图1 HUVECs细胞划痕图
Fig.1 Scarification test of HUVECs
·基础研究·
【摘要】目的 观察糖化低密度脂蛋白(gly-LDL)对人血管内皮细胞生长及抗氧化相关因子的影响，探讨糖尿病患者血管内皮损伤与gly-LDL的相关性及可能机制。方法 用完全培养基及不同浓度(G1组 0.06mg/L, G2组0.12mg/L, G3组0.24mg/L)的gly-LDL处理人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)24h、48h及72h，设对照组(Ctr)，取细胞培养上清液检测SOD和MDA水平，同时用细胞划痕实验观察gly-LDL对内皮细胞迁移功能的影响，用实时半定量PCR(realtime quantitative PCR，RT-qPCR)方法测定Mn-SOD和eNOS的mRNA的表达情况。结果 与 对照组相比不同浓度的gly-LDL均可抑制血管内皮细胞的迁移功能。较低或较高浓度的gly-LDL作用于人脐静脉内皮细胞时，随时间的增加SOD的活性及MDA的含量是升高的；中间浓度的gly-LDL作用于人脐静脉内皮细胞时，随时间的增加SOD活性是逐渐下降的，MDA含量是先增高后降低的。各组Mn-SOD的mRNA表达水平48h和72h均下调，eNOS的表达水平于24h和48h均下调，72h时上调。结论 Gly-LDL与糖尿病患者血管并发症可能存在一定的相关性，但不能肯定其是恶化因素之一。
【关键词】糖基化； 低密度脂蛋白； 人脐静脉血管内皮细胞； 超氧化物歧化酶； 丙二醛
脂代谢紊乱尤其是低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)含量升高与心血管病变密切相关，修饰后LDL与心血管病变的相关性研究正逐渐增多，糖化LDL(glycated low density lipoprotein, gly-LDL)作为糖尿病的生化指标之一，是晚期糖化终末产物(Advanced glycation end-products， AGEs)的重要组成部分，在糖尿病患者并发症发生中起到了重要作用，多数研究表明AGEs与血管内皮损伤密切相关[1-2]，可引起内皮炎症反应，加速糖尿病血管粥样硬化的进程，但具体机制尚未完全明确。临床上已经对部分糖尿病患者采取了抗氧化治疗，取得了一定的疗效[3]，大部分研究也提示氧化应激在血管病变中发挥重要作用[4]，但Gly-LDL对血管内皮的影响是否通过导致氧化应激作用而引起血管病变仍有待讨论。本研究通过检测氧化应激的部分相关物质评价gly-LDL对血管内皮细胞的作用，探讨gly-LDL与糖尿病血管并发症的相关性及可能影响机制。
1.1 主要试剂及仪器
人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)、RPMI 1640培养基、(superoxide dismutase, SOD) 测试盒及(malondialdehyde, MDA)检测试剂盒购自南京凯基生物公司，低密度脂蛋白(LDL)、葡萄糖和丁基羟基甲苯购自美国Sigma-Aldrich公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，Trizol 以及 RT-qPCR相关试剂PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒和SYBR®Premix Ex TagTM购自美国TaKaRa公司。PCR仪为ABI PRISM®7900HT。
1.2 方法
1.2.1 低密度脂蛋白的糖化 参考相关文献中关于低密度脂蛋白的糖化方法[5-6]，在无菌条件下将葡萄糖与LDL在37℃条件下孵育4周，葡萄糖终浓度为50mmol/L，LDL终浓度为2mg/ml；同时加入EDTA和丁基羟基甲苯，终浓度分别为1mg/ml和10μm/L；得到的糖化LDL，透析后避光储存。
1.2.2 细胞培养与分组 HUVECs细胞用RPMI 1640培养基常规培养并传代铺板。对照组(Ctr)仅加培养基，糖化LDL(gly-LDL)分三组，G1组加入0.06mg/L gly-LDL，G2组加入0.12mg/L gly-LDL，G3组加入0.24mg/L gly-LDL，每组三个复孔，分别培养24h、48h、72h。
1.2.3 内皮细胞划痕实验 在六孔板底部用黑色记号笔平行画三条线作为标记，每孔铺约5×106个细胞，常规培养贴壁后用200μl枪头在培养皿中划痕，PBS洗涤2次，加入含1%血清的培养基，倒置显微镜下拍照，放入37℃ 5% CO2培养箱培养。之后分别于培养第24h、第48h、第72h拍照。
1.2.4 SOD活性和MDA含量测定 收集培养24h、48h和72h的细胞培养上清液，根据试剂盒说明书处理后，分别于波长550nm和532nm处测定吸光度(D值)，根据说明书中公式算得SOD的活力及MDA的含量。
1.2.5 Realtime quantitative PCR 选取Mn-SOD基因及eNOS基因做实时荧光半定量PCR，基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列为： GAPDH上游： 5′-GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3′，GAPDH下游： 5′-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3′； Mn-SOD上游： 5′-AGT TCA ATG GTG GTG GTC ATA-3′，Mn-SOD下游： 5′-CAA TCC CCA GCA GTG GAA TAA-3′；eNOS上游： 5′-CAG CCT CAC TCC TGT TTT CC-3′，eNOS下游： 5′-GGA TTG TCG CCT TCA CTC G-3′。选取甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参。RT-qPCR反应条件： 预变性95℃ 30s，PCR反应95℃ 10s，60℃ 34s，72℃ 10s，40个循环，延伸95℃ 5s，60℃ 1min，95℃ 15s。得到阈值周期(CT值)，用2-ΔΔCt法计算表达差异倍数。
2.1 细胞划痕实验结果
HUVECs加入不同浓度的gly-LDL后，分别于培养第24h、48h、72h拍照，对照组细胞几乎迁移完全，而G1组、G2组和G3组的细胞迁移与对照组相比，在第48h和72h受到明显的抑制，在第一个24h，G3组即最高浓度gly-LDL组的细胞迁移受到的抑制作用最明显，见图1。
图1 HUVECs细胞划痕图
Fig.1 Scarification test of HUVECs
2.2 SOD活性和MDA含量
收集培养24h、48h和72h的细胞培养上清液后，用ELISA的方法测定SOD和MDA的含量。其中，对照组的SOD活性在培养48h后出现一个高峰，培养72h后活性又降低。G1组和G3组的细胞上清液SOD活性随时间呈上升趋势，其中G1组相对较明显。G2组细胞上清液的SOD活性随时间呈现下降趋势，但48h与72h差异没有统计学意义(P>0.05)。SOD活性于48h与72h时G1、G3组与G2组组间差异有统计学意义(P<0.05),见图2。
对照组MDA含量与SOD活性变化情况相似，在48h出现高峰后72h下降。G1和G3组细胞上清液MDA含量随时间呈上升曲线，G1组相对更明显。G2组细胞上清液的MDA含量随时间呈现上升趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，但72h仅相对48h有微小的上升，差异没有统计学意义(P<0.05)。MDA含量于24h、48h各组间差异没有统计学意义，见图3。
图2 细胞上清液中SOD活性变化情况
Fig.2 SOD activity changes in cell supernatant
图3 细胞上清液中MDA含量变化情况
Fig.3 MDA content changes in cell supernatant
2.3 RT-qPCR结果
人脐静脉内皮细胞经过gly-LDL处理分别培养24h、48h、72h后按常规方法提取总RNA，进行RT-qPCR测定Mn-SOD和eNOS的基因表达水平。结果提示，24h时各组Mn-SOD的表达与对照组相比，差异没有统计学意义(P>0.05)，G1与G2组的eNOS明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)，G3组与对照组相比，差异没有统计学意义。48h时各组Mn-SOD及eNOS的表达均较对照组下调，差异有统计学意义。72h时G1和G2组的Mn-SOD较对照组明显下调，差异有统计学意义，G3与对照组相比，差异没有统计学意义；各组的eNOS与对照组比均现显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4、图5。
图4 各组Mn-SOD mRNA表达情况
Fig.4 Relative expression of Mn-SOD mRNA
图5 各组e-NOS mRNA表达情况
Fig.5 Relative expression of e-NOS mRNA
糖尿病是一种严重危害人类健康的慢性疾病，血管病变是糖尿病的主要并发症之一，但其发病机制目前并不十分清楚。已有研究证明gly-LDL与糖尿病血管病变有相关性[7]。具体机制尚未明确，本研究则从氧化应激的角度探讨gly-LDL对血管内皮细胞生长及代谢的影响。超氧化物歧化酶(SOD)是人体自生的一种氧自由基清除剂[8]。在血管内皮保护和抗氧化应激方面起着重要作用[9]。目前，总SOD的直接相关基因未见明确报道，本研究选取测定Mn-SOD的mRNA表达情况。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化最重要的产物之一[10]，它的产生还能加剧膜的损伤。因此，在衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一个常用指标，可通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度。eNOS(endothelial nitric oxide synthetase)即一氧化氮合成酶，它的表达与血管舒张因子一氧化氮(NO)的合成分泌密切相关，一定程度上提示了血管内皮细胞的功能[11-12]。本研究通过细胞划痕实验观察不同浓度gly-LDL对人脐静脉内皮细胞迁移功能的影响，发现不同浓度的gly-LDL均能抑制细胞的迁移。测定细胞上清液中SOD活性及MDA含量，发现0.12mg/L的gly-LDL对内皮细胞的SOD活性及MDA含量相对其他浓度gly-LDL的影响大，且作用48h后更明显，主要是抑制SOD的活性，促进MDA的分泌。0.06mg/L的gly-LDL及0.24mg/L的gly-LDL对血管内皮细胞SOD活性及Mn-SOD含量的影响相似，随时间的变化均轻度升高SOD的活性及MDA的含量。从对照组来看，在未受到干扰的情况下，SOD活性和MDA的含量均于48h内逐渐上升，后逐渐下降，细胞在受到gly-LDL的作用影响后这一节律被打乱。24h时各组间差异不大；第48h时SOD活性被抑制，MDA含量增加；第72h时G2组SOD活性及MDA含量均相对较低，但G1组的SOD活性及MDA含量均相对明显的升高，提示可能较低浓度的gly-LDL能促进细胞发生过氧化反应，同时启动自我保护机制促进SOD的激活；而相对更高浓度的gly-LDL在刺激血管内皮细胞过氧化反应的同时抑制了SOD的活性。RT-qPCR的结果提示，24h时Mn-SOD基因的表达尚未有明显的改变，于第48h和72h各gly-LDL组Mn-SOD均较对照组不同程度的下调。各组eNOS的表达于24h及48h时均是相对下调的，与gly-LDL的浓度无明显相关性，但72h时相对对照组是明显上调的，且随gly-LDL浓度升高而升高，提示48h以内gly-LDL可能是抑制内皮细胞NO的生成的，对于血管的作用是不利的，而72h后，随着细胞的自身调节机制启动，激活NO相关促生成基因的表达，但最终NO的生成或释放的多少仍需要进一步的研究。
综上所述，本研究发现较低浓度的gly-LDL可能在一定程度上是自我调节与自我保护的启动因素之一，对人体本身是有益的，而较高浓度的gly-LDL可一定程度地影响人气静脉血管内皮细胞的迁移，其机制可能是通过影响SOD的活性及生成来影响血管内皮的功能，即提示高血脂的糖尿病患者可能是间接通过形成糖化低密度脂蛋白引起氧化应激而致使血管内皮受损。然而随着时间的推移，损伤作用可能逐渐减弱，保护作用逐渐增强。这一机制可能与CO2对呼吸的调节作用类似，即较低浓度的CO2可刺激呼吸，较高浓度的CO2可抑制呼吸，而处于较长时间的高浓度CO2状态时，呼吸主要靠CO2来刺激，若立即纠正反而更易引起呼吸停止[13]，但这一推论的证实仍需要更进一步的研究。通过本研究得到结论，gly-LDL与糖尿病患者血管并发症可能存在一定的相关性，但不能肯定其是恶化因素之一。
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Effect of glycated LDL on SOD activity and gene expression of human umbilical vein endothelial cells
【Abstract】Objective To investigate the effect of glycated low density lipoprotein(gly-LDL) on the growth and antioxidant related factors in endothelial cells, and investigate the correlation of gly-LDL with diabetes vascular endothelial injury and the possible mechanism. Methods Human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) were treated with different concentrations(0.06mg/L, 0.12mg/L, 0.24mg/L) of gly-LDL for 24h, 48h and 72h. Superoxide dismutase(SOD) and malondialdehyde(MDA) levels in the cell culture supernatant were detected. The migrate function of endothelial cells was assessed by scratch test. Mn-SOD and eNOS mRNA expressions were determined by real-time quantitative PCR(RT-qPCR). Results Gly-LDL at different concentrations inhibited the migrate function of endothelial cells. When HUVCCs treated with 0.06mg/L and 0.24mg/L gly-LDL, the activity of SOD and MDA were increased with the time; while treated with 0.12mg/L gly-LDL, the SOD activity was decreases with the time and MDA was decrease after initial increase. Mn-SOD mRNA expression level were down-regulated after 48h and 72h in all gly-LDL treated groups. The expression of eNOS levels in 24h and 48h were down-regulated, but up-regulated in 72h. Conclusion Glycated LDL can inhibit growth of endothelial cells and change the expression of antioxidant related factors, which may be associated with the pathogenesis of vascular complications in diabetic patients.
【Key words】glycosylation; low density lipoprotein; HUVECs; superoxide dismutase; malondialdehyde
doi：10.16118/j.1008-0392.2016.06.006
收稿日期：2016-06-28
基金项目：国家“863”高技术研究发展计划(2014AA022304)
【中图分类号】R 587
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2016)06-0029-06