SENL通过mTOR通路抑制前列腺癌的研究

【摘要】目的探讨印楝(Azadirachta Indica)抑制前列腺癌进展的分子机制。方法利用超临界流体萃取技术，制备SENL。不同浓度SENL处理人前列腺癌LNCaP-luc2、PC3细胞24h，细胞计数法和MTS法检测SENL对LNCaP-luc2、PC3细胞生长曲线的影响并计算增殖抑制率；观察细胞形态学改变；AnnexinV法检测早期凋亡率；免疫细胞化学法检测癌细胞增殖、凋亡及侵袭相关蛋白mTOR、s6K70、integrin、FAK、AR等的表达差异，免疫荧光法检测侵袭相关的蛋白表达差异。结果 SENL能抑制前列腺癌细胞的增殖，且成剂量依赖性。经IC50处理的前列腺癌细胞，免疫印迹法检测到mTOR通路的核心成分mTOR、s6K70蛋白的表达显著受到抑制，同时integrin、FAK水平明显下调。结论体外实验中证实SENL通过抑制mTOR及相关通路活性，显著抑制前列腺癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡。

印楝叶(Azadirachta Indica, SENL)为楝科常绿乔木,作为药用植物已有2000多年的历史,全株各部位均可药用。印楝的重要性为美国国家科学院所重视,1992年发表了“印楝—解决全球问题的一种树”的报告[1]。印楝数千年来广泛用于治疗各种急、慢性病，其提取物无毒、无诱变，具有免疫调节、抗感染、抗肿瘤形成的特性[2,3]。其主要生物活性成分是柠檬苦素类化合物，三萜类化合物，无萜类化合物，酚类，黄酮类化合物等[4-5]，能作用多个癌细胞通路[6-8]。本研究通过测定人前列腺癌LNCaP-luc2、PC3细胞系的mTOR信号通路在印楝治疗前后的变化，探讨印楝抑制前列腺癌的分子机制。

1 材料与方法

人前列腺癌细胞株LNCaP-luc2，为雄激素依赖性，稳定转染表达荧光素，购买于Caliper Life Sciences公司。人前列腺癌细胞株PC-3，源于骨转移的前列腺癌，为雄激素非依赖性，购买于美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection， ATCC)。两个细胞系均通过了ATCC的鉴定。

新鲜印楝树叶购自美国国弗罗里达州印楝树农场；RPMI 1640培养基、DMEM培养基、Annexin VFITC/PI双染试剂盒、山羊抗兔二抗(红色,Cy5标记)、山羊抗鼠二抗(绿色,FITC标记)、4%～12% Bis-Tris凝胶(1.5mm厚,10孔)、MES SDS电泳缓冲液(20×)、Transfer Buffer蛋白质凝胶缓冲液(20×)、MagicMarkTM XP Western蛋白标准品、Novex Sharp Pre-Stained Protein Standard染色蛋白标签、样本还原剂(10×)、抗氧化剂、LDS样本缓冲液(4×)均购自美国Life Technologies公司；MTS CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay购自美国Promega公司；细胞裂解缓冲液系统RIPA Lysis Buffer System、兔抗mTOR多克隆抗体、兔抗p-mTOR多克隆抗体、兔抗Integrin β1多克隆抗体购自美国Cell Signaling公司；兔抗P70-S6K多克隆抗体、兔抗p-P70-S6K多克隆抗体、兔抗AR多克隆抗体、鼠抗GAPDH单克隆抗体、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、购自美国Santa Cruz公司；SuperSignal West Pico增强型化学发光底物购自美国Thermo Scientific公司；兔抗p-AR多克隆抗体购自美国Millipore公司；兔抗p-FAK(phospho Y397)多克隆抗体、兔抗FAK多克隆抗体购自美国Abcam公司；鼠抗Integrin β1单克隆抗体购自美国BD公司。

酶联免疫检测仪、NanoDrop分光光度计购自美国Therom公司；流式细胞仪(FACSCalibur)购自美国BD公司；超临界流体萃取系统(Spe-ed SFE-2 System)购自美国Applied Separations公司；共聚焦显微镜(LSM 780)购自德国Carl Zeiss公司。

1.2.1 细胞培养人前列腺癌LNCaP-luc2细胞用含10%胎牛血清RPMI-1640培养液(含青链霉素混合液1%)，人前列腺癌PC-3细胞用含5%胎牛血清DEME培养液(含青链霉素混合液1%)，置于温度为37℃、气体环境为5%CO2、湿度为饱和湿度的培养箱中培养。每4～5d观察细胞生长状况并换液1次，待细胞贴满细胞培养瓶细胞面时，即可用0.05%胰酶消化、传代。

1.2.2 印楝超临界萃取物制备印楝树叶选用同年夏季新鲜树叶，经蒸馏水清洗，风干后粉碎，使用Speed超临界流体萃取仪(参数设置为：压力9000psi 及50℃下静态萃取1h，液态CO2以3L/min动态萃取2h。收集玻璃管置于-49℃干冰和丙酮收集)，萃取出SENL保存于-20℃。以DMSO及乙醇作为溶剂，制备混悬液，应用时进一步稀释，使DMSO浓度低于0.01%。

1.2.3 MTS法检测细胞增殖将生长状况良好的细胞，用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，细胞计数后，按照LNCaP-luc2细胞3×103 cells/孔，PC-3细胞1.5×103 cells/孔接种于96孔板，加入100μl新鲜培养液后，移至37℃、5%CO2气体的培养箱中培养。试验设空白对照组(无细胞仅有培养液)、溶剂对照组(DSMO和培养液)、阴性对照组(细胞和培养液)及试验组。48h后观察细胞贴壁生长良好，按上述试验分组向96孔板内加入SENL，每组设6个重复孔，浓度依次为25、20、12.5、10、6.25、5、3.125、2.5μg/ml。之后将96孔板放入37℃、5%CO2气体、饱和适度的培养箱中继续分别培养24、48、72h。用MTS试剂盒CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay， RPMI及解冻的MTS Reagen按照19∶1的比例配制MTS溶液，每组试验结束后，加入MTS溶液100μl/孔，将其放入培养箱中继续培养30min后，酶标仪测定其490nm下的吸光度值(D490)。计算出不同SENL浓度下平均吸光度值及相对空白对照的百分比，作为细胞相对增殖率，以SENL浓度为横坐标，肿瘤细胞相对增殖率为纵坐标，绘制曲线图，计算出半数有效浓度IC50。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡取生长状况良好的PC-3及LNCaP-luc2细胞，培养于10cm细胞培养皿中。用SENL处理细胞，阴性对照组加入等体积培养液，另设空白对照孔(只加培养液)，分别收集24、48、72h的细胞，细胞计数后收集1×105个细胞，1000r/min，离心半径20cm 37℃离心5min，小心吸弃上清,用PBS漂洗细胞2遍,离心同上。弃上清后，每个样本中加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。加入10μl碘化丙啶(PI)染色液，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育30min，随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可重悬细胞2～3次以改善染色效果。随即流式细胞仪检测，结果判断： Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

正常活细胞处于左下象限；早期调亡细胞处于右下象限；晚期调亡细胞处于右上象限；坏死细胞处于左上象限。

1.2.5 Western免疫印迹法检测蛋白表达取经过IC50 SENL处理过的LNCaP-luc2及PC-3细胞，裂解液裂解30min后，以超声细胞粉碎仪充分粉碎，提取细胞总蛋白，使用NanoDrop分光光度计以BCA法测定蛋白浓度，根据浓度校准计量后将样品用70℃沸水使蛋白变性，冷却至室温上样于4%～12% Bis-Tris 凝胶(1.5mm厚,10孔)并加入缓冲液及抗氧化剂后电泳，“三明治”法转膜完毕后，封闭PVDF印迹膜，将一抗4℃冰箱中过夜孵育；次日二抗转染、显影及定影后X胶片用凝胶成像分析软件进行分析，测定所需条带的分子量和净光密度值。

1.2.6 免疫荧光染色检测蛋白表达取生长状况良好的PC-3及LNCaP-luc2细胞，培养于1.5cm消毒的玻片上，玻片置入6孔板内的培养液中培养24h。用IC50 SENL处理细胞24、48、72h，阴性对照组加入等体积培养液，另设空白对照孔(只加培养液)，福尔马林固定后透化处理，先后加入一抗及二抗孵育后，共聚焦显微镜观察结果。

本研究相关统计分析由SPSS 13.0软件完成，数据用

表示，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用One-Way ANOVA分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

不同浓度的SENL作用24h后,LNCaP-luc2与PC-3前列腺癌细胞增殖率分均随SENL浓度增大而减小。不同浓度的SENL对前列腺癌细胞的抑制率与阴性对照组(0μg/ml)比较,差异有统计学意义(P<0.01);不同浓度SENL对前列腺癌细胞增值率的组间两两比较,组之间差异均有统计学意义(P<0.01)，见图1。

图1 SENL对前列腺癌细胞在体外增殖抑制的剂量效应关系
Fig.1 MTS assay evaluate the viability of PC3 and LNCaP-luc2 oells treated with SENL
与PC3组相比，*P<0.05

应用SPSS 13.0软件作probit回归分析，计算出SENL处理前列腺癌细胞24h后，不同细胞的IC50。结果显示，LNCaP-luc2 IC50为12μg/ml；PC-3 IC50为15μg/ml；SENL对前列腺癌细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性。

IC50 SENL作用前列腺癌细胞,对比12、24h后,早期凋亡细胞比例LNCaP-luc2从18.1%升至26.5%，PC-3从4.72%升至12.2%，晚期调亡细胞比例LNCaP-luc2从6.25%升至8.65%，PC-3从4.66%升至13.7%，呈时间及计量依赖性,且均高于阴性对照组相应的各期细胞调亡率，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2、3。

图2 SENL诱导LNCaP-luc2细胞调亡结果
Fig.2 LNCaP-luc2 cells apoptosis result
A：流式细胞图；B： SENL诱导不同时间细胞调亡率比较

图3 SENL诱导PC3细胞调亡结果
Fig.3 PC3 cells apoptosis result
A：流式细胞图；B： SENL诱导不同时间细胞凋亡率比较

Western 印迹法检测显示，与对照组相比，SENL可以明显下调mTOR、p-mTOR的表达(P<0.01)，同时还可以明显下调S6K70、p-S6K70、AR、FAK、p-FAK以及Integrin β1的表达(P<0.01)，说明SENL通过抑制mTOR及其上、下游相关蛋白的表达及活化水平发挥作用，见图4。

图4 SENL抑制前列癌细胞系蛋白的表达
Fig.4 Western Blot result of PC3 and LNCaP-luc2 cells treated with SENL

LNCaP-luc2、PC-3对照组，可见FAK及Integrin形成的局部粘着斑聚集在细胞伸出的伪足边缘；LNCaP-luc2以及PC-3 SENL治疗组，细胞形态改变失去极向，伪足消失，FAK与Integrin分离，局部粘着斑消失，见图5。SENL可以明显抑制粘着斑激酶FAK以及整合素Integrin β1的表达，并且明显抑制两者在细胞边缘的聚集进而抑制粘着斑的形成，说明SENL通过抑制粘着斑激酶表达及活化水平发挥抑制前列腺癌细胞迁移的作用。

图5 SENL抑制列腺癌细胞粘着斑的免疫荧光结果
Fig.5 lmmunofluoresence of PC3 and LNCaP-luc2 cells treated with SENL
红： FAK;绿： Integrin β1;蓝： DAPI

3 讨论

在众多信号传导通路中，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR)发挥着枢纽核心的作用，能整合细胞内和细胞外信号，调节细胞新陈代谢，生长，增殖和存活，参与细胞增殖、分化、迁徙及蛋白质合成等过程。mTOR为不典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分子量为289000，由2549个氨基酸组成[9]，一方面，mTOR接受来自上游的信息，如细胞外生长因子，细胞外营养素等的刺激;另一方面，mTOR将信息进一步传递给下游，影响细胞周期的进展，导致细胞分化。作为细胞通路的枢纽，mTOR上呈PI3K/AKt通路及TSC1/2通路的信号传递及调节，并与FAK通路存在交叉对话，下启p-s6k70、S6及eIF4和4E-BP1的表达，进而影响细胞的增殖、分化。

目前，比较普遍的认为mTOR信号通路主要由4种影响因子而活化，即生长因子与胰岛素、营养因素(如氨基酸)、能量(如ATP/ADP)及环境压力(如缺氧)。胰岛素和多种生长因子的信号刺激可通过细胞表面受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTKs)，经PI3K[12-13]与Ras[13-14]进行传导。PI3K活化后进一步激活下游的Akt，当Akt被彻底激活后，一方面其可以使mTOR的丝氨酸2448位点直接磷酸化，另一方面，其可以阻断结节性硬化复合物2(tuberous sclerosis complex 2，TSC2)和TSC1所构成的复合体，通过这两种方式，使mTOR得以激活[15]。激活的mTOR则可以磷酸化包括P70-S6K和4E-BP1在内的下游分子。核糖体蛋白P70-S6K的磷酸化，不仅增强了一些与编码核糖体蛋白和翻译调节蛋白相关的mRNA的翻译功能，而且使细胞周期素(cyclin)、细胞周期依赖性蛋白激酶4(CDK4)等细胞周期主要蛋白的表达增加，细胞周期循环加快，致使细胞周期向G1期发展，促进细胞的增殖和分化，从而促使前列腺癌的发生和发展。4E-BP1和真核细胞翻译始动因子4E(eIF-4E)形成复合体来抑制相关蛋白的表达。当4E-BP1被mTOR磷酸化后，4E-BPI则摆脱了eIF-4E的束缚作用，致使4E-BPI对蛋白表达的抑制作用得以解除，却增加了如细胞周期蛋白D1, Rb蛋白、缺氧诱导因子-lα, VEGF等促进细胞生长蛋白的表达，使细胞周期从G1期向S期进展，使细胞存活[16]。

去势抵抗性前列腺癌(castrate-resistant prostate cancer，CRPC)的发生、发展与PI3K/Akt/mTOR信号通路的异常关系密切，雄激素非依赖性前列腺癌细胞表达大量活化的PI3K和Akt[17]，而PI3K和Akt的活化，又可经过磷酸化作用调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、细胞周期的运行及肿瘤血管的形成，从而加快了雄激素非依赖性前列腺癌的发生、发展。另有研究表明，前列腺癌Gleason评分越高，p-Akt蛋白表达水平越高[18]，且p-Akt表达的上调可促进前列腺癌细胞侵袭转移[19]。有报告称[20]42%的原发性前列腺癌和100%的转移性前列腺癌中PI3K/Akt/mTOR信号通路各组分，发生突变、表达改变及拷贝数的改变。

雄激素受体(AR)蛋白的正确翻译、稳定性的维护及转录活性的调节可被Akt信号通路正性或者负性调控，另一方面，AR能够经过基因转录途径/非转录基因途径抑制/激活Akt信号通路[21]。因此，雄激素与AR的相互作用及AR与PI3K/Akt信号通路的互相作用，可能在前列腺癌的发生、发展及其向CRPC进展中发挥了至关重要作用。

FAK除调控细胞生长、迁移外,还与动物的生长发育密切相关。当FAK接收来自整合素、纤连蛋白(fibronectin, FN)等的信号刺激被激活后,与Src形成复合体,其Y397可通过PI3IC的SH2结构域直接与之结合,进而激活PI3K-Akt通路。PI3K-Akt的活化可通过TSC2-mTOR途径调节细胞生长、基因表达[22],也可参与Rac-JNK通路而调节基因表达[23]。FAK可通过PI3K/Akt途径调控TSC2/mT0R的活性，Gan等[22]通过细胞内共表达和免疫共沉淀技术证明了这种可能,即FAK与TSC2(Tuberin)可以形成蛋白多聚体,进而通过mTOR信号通路激活S6K1,促进细胞生长。

本研究发现，SENL能够显著抑制mTOR及其下游关键靶点蛋白的表达及活化。国外学者的研究[24]证实在前列腺癌细胞系PC-3及LNCaP-luc2中，印楝提取物能够抑制PI3K的表达以及Akt的激活。本研究中发现与mTOR的上游PI3K/Akt通路存在交叉对话的FAK/integrin通路，受到SENL显著的抑制；SENL可以显著抑制雄激素受体AR的表达及磷酸化。由此说明，SENL通过抑制mTOR及其周围路径的关键分子的表达及活化，发挥抗前列腺癌的作用，特别对于晚期前列腺癌的作用，作用显著。

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【Abstract】Objective To investigate the effects of supercritical extract ofAzadirachta Indica(neem) leaves (SENL) on proliferation of prostate cancer cells and its mechanism. Methods Supercritical extract of fresh neem leaves was prepared using the Speed SFE-2 System. Androgen dependent prostate adenocarcinoma LNCaP-luc2-cells and androgen independent PC3 cells were treated with different concentrations of SENL(25,20,12.5,10,6.25,5，0mg/ml) for 24 hours. Proliferation of LNCap-luc2 and PC3 cells were determined by MTS-formazan reduction method. LNCaP-luc2 and PC3 cells were treated with IC50 concentrations of SENL (12 or 15mg/ml, respectively) and stained with annexin-V FITC and propidium iodide (PI), then analyzed by flow-cytometry. The expressions of mTOR, s6K70, integrin， FAK, androgen receptor were dected by Western blotting. LNCaP-luc2 and PC3 cells were stained with immunofluorescence and observed under confocal microscope. Results SENL exhibited growth of LNCaP-luc2 and PC3 cell in a dose-dependent manner. SENL induces apoptosis of LNCaP-luc2 and PC3 cells. Western blotting analysis showed that the levels of mTOR, S6K70,androgen receptor, integrin β1 and phosphorylation of mTOR, S6K70, FAK were reduced with SENL treatment. Immunofluorescence for integrin β1 and FAK further demonstrated the suppression of formation of the focal adhesions in LNCaP-luc2 and PC3 cells after SENL treatment. Conclusion Supercritical extract of Azadirachta Indica (Neem) leaves can inhibit proliferation and induce apoptosis of prostate cancer cells in vitro, in which mTOR pathway may be involved.

作者简介：吴强(1978—)，男，主治医师，硕士.E-mail: wuqiang@tongji.edu.cn

SENL通过mTOR通路抑制前列腺癌的研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

2 结果

3 讨论