸入4%多聚甲醛中固定。每只大鼠切片按相同间隔顺序取5张切片，进行海马CA1区H-E染色。组织于4%中性甲醛溶液中固定24h后，脱水、浸蜡、包埋、连续切片(4μm)、H-E染色，光学显微镜下观察海马CA1区锥体细胞形态学变化。
1.5 电子显微镜超微结构观察
1.5.1 取材与固定 1%戊巴比妥钠 40mg/kg 腹腔麻醉，开胸，经左心室进针至升主动脉，4℃ 150ml 生理盐水灌注冲洗血液，再灌注4℃ 2.5%戊二醛固定液150ml，取海马CA1区，浸入2.5%戊二醛固定 2h 后，修成大小不超过1mm×1mm×1mm 的组织块。振动切片机做冠状位切片，片厚50μm。显微镜下取海马CA1区切片修整。2.5%戊二醛后固定、送检。
1.5.2 电子显微镜检查 0.01mol/L PBS漂洗，每次5min，共3次；1%四氧化锇固定1h；梯度乙醇脱水；618环氧树脂包埋液浸透包埋，超薄切片，铀、铅双重染色，透射电镜(荷兰Philips公司)观察、拍片。
1.6 统计学处理
SPSS 18.0分析软件及Excel表进行单因素方差分析(ANONA)，计量资料采用 表示，采用最小显著差检验法(least-significant difference，LSD)对组间差异进行检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 定位航行实验中逃避潜伏期时间变化
所有实验组大鼠逃避潜伏期均随着游泳训练天数的增加呈现出不同程度的缩短趋势，7、14d照射组逃避潜伏期均长于对照组，7d照射组第1～4天逃避潜伏期均长于对照组，差异有统计学意义(F=12.469、73.433、28.728、98.082,P<0.05)，14d 照射组第1～4天逃避潜伏期均长于对照组，差异有统计学意义(F=73.463、414.400、64.371、315.558,P<0.05),其中，随着X射线照射天数的增加，逃避潜伏期逐渐延长，14d照射组第1～4天逃避潜伏期均长于7d照射组，差异有统计学意义(F=18.525、24.959、14.148、48.894,P<0.05)，见表1。
2.2 空间探索实验
7、14d照射组大鼠穿越原站台次数均较对照组不同程度减少，其中7d照射组与对照组相比较，差异有统计学意义(F=5.694,P<0.05)，随着照射天数的增加，大鼠穿越原站台次数逐渐减少，14d照射组穿越原站台次数少于7d照射组，差异有统计学意义(F=9.736,P<0.05)；7及 14d 照射组大鼠原站台象限停留时间均少于对照组，其中7d照射组与对照组相比较，差异有统计学意义(F=21.869,P<0.05)，随着照射天数的增加，大鼠原站台象限停留时间逐渐减少，14d照射组短于 7d 照射组，差异有统计学意义(F=19.988,P<0.05)，见表2。
表1 各组大鼠定位航行实验中逃避潜伏期变化
Tab.1 Changes in the place navigation test
组别n第1天第2天第3天第4天对照组876.34±2.6248.76±1.5516.71±1.307.99±0.617d照射组880.93±1.4858.29±2.7320.01±1.1411.34±0.7214d照射组884.45±2.5863.70±1.3822.66±1.6313.89±0.72F值13.97731.74890.408116.311P值<0.05<0.05<0.05<0.05
表2 各组大鼠空间探索实验结果
Tab.2 The results of the spatial probe test in three groups 
±s)
组别n原站台象限停留时间/s穿越原站台象限次数/次对照组866.66±8.832.75±1.167d照射组844.57±8.772.50±1.0714d照射组829.74±5.471.13±.064F值44.4516.313P值<0.05<0.05
2.3 大鼠海马CA1区光学显微镜下锥体细胞形态学观察
对照组与7d照射组海马CA1区H-E染色神经元显示清晰，形态、大小均正常，细胞排列整齐、紧密，14d照射组可见部分神经元核固缩，呈深染，见图1。
2.4 大鼠海马CA1区电学显微镜下超微结构变化
对照组突触结构完整，突触后膜致密物(postsynaptic density, PSD)均匀，未见异常增厚，突触间隙清晰、均匀(图2A箭头)，线粒体结构完整、嵴清晰，7d照射组可见部分突触结构受损，PSD不均匀，突触间隙模糊，14d照射组均可见突触形态受损，PSD明显不均匀增厚，呈絮凝状改变，突触间隙显示不清，同时可见神经元核固缩现象，线粒体肿胀，嵴减少，基质空泡变，见图2。
图1 三组大鼠海马CA1区锥体细胞的形态学
Fig.1 Morphology of pyramidal cells in hippocampal CA1 area (H-E，×400)
A： 对照组；B： 7d照射组；C： 14d照射组；对照组与7d照射组神经元形态、大小均未见异常，而14d照射组可见固缩的核，呈深染(箭头所指)
图2 大鼠海马CA1区透射电镜下超微结构
Fig.2 Changes in ultrastructure of pyramidal cells in hippocampal CA1 area via transmission electron microscopy
A： 对照组；突触结构完整，突触后膜致密物均匀，突触间隙清晰(箭头)；B： 14d照射组；突触结构不完整，突触后膜致密物明显增厚、不均匀(箭头)，突触间隙显示不清；C: 7d照射组；可见部分突触结构受损，突触后膜致密物不均匀(箭头)；D: 14d照射组；可见神经元核固缩(箭头)，线粒体肿胀，嵴减少，基质空泡变(箭头)；×46000
幼年期大脑尚未完全发育成熟，容易受到外界环境的影响。学习与记忆是2个相互联系的神经活动过程，海马与学习记忆功能密切相关，特别是海马CA1区[6-7]。Morris水迷宫是目前公认的测试大、小鼠空间学习记忆能力的工具[8-9]。突触与学习记忆密切相关，突触形态结构受损，会导致突触之间的传递效能降低，引起学习记忆功能障碍等。有研究[4]表明,放射性导致的认知损害通常表现为海马依赖性的认知损害。本实验中幼年SD大鼠连续受低剂量X射线照射后，在Morris水迷宫中均表现为学习记忆能力较对照组降低，并且随着照射天数的增加，学习记忆受损程度进行性增加，14d照射组学习记忆能力较7d照射组降低，透射电子显微镜下7d 照射组可见部分突触形态结构破坏，表现为PSD不均匀增多，随着受照射天数的增加，14d照射组均观察到突触形态结构破坏，表现为PSD明显不均匀增厚，呈絮凝状改变，突触间隙显示不清。研究表明PSD与突触可塑性关系密切，而突触可塑性是学习与记忆的重要分子机制，PSD对突触可塑性发挥着重要作用[10]，由此认为，在本实验条件下的X射线照射可以通过影响幼年大鼠发育中海马CA1区的突触结构，尤其是损伤了PSD，进而促使大鼠学习记忆能力降低，PSD受损程度随着受照射时间进行性增加，并且PSD受损程度与学习记忆能力降低呈一定的相关性。此外，射线可以导致海马区细胞凋亡[11]，研究表明，学习记忆能力的降低与神经元凋亡相关[12-13]。实验发现，随着照射天数的增加，14d照射组大鼠海马CA1区H-E染色出现核固缩，呈深染，电子显微镜下同时观察到神经元核固缩，线粒体空泡变，由此认为，此剂量X射线照射促使神经元退变，也是导致大鼠学习记忆能力降低的一个重要因素，并且X射线对幼鼠学习记忆能力的损伤具有一定的剂量-效应关系，随着照射天数的增加，对海马CA1区神经元损伤程度增加，表现为Morris水迷宫中学习记忆能力逐渐降低。
本研究发现，幼年SD大鼠连续受低剂量X射线照射后，通过损伤与学习记忆密切相关的海马CA1区神经元结构的完整性，破坏突触形态结构的完整性，尤其是PSD不均匀增厚，进而不同程度地损伤了大鼠的空间学习记忆能力，且这种损伤程度存在一定的剂量-效应关系。本实验为幼儿及儿童时期在临床诊疗过程中连续受低剂量X射线辐射可能对学习记忆的影响提供了一定的实验依据。
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Effect of low doses X-ray exposure on learning ability and memory in young rats
【Abstract】Objective To investigate the effect of low doses X-ray exposure on learning ability and memory in young rats. Methods Twenty four Sprague-Dawley rats aged 35 days were randomly divided into two irradiated groups and one control group with 8 rats in each group. The rats in 7d-and 14d irradiated groups received X-ray irradiation at a dose of 1.0mGy/d for 7 or 14 days, respectively; and the control group received sham radiation. Morris water maze was used to examine the ability of sapatial learning and memory. The morphology of neurons in hippocampal CA1 area was observed by H-E staining and the ultrastructure of CA1 area was observed by electron microscopy. Results All irradiated groups showed increased latencies compared with that of control group, 14d-irradiated group presented longer latencies compared with 7d-irradiated group (P <0.01). The time staying in the quadrant of the original platform in control group, 7d and 14d irradiated groups were (66.66±8.83), (44.57±8.77) and (29.74±5.47)s, respectively (P=0.000). The number of crossing the platform of control group, 7d and 14d-irradiated groups was (2.75±1.16), (2.50±1.07), (1.13±0.64) times, respectively (P<0.01). H-E staining showed degeneration of neurons at hippocampal CA1 area only in 14d irradiated group, not in control and 7d irradiated groups. There was damage of postsynaptic density (PSD) at hippocampal CA1 area in all X-ray irradiated groups, especially in 14d irradiated group. Mitochondria swell and ridge disappearance and pyknotic nuclei were observed in 14d irradiated group. Conclusion Low dose X-ray exposure nay damage structure and function in neurons of hippocampal CA1 and further decrease the learning ability and memory in young rats, and the damage is increased with the exposure time.
【Key words】low dose irradiation; learning; memory; Morris water maze; hippocampus; rat
doi：10.16118/j.1008-0392.2017.02.005
收稿日期：2016-10-12
基金项目：国家自然科学基金(81171297，81200934)；上海市科委医学引导项目(134119b2100)
【中图分类号】R741.05
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2017)02-0023-05