图1 荧光素酶报告载体(A、 B)、qRT-PCR(C、F)和蛋白质印迹法(D、E、G、H)检测miR-29a 调控KDM5B 的表达
Fig.1 The expression of KDM5B regulated by miR-29a was detected by luciferase reporter vector (A, B), qRT-PCR (C, F)and Western blotting (D, E, G,H), respectively
·基础研究·
【摘要】目的 探讨在前列腺癌中miR-29a与H3K4特异性去甲基化酶—KDM5B之间的关系，验证miR-29a通过调控KDM5B的表达来抑制前列腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡。方法 将miR-29a模拟物(miR-29a mimic)片段和含野生型KDM5B基因3′-非翻译区的荧光素酶报告载体(KDM5B-wt)共转染至前列腺癌PC3和Lncap细胞后，进行荧光素酶活性检测。采用脂质体转染法将miR-29a mimics转染入人前列腺癌PC3和Lncap细胞中，MTT实验检测细胞增殖情况；流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡；Real-Time PCR和Western印迹法检测KDM5B表达水平。结果 转染miR-29a mimics后，KDM5B的表达被明显抑制 (P<0.01)，蛋白表达水平也明显低于NC组。与NC组相比，转染miR-29a mimics组细胞增殖能力显著降低(P<0.01)，细胞生长被阻滞在S/G2期，细胞凋亡率较NC组增加(P<0.01)。结论 miR-29a可以通过调控H3K4特异性去甲基化酶-KDM5B的表达而抑制前列腺癌PC3和Lncap细胞的增殖。miR-29a有希望成为诊断和治疗前列腺癌新的分子标记和靶点。
【关键词】前列腺肿瘤； miRNA-29a； KDM5B基因； 去甲基化酶
前列腺癌( prostate cancer， PCa)是威胁男性健康的常见肿瘤之一。微小RNA(microRNA，miRNA， miR) 目前已经成为肿瘤研究的热点，最近越来越多的证据表明miRNA的异常表达与肿瘤的形成、恶性增殖和转移等有关[1]，其主要作用是在转录后水平对基因表达进行负调控，降解mRNA或阻碍其翻译[2]。研究表明，miR-29a 在前列腺癌组织及细胞中的表达下调，并且抑制肿瘤细胞的增殖[3]。研究发现，KDM5B是组蛋白H3第四位赖氨酸(H3K4)的特异性去甲基化酶, KDM5B的过表达可以使得H3K4甲基化水平下降，但不影响其他组蛋白赖氨酸甲基化状态；KDM5B在前列腺癌组织中高表达[4]。通过在线软件预测发现，KDM5B是miR-29a 调控的一个靶基因。本研究拟从分子水平探讨miR-29a如何调控KDM5B，改变H3K4甲基化状态，进而调控前列腺癌细胞的发生与发展。
1.1 材料及主要试剂
人前列腺癌PC3和LNCaP细胞购自中科院上海生化细胞研究所。RPMI-1640培养液购自美国HyClone公司,胎牛血清购自Gibco公司。LipofectAMINE 2000脂质体转染试剂和TRIzol购自美国Invitrogen公司；碘化丙啶(PI)、RNase、NP-40、细胞凋亡检测试剂盒和MTS细胞生长增殖检测试剂盒购自美国Sigma 公司；含野生型KDM5B基因3′-非翻译区(3′-untranslated region， 3′-UTR)的荧光素酶报告载体KDM5B-wt 和含突变型KDM5B基因3′-UTR 的荧光素酶报告载体KDM5B-mut 购自广州锐博生物公司；双荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega 公司；蛋白质提取试剂盒购自上海BestBio 贝博生物公司；增强型化学发光试剂和BCA 蛋白定量试剂购自美国Pierce 公司；兔抗人KDM5B单克隆抗体购自美国Abcam公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(二抗)购自武汉博士德生物工程有限公司；miR-29a模拟物(miR-269 mimic)、无关序列阴性对照(microRNA negative control， miR-NC)片段及靶向基因KDM5B的引物片段购自上海吉玛生物公司，miR-29a mimic 片段序列为5′-GTGGAGGGTCCGAGGT-3′，miR-NC 片段序列为5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′；靶向基因KDM5B引物序列为5′-AGCAGACTGGCATCTGTAAGG-3′。
1.2 细胞培养
PC3和LNCaP细胞生长于RPMI 1640培养液，置于37℃、100%饱和湿度、CO2 体积分数为5%的培养箱中培养。细胞呈单层贴壁生长，细胞融合度达到80%～90% 时进行常规传代。
1.3 荧光素酶活性检测验证miR-29a 是否与KDM5B 基因3′-UTR 结合
将对数生长期的PC3和LNCaP细胞收集起来，接种于6孔板(细胞密度为5×104个细胞/ml，2ml/孔细胞悬液)中，当细胞融合度为60%～70% 时，按LipofectAMINE 2000说明书提供的方法分别将miR-29a mimic+KDM5Bwt、miR-NC+KDM5B-wt、miR-29a mimic+KDM5B-mut和miR-NC+KDM5B-mut共转染至PC3和LNCaP细胞。转染48h 后，收集各组细胞，按照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书中提供的方法在单光子检测仪(美国Bio-Rad 公司产品)上进行检测，计算相对荧光素酶活性。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值(实验重复3 次)。
1.4 miR-29a mimic转染PC3和LNCaP细胞
转染前1d收集融合度为80%的PC3和LNCaP细胞，用RPMI-1640培养液(含10%胎牛血清)调整细胞密度为1×105个细胞/ml，将细胞以1× 105/孔接种于96孔板(100μl/孔细胞悬液)或6孔板中(2ml/孔细胞悬液)中，当细胞在24h内融合达60%～80%时进行转染。采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000，按试剂盒说明书提供的方法进行转染，实验分3组： 阴性对照组(miR-NC组)；MOCK组(只加脂质体)； miR-29a mimic组。在96 孔板中转染的细胞用于后续的MTT法细胞增殖、周期、凋亡检测，在6孔板中转染的细胞用于后续的蛋白质印迹法检测。
1.5 转染后KDM5B及蛋白质水平检测
TRIzol提取各实验组转染24 h后细胞总RNA，通过反转录获得各标本cDNA。取2μl cDNA作为模板，加入18μl PCR反应液[4μmol/L基因引物1μl，红色荧光染料ROXDye(50×)0.4μl，dd H20 6.6μl，2×SYBR Premix Ex Taq 10μl]。在ABI 7900实时荧光定量PCR仪上进行扩增，反应条件为 95℃ 预变性1min，95℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 45s，40个循环，72℃ 5min。计算各组间KDM5B mRNA表达水平的相对比值。
转染48h后，抽提总蛋白，行蛋白定量、电泳、转膜、封闭。4℃条件下兔抗人KDM5B抗体(1∶1000)孵育过夜，荧光二抗(1∶1000)孵育后，用Odyseey数字显像系统采集信号(以β-actin为内参)。应用Quantity One 软件进行分析，以目的蛋白质条带的灰度值与内参照GADPH 蛋白质条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平(实验重复3 次)。
1.6 MTT 法检测miR-29a mimic转染后对细胞增殖的影响
收集本文1.4 节在96孔板中转染miR-26a mimic、MOCK组(只加脂质体)和miR-NC(对照组)0h,24h，48h，72h后的PC3和LNCaP细胞，进行细胞增殖活性的检测，每孔加入20μl MTT，孵育4h，吸弃原液，加入150μl DMSO，震荡10min，用酶标仪检测波长450nm处的吸光度(D450)，各组求均值，描绘总的生长曲线。细胞生长抑制率=(1-AmiR-29a mimic/AmiR-NC)×100%。每组设6个重复孔(实验重复3次)。
1.7 流式细胞术检测细胞周期的变化
碘化丙锭(PI)可以与细胞内RNA和DNA结合，利用RNA抑制剂将RNA消化，通过流式细胞术检测与DNA结合的PI的荧光强度，直接反映细胞内DNA含量的多少。通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期，S期和G2/M期。本实验取至少105个转染24h后的各组细胞，离心吸弃上清液，用PBS洗涤2遍后，1×Binding buffer重悬细胞，300～500μl的标记液标记细胞。
1.8 流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡率
将转染48h后的PC-3细胞及LNCaP细胞收集起来，消化分离为1×105/ml的单细胞悬液，离心后用0.1mol/L的PBS液洗涤，共洗涤3次，700ml/L 乙醇固定30min，用10g/L Triton 100处理10min，10g/L的RNase 1ml处理10min，2.5g/L的碘化丙锭染色30min，采用美国Coulter公司EPLCS XL型流式细胞仪分析(实验重复3次)，结果取平均值。
1.9 统计学方法
应用SPSS 17.0 软件对各实验的结果数据进行统计学分析。两组间的比较采用t 检验，组间两两比较采用SNK 法检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05 为差异有统计学意义。
2.1 KDM5B是miR-29a调控的靶基因
miR-29a mimic+KDM5Bwt、miR-NC+KDM5B-wt、miR-29a mimic+KDM5B-mut和miR-NC+KDM5B-mut共转染至LNCaP 细胞后进行荧光素酶活性检测的结果(图1A)显示，miR-29a mimic+KDM5B-wt 共转染组细胞的荧光素酶活性强度比miR-NC+KDM5B-wt 共转染组下降了约51%，差异有统计学意义(P < 0.05)；而miR-29a mimic+KDM5B-wt 共转染组细胞的荧光素酶活性强度与miR-29a mimic+KDM5B-mut 共转染组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。这一结果说明，KDM5B 是miR-29a 调控的靶基因,见图1。
qRT-PCR和蛋白质印迹法检测结果(图1)显示，miR-29 mimic 转染48h 后，前列腺癌PC3和LNCaP 细胞中KDM5B 的表达水平低于miR-NC 转染组(P<0.05)。这一结果表明，高表达miR-29a 能抑制前列腺癌PC3和LNCaP 细胞KDM5B 的表达，进一步证实KDM5B 是miR-29a 调控的靶基因。
图1 荧光素酶报告载体(A、 B)、qRT-PCR(C、F)和蛋白质印迹法(D、E、G、H)检测miR-29a 调控KDM5B 的表达
Fig.1 The expression of KDM5B regulated by miR-29a was detected by luciferase reporter vector (A, B), qRT-PCR (C, F)and Western blotting (D, E, G,H), respectively
2.2 miR-29a 过表达可抑制前列腺癌PC3和LNCaP细胞的增殖
MTT法检测结果(图2B)显示，miR-29a mimic转染组PC3和LNCaP细胞的增殖率明显低于miR-NC转染组，差异有统计学意义(P<0.05)；用PI标记流式细胞技术对LNCaP (C)和PC3 (D)细胞系进行检测，结果表明MiR-29a的过表达导致细胞G1期减少，S期和G2期增加，即细胞周期改变主要是S期和G2期阻滞(P< 0.05)。
2.3 miR-29a 过表达可促进前列腺癌PC3 和LNCaP 细胞的凋亡
用Annexin V-FITC 和PI 标记流式细胞技术对转染后的PC3和LNCaP细胞系进行检测。流式细胞仪结果显示，转染miR-29a 细胞组的细胞凋亡率较阴性对照组明显增加(P < 0.05)。miR-29a诱导前列腺癌PC3细胞和LNCaP 的凋亡。
图2 MTT法(A、B)和流式细胞术(C、D)分别检测miR-29a mimic转染后PC3和LNCaP细胞增殖率和细胞周期
Fig.2 Cell proliferation and cell cycle in PC3 and LNCaP cells after transfection with miR-29a mimic detected by MTT assay (A, B) and flow cytometry (C,D),respectively
图3 流式细胞术分别检测miR-29a mimic转染后PC3 (B)和LNCaP (A)细胞的凋亡
Fig.3 Cell apoptosis in PC3 and LNCaP cells after transfection with miR-29a mimic detected by flow cytometry(C,D),respectively
前列腺癌( prostate cancer， PCa) 是美国等西方发达国家男性最常见的恶性肿瘤性疾病[5]，同时也是男性癌症致死的第二大因素[6]。临床研究发现，大约有30%左右的前列腺癌患者一发现就是临床进展型前列腺癌，治疗效果较差[7]；而且雄激素依赖型前列腺癌在抗雄激素治疗18～24个月后大约有80%会转变成雄激素非依赖型前列腺癌，目前没有彻底治愈的方法[8]。
组蛋白甲基化修饰在基因活性调节中扮演着重要的角色，组蛋白甲基化的紊乱可能导致癌变的发生[9]。最新研究发现，组蛋白H3第四位赖氨酸二甲基修饰(H3K4diMe)与低分级前列腺癌患者手术后预后有关[10]。KDM5B是H3K4特异性去甲基化酶，KDM5B的过表达可以使得H3K4甲基化水平下降，但不影响其他组蛋白赖氨酸甲基化状态；且KDM5B在前列腺癌组织中高表达[4]。miR-29a位于7q32，在前列腺癌组织及细胞中的表达下调，且抑制肿瘤细胞的增殖[3], 但在前列腺癌发病中miR-29a调控组蛋白去甲基化的分子机制仍不清楚。
本研究应用生物信息学软件查询、荧光素酶报告基因活性检测和蛋白质印迹法等分子生物学技术证实，KDM5B是miR-29a 调控的靶基因，转染miR-29a mimic可降低KDM5B的表达，并且抑制前列腺癌PC3 和LNCaP细胞的增殖，以及诱导前列腺癌PC3细胞和LNCaP 的凋亡。这一结果说明，MiR-29a通过抑制KDM5B表达，抑制前列腺癌细胞的增殖及促进凋亡，从而起抑癌基因作用。本研究初步揭示了miR-29a 对前列腺癌PC3 和LNCaP的抑制机制。最近则有文献报道，miR-29a 可通过抑制laminin γ1 (LAMC1)的表达而抑制前列腺癌的生长和增殖[3]。因此，进一步研究miR-29a 在前列腺癌发生和发展中的作用机制，为针对以miR-29a 为作用靶点发现新的治疗措施提供实验和理论基础，这无疑是十分必要的。
【参考文献】
[1] Tang YT, Zhou XF, Zhang SY, et al. High expression levels of miR-21 and miR-210 predict unfavorable survival in breast cancer： a systemic review and meta-analysis[J]. Int J Biol Markers, 2015, 30(4)： e347-e358.
[2] 赵文健,杨亮,何汉江.miR-200b通过靶向CD133抑制胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞的生长[J].肿瘤,2014,34(3)： 231-237.
[3] Nishikawa R, Goto Y, SekiN, et al. Tumor-suppressive microRNA-29s inhibit cancer cell migration and invasion via targeting LAMC1 in prostate cancer[J]. Int J Oncol, 2014，45(1)： 401-410.
[4] Xiang Y, Zhu Z, Han G, et al. JARID1B is a histone H3 lysine 4 demethylase up-regulated in prostate cancer[J]. PNAS,2007,104： 19226-19231.
[5] Jemal A， Bray F， Center MM， et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2)： 134.
[6] Laura G, Andy SL, Tan RC, et al. Nonmedical information seeking amid conflicting health information： negative and positive effects on prostate cancer screening[J]. Health Commun, 2016,31 (4)： 417-424.
[7] Budnik LT, Kloth S, Velasco GM. Prostate cancer and toxicity from critical use exemptions of methyl bromide： environmental protection helps protect against human health risk[J]. Environ Health, 2012,365(21)： 2013-2019.
[8] Teoh JY, Chiu PK, Ng CF, et al. Risk of new-onset diabetes after androgen deprivation therapy for prostate cancer in the Asian population[J]. J Diabetes, 2015,7 (5)： 672-680.
[9] Varier RA, Timmers HT. Histone lysine methylation and demethylation pathways in cancer[J]. Biochim Biophys Acta, 2011,1815： 75-89.
[10] Li XZ, Tao L, Dong L, et al. Application of histone modification in the risk prediction of the biochemical recurrence after radical prostatectomy[J]. Asian J Androl, 2010,12： 171-179.
miRNA-29a inhibits proliferation and induces apoptosis of prostate cancer cells by regulating H3K4 methylation
【Abstract】Objective To investigate the effect of miRNA-29a on cell proliferation and apoptosis of prostate cancer cells and its mechanism. the—KDM5B in prostate cancer, verify miR-29a suppresses prostate cancer (PCa) cell proliferation and induces apoptosis via KDM5B protein regulation. Methods miR-29a mimic and luciferase reporter vector KDM5B-wt were co-transfected into prostate cancer PC3 and Lncap cells, and the luciferase activity was detected. The cell proliferation was examined by MTT assay, cell cycle and apoptosis was assessed by flow cytometry, the mRNA and protein expression levels of KDM5B, a specific demethylase of H3K4, were detected by real-time PCR and Western blotting, respectively. Results After transfection， the relative expression level of KDM5B in miR-29a mimic group was significantly reduced (P<0.01) as compared to that of NC group， and the protein level was also significantly decreased.Compared to NC group， the cell proliferation in miR-29a mimic group was significantly inhibited (P<0.01)， the cell cycle was arrested at S/G2 phase， and the cell apoptosis rate was increased (P<0.01). Conclusion miR-29a can suppress the cell proliferation by targeting KDM5B expression, a specific demethylase of H3K4, in prostate cancer PC3 and Lncap cells, which indicates that miR-29a might be used as a new molecular marker and target for diagnosis and treatment of prostate cancer.
【Key words】prostate cancer； miRNA-29a； KDM5B gene； demethylase
doi：10.16118/j.1008-0392.2016.06.002
收稿日期：2015-12-14
基金项目：国家自然科学基金面上项目(81172426)；上海市教育委员会科研创新项目(12ZZ034)
【中图分类号】R 737.25
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2016)06-0006-06