·基础研究·
【摘要】目的 研究低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)对骨骼肌发育及肌纤维分型的影响。方法 将HIFflox/-转基因小鼠和骨骼肌环化重组酶(muscle creatine kinase-cyclization recombination enzyme, MCK-Cre)转基因小鼠交配，子代中获得HIFflox/- Cre+小鼠互交，得到骨骼肌HIF-1α条件性敲降的HIFflox/floxCre+基因型小鼠(C57BL/6J)，取新生小鼠尾尖与骨骼肌组织鉴定基因型及敲降效率。随机选取HIF-1α敲降小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)各10只，取颏舌肌组织总RNA，使用荧光定量PCR检测4种肌纤维类型(Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx)在不同基因型小鼠骨骼肌中的表达差异。结果 HIF-1α在基因敲除小鼠(KO)的骨骼肌中的表达量较野生型小鼠(WT)有明显降低(P<0.05)。相对于野生型小鼠(WT)，基因敲除小鼠(KO)颏舌肌的Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx型肌纤维表达量有降低趋势，而Ⅱb型纤维表达量有升高趋势。结论 Cre-loxP系统成功构建骨骼肌特异性敲除HIF-1α的转基因小鼠模型。HIF-1α在成肌分化过程中能够促进肌纤维Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx分化，抑制Ⅱb纤维分化。
【关键词】低氧诱导因子-1α； 条件性基因敲除； 骨骼肌纤维; 小鼠
低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)是一种异源二聚体，具有氧依赖的转录活性核蛋白，广泛表达于哺乳动物的各种组织细胞中，由α和β两个亚基组成，α亚基可在低氧环境下被激活，β亚基属于构建型表达[1]。目前已知受HIF-1调控的靶基因有100余种，包括糖酵解酶、促红细胞生成素、诱导型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子等，这些基因涉及能量代谢、红细胞生成、血管发生、细胞凋亡等多个方面，在细胞和机体的病理生理反应中起到关键作用[2]。骨骼肌纤维是一种多核细胞，核的数量随肌纤维的长短而异。Guth等[3]提出肌蛋白酶组化分类法，将骨骼肌纤维分为Ⅰ型纤维、Ⅱa型纤维和Ⅱb型纤维。Ⅰ型纤维又称红肌纤维、慢缩肌纤维、慢氧化纤维，Ⅰ型肌纤维直径细，肌浆丰富，肌红蛋白含量高。肌浆中线粒体直径大，数量多，周围毛细血管网发达。支配Ⅰ型纤维的神经元是脊髓前角的小运动神经元，传导速度慢。肌红蛋白横桥少，收缩力量小。Ⅰ型纤维有氧代谢酶活性高，线粒体数量多，体积大，线粒体蛋白含量高，抗疲劳能力高于Ⅱ型纤维。近年来，有研究证明不同的肌纤维类型中的HIF-1α表达量也有所不同。Pisani等[4]在小鼠腓肠肌和比目鱼肌中发现慢肌纤维(Ⅰ型纤维)中的HIF-1α含量明显高于快肌纤维(Ⅱ型纤维)，相反肌红蛋白的含量处在较高的水平，使慢肌纤维能够更好地耐受低氧环境，提示HIF-1α可能参与调控肌纤维分化的过程。本研究旨在通过建立HIF-1α敲降小鼠(KO)模型研究在骨骼肌内条件性敲除HIF-1α基因后肌纤维的分型变化，以评价HIF-1α在成肌分化过程中的作用。
1.1 主要试剂与仪器
鼠尾基因试剂盒购自上海思睿生物公司；SYBR Green试剂盒购自日本TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物公司合成；异丙醇、氯仿、无水乙醇购自上海国药集团；7500 RT-PCR仪购自美国应用生物系统公司；超速离心机购自美国Beckman公司。
1.2 方法
1.2.1 HIF-1α条件性基因敲除小鼠 ES细胞来源于C57BL/6J小鼠，由上海南方模式生物研究中心建系并保存。运用ET克隆的方法构建HIF-1α基因第5外显子两侧插入loxp位点的条件性剔除载体，DNA电穿孔转移至ES细胞，正负药物筛选，同源重组克隆的PCR鉴定，将ES细胞的囊胚注射至胚胎，移植到2.5d假孕母鼠子宫中，饲养于SPF级动物房，正常给予饮食和饮水。将HIFflox/-转基因小鼠和Cre转基因小鼠交配，利用Cre特异性识别插入基因位点的载体实现骨骼肌的条件性敲除。实验动物的操作符合《实验动物管理条例》的要求。
1.2.2 基因型鉴定 将HIFflox/-小鼠与和Cre+小鼠公母交配，然后将子代筛选得的HIFflox/- Cre+小鼠互交，最终获得HIFflox/floxCre+基因型小鼠，以其为实验组，野生型小鼠(WT)为对照组。每笼1只公鼠、2只母鼠，10～14d 后观察母鼠腹部，腹部隆起即为怀孕，将孕鼠单独分笼饲养。15d后孕鼠生产，小鼠出生10～14d剪尾，用DNA抽提缓冲液提取鼠尾DNA，PCR鉴定基因型。
1.2.3 敲降效率鉴定 取1月龄小鼠颏舌肌，剪碎后放入预冷的匀浆机中，用TRIzol试剂提取总RNA，逆转录后进行荧光定量PCR反应。HIF-1α引物序列如下。上游引物： 5′-GACAATAGCTTCGCAGAATGC-3′,下游5′TCGTAACTGGTCAGCTGTGG-3′。PCR反应参数： 95° 30s；95° 5s，58° 34s，45个循环。取不同小鼠颏舌肌总RNA重复3次。PCR检测以β-actin 为内参，基因相对表达量采用2-△△CT的方法计算。
1.2.4 肌纤维类型检测 提取RNA步骤及荧光定量PCR检测方法同上，引物序列见表1。
表1 PCR引物序列
Tab.1 Primer sequence of PCR
基因上游引物(5'-3')下游引物(5'-3')β-ActinCGTGAAAAGATGACCCAGATCACACAGCCTGGATGGCTACGTMyHC-ⅠGCCTGGGCTTACCTCTCTATCACCTTCTCAGACTTCCGCAGGAAMyHC-ⅡaCCCGAAAACGGCCATCTTGAGTTCAGCAGTCATGAGMyHC-ⅡbGTCCTGGCCTCTGAGAGCATTGCTGAAGGACACACAGCTGCACCTMyHC-ⅡxGGCTGCGGGCTATTGGTTCTAAAGGCAGGCTCTCTCACTGGGCTG
1.2.5 肌纤维ATP酶染色 取10周龄实验组小鼠颏舌肌组织2mm×2mm×2mm于多聚甲醛固定液中固定10min，4℃，OCT包埋，置于-20℃恒温冷冻切片机切片。切片厚度8～10μm，自然风干30min备用。酸性孵育液配置： 0.1mol/L巴比妥钠2ml，0.2mol/L乙酸21ml，调pH至4.35。碱性孵育液配置： 0.1mol/L巴比妥钠水溶液2ml，蒸馏水10ml，NaOH调pH至10.4。ATP酶孵育液配置： ATP二钠盐20mg，氯化钙缓冲液10ml，调节pH至9.35。室温下切片入酸性孵育液10min，后入碱性孵育液10min，清水洗净后入ATP酶孵育液45min。依次入2%氯化钴与2%硫化铵2min，流水洗净后脱水、透明、封片。光学显微镜观察切片。
1.3 统计学处理
采用SPSS 20.0软件对所有实验数据进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 HIF-1α敲除小鼠鼠尾基因型鉴定
琼脂糖凝胶电泳显示HIFflox/flox基因型可见 308bp 条带，HIFflox/-可见两条条带，分别是198bp条带和308bp条带，野生型可见198bp条带；Cre+基因型可见500bp条带，见图1。
图1 鼠尾基因型鉴定
Fig.1 Gene identification of mice tail
A： 鼠尾HIFflox/-基因型鉴定；B： 鼠尾Cre基因型鉴定
2.2 HIF-1α敲除小鼠组织学鉴定
3次试验结果取平均值，各组小鼠颏舌肌HIF-1α 的mRNA相对表达情况相较于WT组小鼠，KO组骨骼肌肌纤维中HIF-1α表达量显著降低(P<0.05)。结果表明，通过Cre-loxP系统能成功构建骨骼肌特异性敲除HIF-1α的转基因小鼠模型，且获得的转基因子代小鼠无明显表型异常。
2.3 肌纤维类型检测
HIF-1α骨骼肌条件性敲除后，以WT组小鼠mRNA表达为1，同窝小鼠中KO组颏舌肌的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱa、MHC-Ⅱx型肌纤维mRNA相对表达量明显低于WT组(分别为0.66789、0.80458、0.49183)；MHC-Ⅱb型肌纤维mRNA相对表达量(1.7106)则高于WT组，差异有统计学意义(P<0.05)。
2.4 肌纤维类型分布
骨骼肌条件性敲除HIF-1α颏舌肌肌纤维类型ATP酶染色结果如图2。染色结果显示，相较于WT组，KO组的Ⅱb型肌纤维含量显著升高。
图2 HIF-1α敲除后肌纤维类型ATPase染色
Fig.2 ATPase staining for muscle fiber phenotype
A： 野生型小鼠(WT)；B： 条件性敲除小鼠(KO)；黑色是Ⅰ型肌纤维，浅白色是Ⅱa型肌纤维，深灰色是Ⅱb型肌纤维
HIF-1是介导哺乳动物体内缺氧缺血等反应的重要转录因子，具有广泛的靶基因谱，对胚胎发育有着重要影响。近年来正在不断开展利用转基因技术研究HIF-1α在机体生理及病理过程中的作用机制。常规敲除HIF-1α基因会导致动物在胚胎发育早期死亡[5-6]，无法进一步研究动物成年后HIF-1α在机体病理生理反应中的作用。相较于常规敲除，条件性基因敲除可以在模型动物特定的肌组织上敲除HIF-1α基因，能很好地避免完全敲除HIF-1α基因对其正常机体功能产生的不利影响，减少实验干扰，提高动物存活率，成功获得HIF-1α表达降低的动物模型。Cre/LoxP系统是目前最常用的条件性敲除工具[7]，通过构建HIF-1α floxed小鼠，与特定组织的Cre转基因工具鼠交配，产生的特定基因型子代即为条件性基因敲除小鼠。Cre蛋白能特异性地识别LoxP位点并剔除，达到剪切插入端之间的DNA序列。本实验在HIF-1α Exon5的两端插入同向LoxP序列，成功构建了HIF-1α floxed小鼠，并与骨骼肌中特异性表达Cre的小鼠自交繁殖，经过鼠尾基因型鉴定及PT-PCR测定敲除基因的表达量，最终获得了在骨骼肌中特异性敲除HIF-1α的条件性敲除小鼠，成功奠定了后续动物实验的基础。
本课题组前期研究证实在骨骼肌成肌细胞中沉默HIF-1α后，成肌分化调节因子MYOD与成肌蛋白(myogenin)的表达量有所下降，而MYOD与myogenin决定着前体成肌细胞的后续分化和终末分化，与最终形成肌纤维的类型密切相关，提示HIF-1α可能通过调节成肌分化因子来影响骨骼肌肌纤维类型。Ono等[8]发现HIF-1α能促进小鼠C2C12成肌细胞的分化，Scheerer等[9]的研究也表明，在成肌细胞中沉默HIF-1α基因会滞后细胞的增殖。本实验在细胞生物学实验的基础上应用了HIF-1α条件性敲除小鼠动物模型，结果显示骨骼肌中Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx型肌纤维呈下降趋势，Ⅱb型纤维则呈上升趋势。在HIF-1α敲除小鼠的骨骼肌中，主要以糖酵解为代谢特征的Ⅱb型纤维含量升高，其他以氧化或两者兼并为主要代谢特征的肌纤维含量下降，说明HIF-1α能增加骨骼肌中慢肌纤维的比例，使肌肉在低氧或长时间伸缩运动下保持较好的耐力，不易疲劳，证实了HIF-1α在成肌分化及肌纤维分型中起到了关键的作用。有研究表明，HIF-1α在低氧环境下能与TGF-1β共同作用从而改变骨骼肌纤维的比例[10]，其作用的机制及目标通路仍需进一步研究及讨论。
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Effect of HIF-1α on muscle fiber differentiation in mice
【Abstract】Objective To investigate the biological effects of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) on skeletal muscle differentiation with conditional knockout mice. Methods HIFflox/floxCre+ gene type were obtained by inbreeding HIFflox/- transgenic mice and muscle creatine kinase-cyclization recombination enzyme(MCK-Cre) transgenic mice. The expression of HIF-1α in skeletal muscle was identified by Real-Time PCR methods. Ten mice were randomly selected from each group of the mice named KO and WT. The expressions of muscle fiber type Ⅰ,Ⅱa,Ⅱb andⅡx were detected by real-time PCR. Results Compared with WT mice, the expression of HIF-1α in KO mice was significantly reduced (P<0.05). In KO mice, there was a slight decrease inⅠ,Ⅱa,Ⅱx fiber types but an increase inⅡb fiber type. Conclusion The HIF-1α conditional knockout mice model has been successfully established from Cre-loxP system. HIF-1α can enhance typesⅠ, Ⅱa and Ⅱx fiber generation during the process of myogenic differentiation and suppresse Ⅱb fiber generation.
【Key words】HIF-1α; conditional gene knock-out mice; skeletal muscle fiber； mice
doi：10.16118/j.1008-0392.2017.02.001
收稿日期：2017-01-20
基金项目：国家自然科学基金(81271192)
【中图分类号】R322.3
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2017)02-0001-04