±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。·基础研究·
【摘要】目的 研究神经干细胞在不同强度电离辐射(ionizing radiation, IR)处理下的衰老表型变化，建立电离辐射诱导神经干细胞衰老的方法。方法 对成年鼠来源的神经干细胞进行不同剂量的连续多次电离辐射，细胞分为照射组(0Gy组)，低剂量连续辐照组(0.5Gy组)，中等剂量的隔代辐照组(2Gy组)，高剂量的每隔3代辐照组(8Gy组)，分别在短期处理和长期处理后，收集细胞样本，提取RNA，检测神经干细胞衰老相关基因(p16、Bmi1)的表达，并用Ki67免疫荧光染色检测细胞的增殖，用SA-β-Gal检测细胞的衰老状态。结果 在长期处理后，p16在0.5Gy、8Gy组细胞中有20倍的表达升高，在2Gy组细胞中有2倍的表达升高；Bmi1在3组细胞中表达都降低，并随着剂量增加降低幅度增加；Ki67免疫荧光染色结果显示3个处理组的细胞增殖速率都降低，但在长期处理后2Gy组细胞增殖加快；SA-β-Gal检测结果显示，0.5Gy组细胞衰老程度不变，8Gy组衰老加重，2Gy组衰老程度降低。结论 对 神经干细胞长期高剂量的每隔3代辐照处理可以诱导神经干细胞衰老，作为研究干细胞衰老的模型。
【关键词】神经干细胞； 电离辐射； 衰老； 模型; 小鼠
组织器官衰老和再生的细胞生物学基础可能是位于其中的组织干细胞的老化[1]。DNA损伤的积累以及DNA损伤修复效率的下降，常常伴随着氧化应激损伤和线粒体功能障碍，这通常被认为是导致细胞衰老的主要原因[2]。成体神经干细胞是成体神经再生的源泉，神经发生和再生能力的降低是造成脑组织衰老和功能紊乱的重要因素[3-5]。神经干细胞衰老的细胞和分子机制研究由于体内实验材料的缺乏和难获得性而一直停滞不前，成体神经干细胞对DNA损伤的应答以及对电离辐射的耐受研究也相对匮乏。本研究拟通过对神经干细胞进行不同强度的连续电离辐射，探究神经干细胞对电离辐射的应激反应，并建立一种基于电离辐射诱导的干细胞衰老模型。
1.1 神经干细胞细胞株与试剂
8周龄雄性C57BL/6小鼠神经干细胞由本实验室人员原代分离培养；DMEM/F12、GlutaMAX、青霉素-链霉素双抗、0.05% Trypsin-EDTA、B27购自美国Gibco公司；Matrigel购自美国BD公司；EGF、bFGF购自美国R&D公司；SA-β-gal染色试剂盒购自美国GeneMed公司；抗体Ki67购自美国Thermo公司； DAPI染色液购自中国国药试剂；二抗CF543购自美国Biotium公司；TRIzol购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.2 神经干细胞不同强度的电离辐射
将神经球消化成单细胞，接种在经Matrigel包被的6孔板，培养过夜，用X-射线生物辐照仪(同济大学转化医学高等研究院公共仪器平台)进行辐照，辐照剂量分为为0Gy(对照)、0.25Gy(30kV，1min)、0.5Gy(30kV，2min)、1Gy(70kV，1min)、2Gy(70kV，2min)、4Gy(70kV，4min)、8Gy(70kV，8min)和16Gy(70kV，16min)，辐照完成后继续培养，分别在3、9和24h观察细胞生长状态，用Nikon倒置显微镜拍摄白光照片。
1.3 荧光定量PCR检测基因表达
用TRIzol试剂提取各样本的总RNA，用反转录试剂盒反转录成cDNA，配制20μl PCR反应体系，每个样品设3个平行重复，并同步设立内参对照及阴性对照，置于Real-Time PCR仪中，按设定程序进行扩增，反应结束后收集数据，实验运用相对定量法进行设计、操作及分析，运用2-ΔΔCt法进行计算。ΔCt=目的基因Ct值-内参对照Ct值，-ΔΔCt=对照组ΔCt平均值-各样品ΔCt，2-ΔΔCt反映各样品相对对照组样品目的基因的相对表达水平。引物序列如下。p16上游引物： 5′-CGAACTCTTTCGGTCGTACCC-3′，下游引物： 5′-CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC-3′；Bmi1上游引物： 5′-CCAATGGCTCCAATGAAGACC-3′，下游引物： 5′-TTGCTGCTGGGCATCGTAAG-3′；GAPDH上游引物： 5′-TCCCACTCTTCCACCTTCGATGC-3′，下游引物： 5′-GGGTCTGGGATGGAAATTGTGAG-3′。
1.4 Ki67免疫荧光染色分析细胞增殖
将细胞接种经Matrigel包被的圆形盖玻片上，在设定的时间点，用4%PFA固定10min，0.25%Triton-X100透化20min，Ki67(1∶1000)4℃孵育过夜，二抗CF543(1∶500)室温孵育2h，DAPI复染10min，用Nikon倒置荧光显微镜采集照片。
1.5 SA-β-Gal染色分析细胞衰老
按照试剂盒提供的使用说明书，先用清理液润洗细胞1次，细胞固定液室温孵育5min，酸性液润洗2次，加染色液37℃避光孵育4h，在显微镜白光下观察结果，蓝色表示衰老细胞，并拍照统计。
1.6 统计学处理
实验数据应用GraphPad Prism 6.0统计学软件进行统计学分析，计量资料使用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 不同强度的电离辐射对神经干细胞生长的影响
对神经干细胞进行不同强度的电离辐射，辐射剂量分别为0(未辐射，对照组)、0.25、0.5、1、2、4、8和16Gy，辐射处理后计时为0h，观察处理后24h内细胞的生长状况，见图1。分析细胞的增殖曲线以及不同时间点的细胞数，发现0.25、0.5和1Gy的照射不影响细胞的生长，2Gy对细胞的增殖有一定的促进作用，4、8 和16Gy都明显抑制细胞增殖并引起细胞死亡，见图1、2。
图1 不同剂量电离辐射处理对神经干细胞生长状态的影响
Fig.1 Growth of neural stem cells under different IR dosage
图2 粒子辐射后神经干细胞在不同培养时间的细胞数比较
Fig.2 Cell number of neural stem cells under different IR dosage at different culture time与未照射组相比，**P<0.01；***P<0.001
2.2 不同强度的连续电离辐射对神经干细胞衰老相关基因表达的影响
2.2.1 不同强度连续电离辐射剂量和时间点的选取 根据上述细胞生长实验，选取低、中、高不同剂量进行连续照射，并在不同时间点收取细胞样本进行分析，实验设计见图3。对于低剂量(0.5Gy)，每次传代进行辐照，中等剂量(2Gy)隔代辐照，高剂量(8Gy)每传3代辐照1次。
图3 不同强度连续电离辐射剂量和时间点选取的实验设计
Fig.3 Experimental design of different IR dosage and time point
2.2.2 不同辐照处理后神经干细胞衰老相关基因的表达变化 检测不同时间点衰老相关基因p16、Bmi1的mRNA表达水平，qRT-PCR结果显示，未照射组(0Gy组)细胞经长期传代(P1、P5、P9、P17)，其p16、Bmi1的mRNA表达水平没有显著性变化，见图4。短期照射处理后(P1)，0.5Gy组和2Gy组相对于0Gy组的p16表达没有显著性变化，8Gy组增加至2倍，Bmi1的表达在0.5Gy组有略微的降低，2Gy 组和8Gy组没有显著性变化。在长期反复照射处理后(P17)，0.5Gy组和8Gy组p16都上升到23倍，2Gy组上升到2倍，Bmi1的表达在 0.5Gy 组降低了15%，2Gy组降低了30%，8Gy组降低了65%，见图5。
2.3 不同强度的连续电离辐射对神经干细胞增殖的影响
对各组连续辐射处理后(P17)的细胞进行Ki67免疫荧光染色，见图6。统计各种条件下Ki67阳性细胞的比例，结果显示相对于未处理组(0Gy组)，0.5Gy组和8Gy组的Ki67阳性细胞比例没有显著变化，2Gy组有显著增加，见图7。分析比较长期处理(P17)和短期处理(P1)的增殖细胞比例，发现3个处理组相对于未处理组的增殖速率都有明显的降低，2Gy组相对于0.5Gy组和8Gy组降低的幅度要小，见图7。
图4 未照射组(0Gy组)细胞不同传代下p16、Bmi1的mRNA表达水平
Fig.4 The p16 and Bmi1 mRNA expression level of non-IR treated cell group (0Gy group) under different passage
图5 p16和Bmi1在不同时间点的mRNA表达水平比较
Fig.5 The p16 and Bmi1 mRNA expression level of different cell groups under different time point与未照射(0Gy)组相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001
图6 不同组Ki67染色结果
Fig.6 Ki67 immunostaining results of different groups
蓝色代表DAPI，红色代表Ki67
图7 不同组Ki67阳性细胞率及增殖速率比较
Fig.7 Statistic results of Ki67 positive cells and cell prolife ration rate in differernt groups
2.4 不同强度的连续电离辐射对神经干细胞衰老的影响
对各组连续辐射处理的细胞(P17)进行细胞衰老检测，SA-β-Gal染色结果(图8)表明，相对于未照射组(16.86%±3.94%)，0.5Gy组的阳性细胞比例(20.18%±3.15%)没有显著性增加，2Gy 组的阳性率(10.16%±1.15%)相对减少，8Gy组(29.54%±3.42%)有显著增加，2Gy组和8Gy组与未照射组相比，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.001)。
图8 不同组SA-β-Gal染色结果及SA-β-Gal阳性细胞比例统计数据
Fig.8 SA-β-Gal staining results and statistic data of the percentage of SA-β-Gal positive cell of different groups
蓝色代表SA-β-Gal阳性
A: 未照射组；B: 0.5Gy组；C: 2Gy组； D: 8Gy组
目前对于衰老的主流观点认为，DNA损伤的积累造成组织干细胞基因组不稳定和基因表达的失衡，影响了组织干细胞的自我更新和分化能力，进而导致整体组织器官的稳态和修复能力下降，并最终导致机体的衰老[6-8]。DNA双链断裂(DNA double strand break， DSB)是最为严重的一种DNA损伤方式，其造成的因素包括生理的和病理的，其中电离辐射是病理因素中非常重要的一种[9]。研究发现，与衰老相关的DNA损伤(尤其是DNA双链断裂)在多种组织中累积，并且正是由于DNA损伤的累积导致了组织完整性的逐步丧失[10-12]。
成体神经干细胞是成体神经再生的源泉，对于成体大脑组织的稳态起着至关重要的作用。但是随着年龄的增长，成体神经干细胞却遭受增殖减缓和细胞衰老带来的影响，表现为细胞增殖能力降低、G0/G1细胞周期停滞增强、神经分化能力减弱[13-15]。这种神经发生和再生能力的降低是造成脑组织衰老和功能紊乱的重要因素[3-4]。
神经干细胞对电离辐射非常敏感，单剂量8Gy的电离辐射能够促使新生鼠长时间、进程性的神经发生的损坏[16]，单剂量10Gy的电离辐射就能造成小鼠长久的认知功能损坏[17]。一些体外实验也显示，神经干细胞在不同单剂量电离辐射处理后表现出DNA损伤增加、细胞周期停滞、分化能力降低以及细胞凋亡等[18-19]。
本研究首先对神经干细胞进行不同强度的电离辐射，观察照射后细胞的生长状况，发现低剂量不影响细胞的生长，中等剂量促进细胞增殖，而高剂量抑制细胞生长并造成细胞死亡。为了能够更准确地模拟体内情况，对细胞进行长期的连续照射，并进行基因表达分析、增殖分析和细胞衰老分析。结果显示，高剂量的连续照射能够明显促进细胞衰老，可能的原因是高剂量的照射造成细胞严重的DNA损伤进而促进细胞死亡，而存活的细胞是DNA损伤在一定程度上被修复了，未被修复的损伤累积下来最终导致细胞衰老。低剂量处理的细胞只是在衰老相关基因的表达上有一定的变化，增殖能力和细胞衰老程度都没有显著变化，分析其原因可能是低剂量照射造成的DNA损伤程度很低，细胞能够快速修复。经中等剂量处理的细胞表现出增殖加快，细胞衰老程度的降低，呈现出更为年轻的细胞状态，推测可能是DNA损伤被修复，并且细胞发生了累积突变，使得细胞呈现出癌化的状态。接下来的研究可以进一步深入到不同组细胞的DNA损伤修复的情况，从而确定细胞在不同处理条件下应答反应的机制。
本研究首先证实了前人的研究成果，并且通过连续电离辐射的处理，揭示了神经干细胞的差别应答，此外，建立了一种以诱导DNA损伤为基础的神经干细胞衰老的制备方法和模型，为抗衰老和神经衰老相关疾病的研究奠定基础。
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Establishment of ionizing radiation-induced neural stem cell aging model
【Abstract】Objective To study the aging phenotype of neural stem cells under different dosage of ionizing radiation (IR)and to establish a cellular aging model. Methods The neural stem cells derived from adult mouse were divided into four groups： control(0 group，untreated)，low dosage(0.5Gy group，IR=0.5Gy at every passage)，medium dosage(2Gy group，IR=2Gy at every other passage)and high dosage(8Gy group，IR=8Gy at every fourth passage). After short and long term passage，the cell samples were collected. The expression of aging related genes was detected with qRT-PCR，cell proliferation was determined with Ki67 immunostaining and cell senescense was examined with SA-β-Gal staining. Results After long term treatment，compared with 0 group the expression level of p16 mRNA was 20-folder increased in 0.5Gy and 8Gy group while only 2-folder rose in 2Gy group. Bmi1 was down regulated in all 3 groups and the extent of decrease was positively related to increased dosage. The Ki67 immunostaining results showed decreased cell proliferation rate in all 3 groups but more dividing cells in 2Gy group. SA-β-Gal staining reveled more severe senescense state in 8Gy group and unchanged state in 0.5Gy group while slightly improved condition of 2Gy group compared to 0 group. Conclusion Ionizing radiation at dosage of 8Gy at every fourth passage can induce cell aging of neural stem cells from young adult mouse, which may be used as a cellular aging model for further research.
【Key words】neural stem cell; ionizing radiation; aging; model; mice
doi：10.16118/j.1008-0392.2017.02.003
收稿日期：2016-06-19
基金项目：国家自然科学基金面上项目(31471029)
【中图分类号】Q 291
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2017)02-0011-06