·基础研究·
【摘要】目的 研究CD4+T细胞在糖尿病性心肌病(diabetes cardiomyopathy, DCM)中的作用。方法 SPF级C57BL/6小鼠，雄性，4周龄，饲喂高脂饲料(high fat diet， HFD)6周,腹腔注射链脲菌素(streptozotocin, STZ)，普通饲料喂养的C57BL/6小鼠作为对照，饲喂6周后腹腔注射柠檬酸缓冲液。注射1周后两组小鼠做心脏超声检测，后处死小鼠，心肌组织进行H-E染色，观察心肌病理改变情况，Q-PCR检测两组小鼠心肌组织中相关炎症因子的表达水平。流式细胞检测小鼠体内CD4+T细胞的表型。结果 与普通饮食喂养小鼠相比，2型糖尿病模型小鼠出现了明显的心功能损害和心肌病理学改变。糖尿病模型小鼠心肌组织中Th1细胞转录因子T-bet及炎症因子TNF-α和IFN-γmRNA均较对照组明显升高。糖尿病模型小鼠纵隔淋巴结中CD4+CD44+T细胞比例较对照组明显升高。结论 2型糖尿病模型小鼠出现了明显的心功能损害，纵隔淋巴结CD4+CD44+T细胞比例明显增加，心肌组织中Th1细胞转录因子T-bet升高，提示激活的CD4+Th1细胞可能在DCM中扮演着重要角色，TNF-α可能也参与了这一过程。
【关键词】糖尿病性心肌病； CD4+T细胞； 炎症反应； 小鼠
糖尿病(diabetes mellitus， DM)是影响着全世界3亿人的主要慢性疾病之一。预计到2030年，将有4.5亿人患有糖尿病[1]。在糖尿病众多的并发症中，糖尿病患者患心血管疾病和心脏衰竭的风险显著高于非糖尿病人群，心血管疾病(cardiova-scular disease, CVD)是糖尿病人群最重要的死亡原因[1]。其中，糖尿病性心肌病(diabetes cardiomyo-pathy, DCM)作为独立于高血压和冠状动脉疾病的特异性心肌病，与糖尿病显著相关[2]。独立的病因学数据显示，糖尿病人群中由DCM导致的心脏衰竭(heart failure, HF)风险比非糖尿病人群增加约2～ 3倍，且预后更差[3]。但糖尿病患者心力衰竭的具体机理尚不完全清楚。
炎症是目前公认的糖尿病及其并发症的关键因素[4]。作为重要的炎症细胞，T细胞在左室的募集和活化对非缺血性心力衰竭的作用已被证实[5-6]。本研究利用高脂饮食喂养(high fat diet, HFD)加链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)腹腔注射诱导的2型糖尿病模型(简称HFD模型)，探讨高血糖激活的CD4+T细胞在DCM所致心功能损害中的作用[7]。
1.1 实验动物与分组
SPF级C57BL/6小鼠，雄性，体质量20～25g，4周龄,购于上海斯莱克实验动物有限公司【许可证号SCXK(沪)2007—0005】。小鼠饲养于同济大学附属东方医院实验动物中心SPF动物房。分组为正常对照组： C57BL/6小鼠，7例；HFD及STZ诱导组： 6例。
1.2 HFD加STZ腹腔注射诱导的2型糖尿病模型的建立
从小鼠4周龄开始，糖尿病模型组小鼠饲喂高脂饲料，正常组小鼠饲喂基础饲料，持续6周。各饲喂6周后，糖尿病组小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射STZ，剂量按70mg/kg体质量，一次性注射[7],继续饲喂高脂饲料;正常组小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射柠檬酸缓冲液,剂量按70mg/kg体质量，一次性注射，继续饲喂普通饲料。STZ注射7d后,禁食不禁水12h,罗氏卓越型血糖仪测量空腹血糖,血糖值大于11.1mmol/L的个体被认定为2型糖尿病小鼠。
1.3 小鼠心超
STZ注射后7d后，将两组小鼠以1%异氟烷吸入麻醉后，仰卧位固定于高分辨率小动物超声系统(VisualSonics Vevo770)上,选取胸骨旁短轴观切面，2D M型超声心动图评估左室收缩末直径(end systolic dimension, ESD),左室舒张末直径(end dilation dimension, EDD)，及反映心室收缩功能的射血分数(ejection fraction, EF)，缩短分数(fractional shortening, FS)。
1.4 标本收集
处死小鼠，取小鼠心脏放入含1ml 4%多聚甲醛溶液的冻存管，4℃保存24h,作H-E染色切片。另留心尖部分的心肌组织置于含1ml Trizol的1.5ml EP管中，用于抽提RNA。
1.5 Q-PCR检测
小鼠心肌组织置于含1ml Trizol的RNAse-Free的1.5ml EP管中，充分匀浆，加200μl氯仿，剧烈振荡15s，15～30℃下静置3min，离心半径10cm，4℃，离心机转速12000 r/min，离心15min，小心转移上层无色溶液于另一个1.5ml RNAse-Free的离心管中，加 200μl 异丙醇，混匀，室温放置15min，离心半径 10cm,4℃，离心机转速12000r/min,离心10min，倒去上清液，加200μl 75%乙醇洗涤沉淀，离心半径10cm，4℃，离心机转速 7500r/min，离心 5min，重复75%乙醇洗涤，倒去上清液，打开管盖，将沉淀于超净台上晾干，将得到的RNA沉淀用30～50μl RNAse-Free的水溶解，用Nano Drop仪对RNA进行浓度测定。每个200μl RNAse-Free的薄壁管中加入以下试剂： gDNA eraser buffer 2μl，gDNA eraser 1μl，RNA 1μl，用RNAse-Free的水补足10μl，混匀，42℃加热2min，向所得产物内分别加入以下试剂： primer script buffer 4μl，primer script RT enzyme 1μl，RT primer mix 1μl，RNAse-Free的水4μl，混匀，放置 37℃ 15min，85℃ 5s。用Primer 5.0设计引物，所采用的引物序列,见表1。
表1 RT-PCR引物序列
Tab.1 Sequences of RP-PCR primers
引物名称Primername引物序列(5′⁃3′)PrimersequencesGAPDH⁃FAAATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGAPDH⁃RATCTCCACTTTGCCACTGCCD4⁃FAGGTGATGGGACCTACCTCTCCD4⁃RGGGGCCACCACTTGAACTACTbet⁃FAGCAAGGACGGCGAATGTTTbet⁃RGGGTGGACATATAAGCGGTTCTNF⁃a⁃FGATACTGCGGGTCAGGAACGTNF⁃a⁃RGCAGCAGAGTCACGGATGTAAIFN⁃r⁃FATGAACGCTACACACTGCATCIFN⁃r⁃RCCATCCTTTTGCCAGTTCCTC
1.6 流式细胞检测
分别取小鼠纵隔淋巴结于平皿中，研磨，PBS冲洗平皿，收集细胞悬液，裂解红细胞，加抗体来源的血清进行封闭10min，加不同荧光标记的抗体(如CD4，CD44)，4℃孵育20min，PBS洗去多余的抗体，后上样进行流式检测，数据导出用Flowjo软件分析。
1.7 统计学分析
所得数据均采用GraphPad Prism 6.0统计软件处理。计量资料以
±s表示,采用独立样本t检验，以P<0.05作为差异有显著意义的检验标准。
2.1 HFD模型血糖及体质量变化
2.1.1 体质量变化 从两组小鼠4周龄开始用HFD饲喂，每周测量小鼠体质量。与对照组(Control)小鼠相比，从第7周开始(HFD饲喂3周)，HFD组小鼠体质量明显增加，此后差异更加显著，直至12周龄取材时。
2.1.2 血糖变化 从两组小鼠4周龄开始，每周测量小鼠血糖水平。与对照组小鼠(Control)相比，从第7周开始，HFD组小鼠血糖明显升高，此后差异更加显著，直至12周龄(STZ腹腔注射1周后)取材时，见图1。
图1 HFD模型体质量及血糖变化情况 (n=3， *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)
Fig.1 Weight and blood glucose of HFD model (n=3， *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)
2.2 HFD模型心功能发生损害
两组小鼠12周龄时测量心脏超声，与对照组小鼠相比，HFD组小鼠EF及FS均有明显下降，见图2。
图2 HFD小鼠心功能变化情况(n=6，*P<0.05)
Fig.2 Cardiac function of HFD model(n=6，*P<0.05)
2.3 HFD模型心肌病理学检测
两组小鼠12周龄时取材做心肌组织H-E染色。与对照组小鼠相比，HFD组小鼠心脏明显增大，心室壁增厚，心肌细胞变大，细胞间隙增宽，肌纤维走向不规则，甚至出现扭曲，断裂，心肌间有炎细胞浸润，见图3。
图3 HFD小鼠心肌病理变化情况(H-E染色)
Fig.3 Pathological changes of HFD myocardium(H-E staining)
2.4 HFD模型心肌组织炎症因子变化
两组小鼠12周龄时，Q-PCR检测两组小鼠心肌CD4 mRNA及组织炎症因子mRNA。结果显示，与对照组小鼠相比，HFD组小鼠CD4 mRNA, Th1细胞转录因子T-bet及炎症因子IFN-γ表达均升高，TNF-α表达水平明显升高,见图4。
图4 HFD模型心肌炎症因子mRNA相对表达情况 (n=5，*P<0.05, **P<0.01)
Fig.4 Gene relative expression of inflammatory cytokines from HFD heart(n=5，*P<0.05, **P<0.01)
A： Q-PCR检测两组心肌CD4 mRNA表达水平；B： Q-PCR检测两组心肌T-bet mRNA表达水平；C： Q-PCR检测两组心肌IFN-γ mRNA表达水平；D： Q-PCR检测两组心肌TNF-α mRNA表达水平
2.5 HFD模型纵隔淋巴结CD4+CD44+T细胞变化
两组小鼠12周龄时取小鼠纵隔淋巴结,用流式细胞仪检测CD4+T细胞表型，结果显示，与对照组小鼠相比，HFD组小鼠CD4+T细胞比例明显降低，CD44+CD4+T细胞比例明显升高，见图5。
图5 HFD小鼠纵隔淋巴结CD44+CD4+T细胞数量变化情况(n=5，*P<0.05, **P<0.01)
Fig.5 Quantity changes of CD44 + CD4 + T cells from mediastinal lymph nodes of HFD mice(n=5，*P<0.05, **P<0.01)
自糖尿病心肌病的概念被提出以来，流行病学研究结果显示，糖尿病患者患HF的可能性比非糖尿病患者高出两倍以上[3]，相对于非糖尿病人群，糖尿病HF患者的生存率也显著降低[8]。DCM的发生和发展受多因素影响，比如炎症反应，代谢紊乱，胰岛素抵抗，肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system， RAS)功能异常和心肌纤维化等，其中炎症反应发挥了重要的作用[9-10]。
近年研究发现，T细胞介导的炎症反应在心力衰竭的发展中至关重要。Nevers等[5]发现T细胞在左室的募集和活化促进了心力衰竭的发生和发展，除去T细胞明显改善心力衰竭的病理改变。在小鼠2型糖尿病模型和肥胖模型中的研究发现，高血糖，高胰岛素血症，以及活性氧(reactive oxygen species， ROS)会激活CD4+ T细胞，促进IFN-γ等促炎因子的释放，并造成射血分数的降低，在扩张型心肌病和心力衰竭等心脏疾病中发挥中心作用[11]。
本研究利用HFD饲喂加STZ腹腔注射诱导的2型糖尿病模型，于注射后第7天检测小鼠心功能，心肌病理变化及心肌CD4 + T细胞和炎症因子浸润的水平，探讨高血糖引起的的CD4+T细胞激活在DCM所致心力衰竭中的作用。研究发现，与普通饮食喂养小鼠相比，2型糖尿病模型小鼠出现了明显的体重及血糖升高，较好地模拟了2型糖尿病人群，并观测到了明显的心功能损害和心肌病理学改变。Laroumaine F等[12]发现，纵隔淋巴结中的CD4+T细胞升高与心力衰竭进展密切相关。也有研究发现，心肌梗死的患者外周血中T细胞数量减少，而心脏梗死区域T细胞数量增多[13]。在本研究中，发现，纵膈淋巴结中CD4+T细胞比例在HFD组明显减低，提示HFD组可能会有较多的T细胞募集到了心脏组织。进一步的结果显示，HFD组心脏组织的CD4 mRNA水平较对照组明显升高，这些结果提示CD4+T细胞可能参与了HFD的心肌组织功能损害。
在受到某些特定因素和细胞因子的刺激时，CD4+T细胞可以分化成具有特定功能和特性的各种T细胞亚群[13]。其中，Th1亚型表达特征性转录因子T-bet，主要产生IFN-γ，后者又可以促进CD4+ T细胞向Th1亚型极化[15-16]，且可以促进心肌结构的病理损害和心力衰竭的进展[17]。研究发现，糖尿病模型小鼠心肌组织中CD4+Th1细胞转录因子T-bet及炎症因子TNF-α、IFN-γ相对表达均有明显升高，流式细胞检测发现，糖尿病模型小鼠纵隔淋巴结中CD4+CD44+T细胞比例明显增加。因此，激活的CD4+T细胞在DCM所致心力衰竭的过程中可能扮演着重要角色，并与激活的CD4+T细胞向Th1亚型极化有关，从而为干预DCM所致心力衰竭提供了部分实验数据。
【参考文献】
[1] Beckman JA, Creager MA, Libby P. Diabetes and atherosclerosis： epidemiology pathophysiology and management[J]. JAMA, 2002,287： 2570-2581.
[2] Gupta SK, Dongare S, Mathur R, et al.Genistein ameliorates cardiac inflammation and oxidative stress instreptozotocin-induced diabetic cardiomyopathy in rats[J]. Mol Cell Biochem, 2015,408(1-2)： 63-72.
[3] From AM, Leibson CL, Bursi F, et al. Diabetes in heart failure： prevalence and impact on outcome in the population[J]. Am J Med, 2006,119： 591-599.
[4] Hotamisligil GS. Inflammation and metabolic disorders[J]. Nature， 2006,444： 860-867.
[5] Nevers T, Salvador AM, Grodecki-Pena A, et al. Left ventricular t-Cell recruitment contributes to the pathogenesis of heart failure[J]. Circ Heart Fail，2015,8(4)： 776-787.
[6] Laroumanie F, Douin V, Pozzo J, et al. CD4+ T cells promote the transition from hypertrophy to heart failure during chronic pressure overload[J]. Circulation， 2014，129(21)： 2111-2124.
[7] Nacci C,Tarquinio M,De BL,et al. Endothelial dysfunction in micewithstreptozotocin-induced type 1 diabetes is opposed by compensatory overexpression of cyclooxygenase-2 in the vasculature[J]. Endocri-nology， 2009,150(2)： 849-861.
[8] From AM, Leibson CL, Bursi F, et al. Diabetes in heart failure： prevalence and impact on outcome in the population[J]. Am J Med, 2006,119： 591-599.
[9] Fang ZY, Prins JB, Marwick TH. Diabetic cardiomyopathy： evidence mechanisms and thera-peutic implications[J]. Endocr Rev, 2004,25： 543-567.
[10] Gupta SK, Dongare S, Mathur R, et al. Genistein ameliorates cardiac inflammation and oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic cardiomyopathy in rats[J]. Mol Cell Biochem， 2015，408(1-2)： 63-72.
[11] Fessler MB, Rudel LL, Brown JM. Toll-like receptor signaling links dietary fatty acids to the metabolic syndrome[J]. Curr Opin Lipidol,2009,20(5)： 379-385.
[12] Laroumaine F, Pozzo J, Lairez O, et al.CD4 +T cells promote the transition from hypertrophy to heart failure during chronic pressure overload[J]. Circ J，2014,129： 2111-2124.
[13] Ghourbani G, Andalib A, Hashemi M， et al. CD4(+)Foxp3(+) Treg and its ICOS(+) subsets in patients with myocardial infarction[J]. Iran J Immunol, 2012,9： 53-60.
[14] Zygmunt B, Veldhoen M. T helper cell differen-tiation more than just cytokines[J]. Adv Immunol, 2011,109： 159-196.
[15] Abbas AK, Murphy KM. Functional diversity of helper T lymphocytes[J].Nature, 1996,383(6603): 787-793.
[16] Espinosa V, Rivera A. Cytokines and the regulation of fungus-specific CD4 T cell differentiation[J].Cytokine, 2012,58(1)： 100-106.
[17] Yilmaz G, Arumugam TV, Stokes KY, et al. Role of T lymphocytes and interferon-gamma in ischemic stroke[J]. Circulation, 2006,113： 2105-1212.
Hyperglycemia promotes T cell activation and aggravates myocardial dysfunction in diabetic mice
【Abstract】Objective To determine the role of CD4 + T cells in diabetic cardiomyopathy(DCM). Methods C57BL/6 mice(4wk old)were fed with High-fat diet(HFD)for 6wk, and then injected with streptozotocin, STZ intraperitoneally; and normal diet-fed C57BL/6 mice were injected with citric acid buffer as control. Echocardiographic assessment of heart function was performed and the hearts were harvested 1wk after STZ injection. Heart samples were stained with H&E, and examined under light microscopy. Inflammatory factors in hearts were evaluated by Q-PCR. T cells phenotypes were detected by Q-PCR and flow cytometry. Results Compared to control mice, type 2 diabetic mice showed significant heart dysfunction and myocardial pathological changes. mRNA levels of TNF-α and IFN-γ in HFD heart increased compared with ordinary diet mice. Percentages of CD4+CD44+T cells from mediastinal lymph node up-regulated compared to that from ordinary diet mice. Conclusion Results indicate that activation of CD4+ Th1 cells may play an important role in pathogenesis of diabetic cardiomyopathy, and TNF-α may also contribute to this process.
【Key words】diabetic cardiomyopathy(DCM); CD4 + T cells; inflammation； mouse
doi：10.16118/j.1008-0392.2016.06.001
收稿日期：2016-08-23
基金项目：国家自然科学基金(81470393、81370434、81400363、81670458)；上海市领军人才基金(2012053)；上海市卫计委(ZY3-LCPT-2-1003)；浦东新区卫计委重点学科群建设(PWZxq2014-01)；浦东新区科委(Pkj2013-z03)
【中图分类号】R 61
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2016)06-0001-05