表示，结果用SPSS 20.0软件进行分析。用t检验和χ2检验来分析miRNA的表达。用约登指数[2]来确定miRNA表达值的最优截断值。构建ROC曲线(receiver operating characteristic)并计算曲线下面积(AUC)来评估miR-15b-5p对于NSCLC的预测能力。将检测结果与病理学金标准做卡方检验，检测敏感性和特异性。P<0.05为差异有统计学意义。陈 昊， 范理宏
(同济大学附属第十人民医院呼吸科，上海 200072)
【摘要】目的 探讨在可切除的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者血清中循环miRNA的表达。方法 应用实时定量荧光PCR(qRT-PCR)在训练集中检测115名患者和69名健康对照组的术前血清样本中的miR-15b-5p的表达量。用荧光量子点液相微珠在验证集中进一步确认在91名非小细胞肺癌患者和66名健康人群的血清样本中miRNA的差异性表达。用受试者工作曲线(ROC)分析选择最佳的截断值。用卡方检验来分析评估miR-15b-5p关于非小细胞肺癌的诊断价值。结果 miR-15b-5p在非小细胞肺癌中的表达显著上调(P<0.05)。卡方检验结果显示该方法的灵敏度为83.5%，特异度为68.1%。结论 miR-15b-5p可作为可切除的非小细胞肺癌中非侵入性的诊断生物标志物。
【关键词】非小细胞肺肿瘤； 血清miRNA； 非侵入性生物标志物； 量子点
肺癌已位居肿瘤相关死亡原因的首位，高死亡率主要源于缺乏有效的早期筛查和诊断方法。早期确诊者可及时行微创手术治愈，而中晚期患者开胸手术创伤大，随后的放化疗痛苦且费用高昂、疗效极差。寻找有效的肺癌早期筛查手段对提高肺癌患者的生存至关重要。近年来，发现某些特异性miRNA在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中表达上调或下调。本研究选择早期非小细胞肺癌为研究对象，研究血清中miR-15b-5p表达与早期非小细胞肺癌的关系，探讨其作为早期诊断非小细胞肺癌的非侵入性的肿瘤标志物的潜在价值。
1.1 一般资料
选择2013年12月至2015年12月在同济大学附属肺科医院接受胸外科手术的非小细胞肺癌患者共206例。纳入标准： (1) 术前1～2周内采集了外周血；(2) 临床分期ⅠA-ⅢB，接受了胸外科手术；(3) 切除标本经病理验证为肺癌；(4) 术前未接受过放疗和化疗。将206例肺癌患者分为训练集和验证集，其中训练集115例，验证集91例。在训练集中腺癌患者91例(79.13%)，鳞癌患者21例(18.26%)，大细胞癌3例(2.61%)；在验证集中腺癌患者71例(78.02%)，鳞癌患者17例(18.68%)，大细胞癌3例(3.30%)。2组病理类型构成比例相近。在训练集中Ⅰ期患者为88例(76.52%)，ⅡA-ⅢB期患者为27例(23.48%)；在验证组中Ⅰ期患者64例(70.33%)，ⅡA-ⅢB期患者27例(29.67%)。临床分期构成也相近。对照组共135例健康人群。入选病例均有完整临床随访资料，全部标本经组织病理学证实。341例样本在训练集和验证集中构成为训练集中有115例患者和69名健康志愿者，而验证集中有91例患者和66名健康志愿者。
1.2 主要试剂和仪器
血清miRNA提取试剂盒(miRNeasy serum kit)，RT反转录试剂盒，荧光定量试剂盒均购自德国Qiagen公司。hsa-mir-15b-5p引物，内参U6由丹麦Exiqon公司合成。Real-Time PCR仪(ABI 7500)购自美国Ambion公司产品。miRNA的浓度由NanoDrop 1000(NanoDrop， Wilmington， DE)测定。液相微珠购自Tellgen生物有限公司。流式细胞分析仪(Accuri C6)购自美国BD公司。
1.3 方法
1.3.1 miRNA的提取 收集术前1～2周血清样本，4℃，离心半径10cm，3000r/min，离心15min以去除细胞碎片。将血清样本保存于-80℃以供使用。每个血清样本取200μl，按照血清miRNA提取说明书提取血清中的miRNA，从吸附柱中脱出总miRNA。检测miRNA溶液的吸光值(D260，D280)，计算miRNA的浓度和纯度，D260/D280介于1.8～2.2方可用于cDNA的合成。
1.3.2 血清miRNA的qRT-PCR的分析 按照试剂盒的产品说明书，用qRT-PCR来测定miRNA的量。用U6作为内参，采用相对定量法ΔCt值来测定。计算目标miRNA的相对表达量，质控采用miRNA试剂盒质控品制作标准曲线，R2>0.95为合格。
1.3.3 荧光量子点液相微珠阵列验证 特定设计miR-15b-5p的DNA探针(QDot-s-s-5′-AAAAAAA-AAAAAAAAAAAAAGTGGAGTGTGAGGTGG-3′)DNA探针的上段为miRNAs的互补序列，下段则为量子点互补序列。探针点样或原位合成于固相基质，列为点阵，成为微芯片。用样品杂交洗涤。miRNAs结合在探针上部。采用单链核酸外切酶ExoVII消化。未结合miRNAs的探针将会被切除，结合了miRNAs的探针仍然固着于固相基质上。然后与DNA-量子点进行杂交。量子点的荧光强度与miRNAs量存正比例相关。量子点的荧光强度可用流式细胞分析仪分析，并用软件(FlowJoe7.6)分析数据。
1.4 统计学处理
所有数据以表示，结果用SPSS 20.0软件进行分析。用t检验和χ2检验来分析miRNA的表达。用约登指数[2]来确定miRNA表达值的最优截断值。构建ROC曲线(receiver operating characteristic)并计算曲线下面积(AUC)来评估miR-15b-5p对于NSCLC的预测能力。将检测结果与病理学金标准做卡方检验，检测敏感性和特异性。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 患者特征
本研究的所有患者均经临床和病理学确诊为NSCLC。所有患者的临床特征总结，见表1。在训练集中，115例患者和69名健康人群的血清样本做miRNA的表达分析。随后在验证集中对91例肺癌患者和66名健康人群做进一步的确认分析。研究发现年龄和性别在肺癌患者和健康对照组中，训练集和验证集中差异无统计学意义。
表1 NSCLC患者在训练组和确认组中的临床特征
Tab.1 Clinical characteristics of patients with NSCLC in the training cohort and the validation cohort
2.2 miRNA的表达
在训练集中对血清中miR-15b-5p的表达水平用qRT-PCR进行检测，发现在肺癌组中miR-15b-5p的ΔCt值要低于对照组，(P<0.01)
为了验证将mir-15b-5p作为NSCLC的诊断标志物的准确性和特异性，另外一个独立的研究组中用荧光量子点液相微珠做一个效度研究。结果发现mir-15b-5p的表达水平在肺癌组中为18742.32±16302.34，在对照组中表达为4204.33±5920.82(P<0.0001)。可见mir-15b-5p的表达水平在肺癌组中明显高于对照组。
2.3 mir-15b-5p的ROC分析
为了评估血清中mir-15b-5p的诊断有效性，计算训练集的ROC曲线，mir-15b-5p的曲线下面积(AUC)是0.784，见图2，mir-15b-5p高表达提示肺癌发生。
图2 mir15b-5p的ROC曲线
Fig.2 The receiver operating characteristic(ROC) for the miR15b-5p
2.4 评测mir-15b-5p的诊断价值
为了确定mir-15b-5b诊断非小细胞肺癌的最佳参考阈值，依据ROC曲线各点对应的灵敏度和误判率，对上述mir-15b-5p的约登指数进行了列表计算，约登指数计算公式为： 约登指数=灵敏度+特异度-1。当约登指数最大时，所对应的miR表达值为最佳诊断界值(及cutoff值)。通过列表计算得出hsa-miR-15b-5p的最佳诊断界值为4108，约登指数为0.549。当miR-15b-5p高于最佳诊断界值判定为阳性。做卡方检验可以得出灵敏度为83.5%，特异度为68.1%，诊断符合率77.4%，见表2。
表2 miR-15b-5p与金标准比较的χ2检验
Tab.2 The chi-square test between the miR-15b-5p and golden standard
肺癌的高死亡率主要由于缺乏有效的早期诊断方法，而早期肺癌患者如果立即进行手术治疗可以显著提高生存率。因此，建立有效的筛查和早期检测技术对提高肺癌患者的生存至关重要。目前临床上常用的早期诊断方法为肿瘤标志物、胸部CT和PET/CT等。肺癌的血清肿瘤标志物检测如CEA、Cyfra21-1等[2]敏感性和特异性均不理想，只能作为治疗监测的参考指标。胸部CT是肺癌最主要的无创性诊断方法，然而肺癌的影像学征象常与某些肺部疾病相似或并存，且直径1cm以下的病灶不易显示，会产生漏诊。PET/CT能反映分子代谢的显像，有助于区分病变的良恶性，但尚无法鉴别1cm左右病灶的良恶性。因此上述的诊断方法对肺癌的早期诊断均存在局限性。
MicroRNAs已经被公认为是生物体内最重要的调控分子之一[1-4]。肿瘤组织中的miRNA已经被证实与肿瘤的发生和发展有关[5-6]。当前研究提示循环miRNA对于NSCLC有潜在的诊断作用[7-8]。
本研究的目的是提高那些术前有肺部小结节的较早期NSCLC患者的诊断。本研究结果显示mir-15b-5p在NSCLC的表达明显上调，即高表达。在训练集和验证集中，肿瘤的大小、淋巴结状态和组织分型差异无统计学意义。miRNA在血清中浓度很低，因此有必要采取高灵敏度的方法去检测它。本研究采取了2种不同的量化分析方法，并使用了2个独立的患者组。本研究用qRT-PCR法检测血清中mir-15b-5p表达水平以确保实验数据的可靠性和重复性，用荧光量子点液相微珠加以验证。由于qRT-PCR的方法是基于一个茎环引物[9]和引物延伸[10]，故有可能导致假阳性。量子点由于具有高淬灭效率和高量子产率，故可以提高检测的灵敏度。荧光量子点液相微珠使miRNA直接贴在半导体上并与DNA探针杂化互补然后由荧光量子点检测，从而提高敏感性和特异性。相对于qRT-PCR，此方法有良好的重复性，并使miRNA分析更有效率。因此，本研究认为荧光量子点对于miRNA的检测具有更好的应用价值。
将miRNA的表达量化定义阳性与阴性，并将结果与病理金标准做卡方检验。结果显示检测外周miRNA的表达情况对于诊断非小细胞肺癌的灵敏度为83.5%，特异度为68.1%，诊断符合率为77.4%，具有一个非侵入性肿瘤生物标志物的性质。
本研究还有一些不足之处，尽管总的结果具有统计学意义，然而样本量并不很充足且都来自同一家医院。考虑到种群的差异，此研究结果是否在全世界具有良好的普遍性还有待进一步研究。虽然血清中miRNA的表达水平的检测被认为是一个很有前景的诊断NSCLC的方法，但是这仍需要进一步的调查和研究才能确定是否可以作为一个可靠的诊断指标并应用于临床。本课题组未来会在多中心、随机、前瞻性的试验中进一步的确认此结果并做出评估。
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Serum microRNA as biomarker for detection of early non-small cell lung cancer
CHEN Hao， FAN Li-hong
(Dept. of Respiration， Tenth People’s Hospital， Tongji University， Shanghai 200072， China)
【Abstract】Objective To investigate expression of circulating miRNA in patients with resectable non-small cell lung cancer(NSCLC). Methods The expression of miR-15b-5p was detected by using quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction(qRT-PCR) in preoperative serum samples of 115 NSCLC patients and 69 healthy controls. The differential expression of miRNA was validated by using fluorescence quantum dots liquid bead array in 91 cases of NSCLC and 66 cases of healthy subjects. Receiver operating characteristic(ROC) analysis was performed and the cut off value of miRNA for diagnosis of NSCLC was selected. The diagnostic value of the miR-15b-5p for NSCLC was analyzed by chi-square test. Results The expression of circulating miR-15b-5p was significantly unregulated in NSCLC patients(P< 0.05). The cut-off value of miR-15b-5p predicted NSCLC with a specificity of 83.5% and sensitivity of 68.1%. Conclusion miR-15b-5p may potentially serve as noninvasive diagnostic biomarkers for diagnosis of resectable NSCLC.
【Key words】non-small cell lung cancer； serum microRNA； noninvasive biomarker； quantum dots
doi：10.16118/j.1008-0392.2016.04.000
收稿日期：2016-04-27
基金项目：上海市科委纳米专项基金(12NM0500800)；同济大学“中央高校基本科研业务费-重点学科交叉类项目”;同济大学“中央高校基本科研业务费-学科交叉类项目”
作者简介：陈 昊(1990—)，男，硕士研究生.E-mail： 348562653@qq.com
通信作者：范理宏.E-mail： Fanlih@aliyun.com
【中图分类号】R 734.1
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2016)04-0051-04