图1 qPCR及流式检测TEM1在细胞系中的表达
Fig.1 TEM1 mRNA and protein expression in sarcoma and carcinoma cell lines
A: qPCR结果，肝脏的TEM1 mRNA表达设为1;B: 流式结果
·基础研究·
【摘要】目的 探讨靶向肿瘤内皮标记物1(tumor endothelial marker 1, TEM1)蛋白的细胞毒性物质皂草毒蛋白(Sap)对TEM1高表达的肉瘤细胞的杀伤作用。方法 流式细胞术检测肉瘤细胞SJSA-1、A673、SAOS-2、HOS、MES-SA、U2OS、SKUT-1、HT1080以及子宫腺癌细胞RL95-2、AN3CA、KLE中TEM1的表达水平；将TEM1抗体与细胞毒性物质Sap的复合物anti-TEM1-Sap以及未结合TEM1抗体的Sap按照浓度梯度作用于细胞，观察对细胞的杀伤作用；建立TEM1阳性的皮下肉瘤动物模型，当肿瘤长至100mm3时，将anti-TEM1-Sap与未结合T1M1抗体的Sap通过尾静脉注射至小鼠，观察两组肿瘤生长情况。结果 4种肉瘤细胞(SJSA-1、A673、HOS和MES-SA)的TEM1 mRNA和蛋白表达为阳性，4种肉瘤细胞HT1080、SAOS-2、U2OS、SKUT-1)和所有腺癌细胞(AN3CA、RL95-2、KLE)均为TEM1表达阴性。TEM1阳性的细胞中，低剂量的anti-TEM1-Sap(20～200nmol/L)能有效地杀死肉瘤细胞。在TEM1阳性的肉瘤动物模型中，抗体浓度为100nmol/L的anti-TEM1-Sap处理的小鼠与Sap单独处理的小鼠相比，其抑制肿瘤生长的作用显著增强(P<0.01)。结论 TEM1蛋白在多种肉瘤细胞系中高表达，靶向TEM1的细胞毒性物质比单独使用细胞毒性物质更能促进肉瘤细胞的凋亡，为肉瘤的诊断及精准治疗提供了新思路。
【关键词】肉瘤； 肿瘤内皮标记物1； 皂草毒蛋白； 免疫毒性
子宫肉瘤是生殖道肉瘤中最常见的一种，由中胚层发展而来，发病率低，占子宫恶性肿瘤的1%[1]。子宫肉瘤虽然罕见，但发病十分凶险[2]。WHO以及妇科肿瘤协会研究表明，子宫肉瘤的复发率在53%～71%[3]，且恶性程度高，易远处转移，对放疗及化疗皆不甚敏感，预后不佳[4]。近年研究显示，TEM1在结肠癌、乳腺癌以及间叶起源的肉瘤和黑色素瘤的肿瘤新生血管中高表达，高度浸润性脑胶质瘤以及转移性肿瘤中也能检测到TEM1[5]，且TEM1可能在肿瘤生成中起着重要的促进作用[6]。有研究表明[5]，肿瘤间质中表达的TEM1也可能与肿瘤细胞表面的转移相关蛋白Mac2 BP/90K 结合，通过双向调控，从而发挥促进肿瘤生长的作用。Kontsekova等[7]认为，TEM1与促/抑血管生成的信号因子以及ECM相关蛋白交叉反应，参与血管重塑，促进肿瘤生长[7]。本研究将TEM1作为肉瘤的靶向蛋白，将TEM1抗体与细胞毒性物质皂草毒蛋白(Sap)结合，形成免疫毒性物质TEM1-皂草毒蛋白素(anti-TEM1-Sap)，探讨其在子宫肉瘤中的靶向杀伤作用。
1.1 材料与仪器
Anti-TEM1抗体购自美国Abcam公司；Saporin(Sap)购自美国Advanced Targeting system；子宫肉瘤细胞MES-SA、SKUT-1、骨肉瘤细胞HOS、SJSA-1、A673、U-2OS、SAOS-2,纤维肉瘤细胞HT1080，子宫腺癌细胞AN3CA、RL95-2，KLE购自美国ATCC(American Type Culture Collection)细胞库；TRIzol、RNase-free DNase购自美国Invitrogen公司；高容量cDNA反转录试剂盒、实时荧光定量PCR系统 (ViiATM 7 real-time PCR System)购自美国应用生物系统公司；FACS canto购自美国BD公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 采用含10% FBS、100IU/ml青霉素及100μg/ml链霉素的RPMI 1640、EMEM或DMEM/F12培养基，于37℃、5% CO2、90%湿度的培养箱中培养，采用对数期生长的细胞。
1.2.2 总RNA提取 定量PCR(qPCR)法检测细胞中TEM1 mRNA的表达。TRIzol法提取细胞中总RNA，用高容量cDNA反转录试剂盒反转录成cDNA,具体步骤为： 每管中加入10×RT缓冲液 2μl，25×dNTP混合物0.8μl，10×RT引物 2μl，反转录酶1μl，RNase抑制剂1μl，H2O 3.2μl，每管总体系为 10μl，冰上混合，在混合物中加入RNA 1μg。反转录条件： 25℃ 10min，37℃ 120min，85℃ 5min，4℃ 维持，转录后的cDNA作为PCR扩增的模板。384孔板中按照以下比例配置每管： 2×master混合物5μl，20×引物 0.5μl，20×18S rRNA 0.5μl，双蒸水2μl，每孔中加入所对应的cDNA 2μl, 贴上封膜，2000r/min，离心半径17.8cm,离心 5min。反应条件如下： 95℃ 10min 多聚酶激活，95℃ 15s变性， 60℃ 1min退火及延长，共40个循环。TEM1的正向引物： 5′-GCAAGTGGCGAGCACCGCTGGCT-3′,反向引物： 5′-GGCAGGCGCCCTCGAAGCCA-3′。18S 探针作为内源性对照。阴性对照为腺癌细胞KLE及RL95-2。qPCR采用三复孔。
1.2.3 流式细胞术检测 数量为1×104的细胞经胰酶消化为细胞悬液，PBS洗涤2次，重悬于100μl的FACS缓冲液(PBS+0.5%FBS)中。将细胞与 1μl 的一抗TEM1抗体(1mg/ml)于冰上孵育 1h，FACS缓冲液洗3次，再与 1μl 二抗羊抗人IgG-APC(Jackson Immunoresearch, USA)冰上孵育30min，PBS洗3次，于FACS canto上样检测，用Flowjo软件分析数据。
1.2.4 Western印迹法 收集待检测细胞后冰上裂解缓冲液裂解15min，并加1.2μl(25×)蛋白酶抑制剂，15000r/min,离心半径17.8cm,离心 15min，取上清液。如为非还原性蛋白，将蛋白1∶1与2× Laemmli缓冲液混合，100℃加热5min；如为还原性蛋白，将含有950μl的2× Laemmli缓冲液与50μl的BME混合，再与样品蛋白1∶1的比例混合，100℃ 加热5min。预制胶中每孔加入蛋白分子标记物和30～50μl煮好的蛋白，设置电压100V 1h，停止电泳，打开盖子小心取出胶放置到甲醇活化后的PVDF膜上，PVDF膜预先用甲醇活化10s左右，冰上转膜；用1× TBST配制的5%牛奶作为封闭液，摇床上37℃封闭膜1h；用封闭液稀释一抗，摇床上37℃孵育抗体1h，用1× TBST洗膜 2～3 次，每次5～8min；用封闭液稀释二抗，摇床上 37℃ 孵育抗体30min，用1× TBST洗膜2～3次，每次 5～ 8min；用ECL处理膜后，暗室曝光。
1.2.5 Luciferase病毒感染肉瘤细胞 293T细胞培养于150ml 培养瓶中，每2～ 3d 换液1次，待60%～ 70%融合时可用于感染。感染之前3h换1次液。病毒包装： pCMV-dR8.91(2μg)，pMD2.G(2μg)，PHR-SIN based vector (3μg)室温下混合孵育15min。将混合液直接加到293T细胞培养基中，培养箱中孵育48h。将培养液吸出，12000r/min，离心半径17.8cm,离心5min，以去除死细胞和细胞碎片。将需要感染的细胞复苏于12孔板中(1×106～ 3×106/孔)，待80%～90%融合后感染。吸除培养基，PBS洗2次。每孔加入1ml病毒液和1ml 全培养基。48h后，荧光显微镜下初步观察感染效率。48～ 72h 后，可收集细胞，采用流式，Countess Ⅱ或者IVIS方式检测感染效率。消化细胞，细胞计数，每种细胞收集1×106重悬在 1ml PBS中，用200μm 的细胞滤器过滤成单细胞悬液。用流式仪对细胞进行DES-RED检测，分析阳性率，仅筛选表达阳性的细胞。将筛选后的细胞重新培养在培养瓶中，保种。
1.2.6 TEM1抗体与Sap的结合 TEM1抗体与Sap通过NHS-easter共价键方式进行结合，由Advanced Targeting System公司合成，通过Western 印迹法检测结合效率以及TEM1抗体与Sap的比例。
1.2.7 MTT检测细胞增殖活性 胰酶消化细胞，并用计数仪Countess Ⅱ计数。将细胞密度调至1×103/孔，铺于96孔板中，培养箱中过夜。Sap以及anti-TEM1-Sap从最高浓度180nmol/L 按照3倍梯度稀释，与细胞共孵育72h。PBS洗涤1次，加入100μl荧光素(0.3mg/ml)，BLI检测细胞活性。每个浓度设置3复孔。
1.2.8 子宫肉瘤细胞MES-SA皮下肿瘤模型的建立 4～6周的雌性裸鼠购自中国科学院上海实验动物中心，并在SPF级别动物房饲养。将裸鼠随机分成3组(每组8只)、PBS空白对照组、未结合Sap组、anti-TEM1-Sap组。将1×106 MES-SA细胞重悬在100μl PBS中，皮下注射于裸鼠右背侧部，在肉瘤细胞注射后的第1天及第8天，将100μl的PBS、anti-TEM1-Sap(200nmol/L)以及Sap(200nmol/L)经尾静脉注射至小鼠体内。用BLI监测肿瘤细胞的生长，用游标卡尺量肿瘤大小，按公式(L×W2)/2 (L： 长径,W： 短径)计算肿瘤体积。每3d测量1次，当肿瘤体积达到2000mm3终止观察，处死小鼠。
1.3 统计学处理
采用Graphpad Prism5进行数据统计与分析，组间计量资料的比较采用独立样本t检验或Two-way ANOVA，P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 肉瘤细胞及腺癌细胞中TEM1的表达
采用qPCR以及流式细胞术检测肿瘤细胞中TEM1 mRNA以及蛋白的表达。8种肉瘤细胞(骨肉瘤细胞SJSA-1、HOS、 SAOS-2、U2OS及A673，纤维肉瘤细胞HT-1080，子宫肉瘤细胞MES-SA、SKUT-1)中4种(SJSA-1、A673、HOS及MES-SA)的TEM1 mRNA和蛋白表达阳性，其中SJSA-1及A673表达最高，HOS及MES-SA表达稍低，其余均为阴性，见图1。
2.2 TEM1抗体与Sap的结合效率
通过Western印迹法检测TEM1抗体与Sap的结合效率。图2A显示，由于TEM1抗体与Sap由共价键相连且含有不同的连接比例，所以还原前的anti-TEM1-Sap呈不单一的几条带并且有明显拖尾，而还原后的TEM1抗体和Sap则呈现单一大小的条带。还原前的anti-TEM1-Sap用Sap-HRP检测后，主要呈现为210000、175000和150000处的条带，分别对应为一个TEM1抗体连接上3个、2个和1个Sap的大小，且175000的条带最亮，说明TEM1抗体： Sap的比例主要为1∶2；而还原后的anti-TEM1-Sap只剩下1条25000左右的条带，对应Sap的大小(30000)，说明经过还原剂处理以后，anti-TEM1-Sap之间的二硫键打开，Sap和TEM1抗体分离后为游离状态。结果显示，合成好的免疫毒素anti-TEM1-Sap中有三种成分： anti-TEM1-Sap、TEM1抗体和游离Sap，其中anti-TEM1-Sap占主要成分，且TEM1抗体与Sap的比例多为1∶2。游离的TEM1抗体和Sap的含量极其微小，说明合成的anti-TEM1-Sap纯度较好，适合后续的细胞和动物实验。
图1 qPCR及流式检测TEM1在细胞系中的表达
Fig.1 TEM1 mRNA and protein expression in sarcoma and carcinoma cell lines
A: qPCR结果，肝脏的TEM1 mRNA表达设为1;B: 流式结果
2.3 anti-TEM1-Sap对TEM1蛋白的结合能力
为验证结合了Sap的TEM1抗体不会影响其结合TEM1蛋白的能力，将TEM1抗体以及anti-TEM1-Sap分别与细胞中的TEM1蛋白结合。结果显示，与Sap的结合不会影响其结合TEM1蛋白的能力;在TEM1阴性的细胞中，也未观察到非特异性结合的增加，见图3。
2.4 anti-TEM1-Sap的细胞毒性作用
与未结合的Sap相比，anti-TEM1-Sap对TEM1阳性的肉瘤细胞SJSA-1、A673、HOS和MES-SA的细胞毒性均有明显增强，见图4A。而对于TEM1阴性的细胞SKUT-1，anti-TEM1-Sap与Sap的细胞毒性无明显区别。用两种色条的亮度分别表示这5种细胞TEM1 mRNA和蛋白的表达水平，anti-TEM1-Sap对细胞毒性的增强与TEM1的表达水平相关。
图2 还原和未还原TEM1抗体的电泳结果
Fig.2 Reducing and non-reducing TEM1 antibody on SDS PAGE
A： 未还原anti-TEM1-Sap；B: anti-TEM1-Sap还原后，TEM1抗体： Sap为1∶2
图3 流式检测TEM1抗体与Sap结合后，与细胞中TEM1蛋白的结合能力
Fig.3 TEM1 antibody affinity to TEM1 protein after conjugated to Sap
分析3种不同浓度药物的细胞毒性。在 2.2、6.67nmol/L的浓度下，anti-TEM1-Sap对于TEM1阳性细胞系的杀伤在63.9%(63.9%、85.8%)以上，比Sap的毒性高出20%以上。然而，TEM1阴性细胞SKUT-1对于两种药物的反应相差仅0～10.1%，且anti-TEM1-Sap的最高杀伤仅38%。在 20nmol/L 的药物浓度作用下，对SJSA-1的杀伤已接近饱和(87.9%)，而单纯Sap的杀伤仍处于17.9%～25.5%，与6.67nmol/L药物的杀伤(17.7%～20.4%)区别不大。其他三个TEM1阳性细胞在20nmol/L 药物作用下，anti-TEM1-Sap的细胞毒性均明显增强，A673为61.0%～70.9%，HOS为86.3%～90.7%，MES-SA为76.1%～76.2%。TEM1阴性细胞SKUT1的杀伤虽然也升高了10%～13%，但是anti-TEM1-Sap的最大杀伤仅53.3%，Sap最大杀伤41%,见图4B。
图4 anti-TEM1-Sap对肉瘤细胞的毒性作用
Fig.4 The cytotoxicity of anti-TEM1-Sap
A： 梯度稀释的(0～180nmol/L)anti-TEM1-Sap处理肉瘤细胞 72h 后BLI检测Bmax;B: 五种细胞在2.2、6.67nmol/L处杀伤效果
2.5 在子宫肉瘤动物模型中检测TEM1
将小鼠按照治疗方式分为3组： Sap、anti-TEM1-Sap及PBS空白对照组，于肿瘤建立的第1天和第8天2次尾静脉给药(200nmol/L)。BLI结果显示，与空白组相比，Sap组和anti-TEM1-Sap组肿瘤生长受到明显抑制(P<0.01,P<0.0001)，TEM-Sap比未结合的Sap对肿瘤的抑制更加明显(P<0.01)；肿瘤Sap组和anti-TEM1-Sap组的肿瘤生长速度比空白组减慢(P<0.01、P<0.0001)，与Sap组相比，TEM-Sap组的肿瘤生长更为缓慢(P<0.01)。
MES-SA细胞建立肉瘤动物模型，肿瘤接种后第2天给药1次，1周后重复给药1次，在28d的观察过程中，anti-TEM1-Sap组的肿瘤在生长速度明显慢于Sap组，见图5A，且体积上比Sap组小(P<0.01)，见图5B；anti-TEM1-Sap及未结合Sap处理后的肿瘤生长速度和体积均小于PBS对照组(P<0.0001，P<0.01)。结果说明Sap对肉瘤细胞有杀伤作用，而TEM1的靶向作用能够增强其Sap毒性，增加杀伤效率。
图5 未结合Sap以及anti-TEM1-Sap对肿瘤
生长的抑制作用
Fig.5 The effect of tumor growth inhibition of anti-TEM1-Sap compared with free Sap
A: 荧光素酶信号;B： 肿瘤体积
本研究主要目的是验证以抗体为基础的免疫毒素TEM1抗体-Sap(anti-TEM1-Sap)能够在体内和体外有效杀伤TEM1阳性的肿瘤细胞，是一种具有重要临床价值的靶向药物体系。
在10种肿瘤细胞中检测了TEM1 mRNA和蛋白的表达，4种肉瘤细胞SJSA-1、A673、HOS和MES-SA的TEM1 mRNA和蛋白为阳性，3个肉瘤细胞HT10801，SAOS-2和U2OS和所有腺癌细胞均为TEM1阴性，且4种阳性细胞中TEM1的蛋白和mRNA的表达水平具有明显相关性(r=0.7914)。
本研究采用了一种具有有效线粒体失活能力的蛋白，Sap来合成ADC(antibody-drug conjugate)进行免疫治疗。Sap从植物中提取，在各种免疫治疗中得到广泛的研究和运用[8]，是一种很有潜在临床价值的毒素[9]。本研究中，Sap和TEM1抗体通过共价键NHS-easter的方式连接，从Western印迹法结果得知，免疫毒素anti-TEM1-Sap中有三种成分： anti-TEM1，TEM1抗体和Sap，其中主要成分为anti-TEM1-Sap。Sap与TEM1抗体主要的结合比例为 2∶1。另外，通过流式分析比较了TEM1抗体和anti-TEM1-Sap对于TEM1阳性和阴性肿瘤细胞的结合能力。流式结果显示，在TEM1阳性的细胞系中，anti-TEM1-Sap与TEM1具有相同的结合能力，而在阴性细胞中，anti-TEM1-Sap与TEM1抗体一样不会与细胞结合，也未接测出非特异性的结合。说明TEM1抗体与Sap的结合不会影响其与TEM1蛋白的结合能力。
本实验结果说明，TEM1阳性的细胞对anti-TEM1-Sap的敏感性相对于Sap明显增强。anti-TEM1-Sap在低剂量情况下就能有效杀伤SJSA-1，并且在20nmol/L时已经接近饱和；而单药Sap即使在180nmol/L时仍只有23.2%～28.4%的杀伤。已知SJSA-1表达TEM1的水平在所有研究的肿瘤细胞中表达最高，说明非特异性的杀伤很少，anti-TEM1-Sap介导的靶向TEM1的特异性细胞杀伤占据主要作用。Sap对于A673和MES-SA细胞有明显的非特异性杀伤作用，但在极低浓度2.2nmol/L时，Sap本身的杀伤分别达到了34.0%～33.3% 和37.7%～41.4%。HOS表达TEM1水平较低，其对anti-TEM1-Sap敏感性一定程度上依赖药物的浓度。值得注意的是，TEM1阴性的细胞SKUT-1在Sap高剂量情况下(180nmol/L)的杀伤也能达到45.6%～59%，说明除了TEM1 antibody介导的细胞杀伤之外，其他因素例如药代动力学、细胞内药物的释放和细胞对药物的敏感性等，均可影响Sap对细胞的杀伤作用。
在子宫肉瘤动物模型中，anti-TEM1-Sap治疗组对子宫肉瘤生长有明显的抑制作用，Sap对肉瘤细胞有杀伤，而TEM1的靶向作用能够增强其Sap的毒性，增加杀伤效率。
TEM1的表达与肿瘤恶性程度相关。虽然目前TEM1的生物功能和致癌机制的研究并不完全清楚，但我们的研究表明TEM1广泛存在于肉瘤患者的病变组织中，并且，从体内体外模型充分验证了靶向TEM1的治疗具有潜在的临床治疗意义和诊断价值，为今后肉瘤及其他肿瘤的诊断和药物研发提供了新的思路。
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TEM1 antibody-conjugated Sap inhibits TEM1-positive human sarcoma cells in vitro and in vivo
【Abstract】Objective To investigate the inhibitory effect of tumor endothelial marker 1 (TEM1) antibody-conjungated Sap on human sarcoma cellsin vitro and in vivo. Methods Cytotoxic agent Sap was chemically conjugated to TEM1-antibody (anti-TEM1-Sap). The expression of TEM1 was detected by qPCR and flow cytomety in uterine sarcoma MES-SA, SKUT-1 cells, osteosarcoma HOS, SJSA-1, A673, U2OS, SAOS-2 cells, human fibrosacoma HT1080 cells and uterine carcinoma AN3CA, RL95-2 and KLE cells. Human uterine sarcoma MES-SA cells were subcutaneous inoculated in nude mice. The tumor bearing mice were injected with anti-TEM1-Sap, and its inhibitory effect was analyzed. Results TEM was highly expressed in SJSA-1, A673, MES-SA and HOS cells. Anti-TEM1-Sap at dose of 100nmol/L significantly inhibited the tumor growth in uterine sarcoma-bearing nude mice. Conclusion TEM1-targeted immunotoxin can effectively inhibit TEM1-positive sarcoma in vitro and in vivo, which may have the potential for clinical application.
【Key words】sarcoma; tumor endothelicial marker; Sap; immunotoxin
doi：10.16118/j.1008-0392.2017.02.002
收稿日期：2016-08-18
基金项目：国家自然科学基金(8110197)
【中图分类号】R 737.33
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2017)02-0005-06