曹帆帆1， 徐莉敏2， 王 莹1， 彭 彬1， 张 雪1， 张登海1
(1. 第二军医大学附属公利医院中法合作中心实验室，上海 200135； 2. 第二军医大学附属公利医院检验科，上海 200135)
【摘要】目的 观察雷公藤红素对β淀粉样蛋白1-42导致SH-SY5Y细胞Tau蛋白异常磷酸化的影响及其可能机制。方法 用 Aβ1-42刺激SH-SY5Y细胞，建立Tau蛋白异常磷酸化的细胞模型。加入雷公藤红素干预，Western印迹法检测Aβ1-42导致Tau蛋白异常磷酸化的变化，同时检测p-NF-
B表达情况；siRNA法下调TLR4表达，Western印迹法检测Aβ1-42导致的Tau蛋白异常磷酸化的变化情况；同时观察下调TLR4后，Aβ1-42刺激对p-NF-B表达的影响。结果 Aβ1-42刺激SH-SY5Y细胞，导致Tau蛋白Ser199/202、Ser396位点的磷酸化水平增加，而雷公藤红素能降低这两个位点磷酸化水平；Aβ1-42导致细胞p-NF-B表达增加，雷公藤红素干预后p-NF-B表达下调，且NF-B抑制剂BAY11-7082同样能降低Aβ1-42导致的Tau蛋白异常磷酸化；下调TLR4表达，Aβ1-42导致的Tau蛋白异常磷酸化及p-NF-B表达下降。结论 雷公藤红素降低Aβ1-42导致的SH-SY5Y细胞Tau蛋白异常磷酸化可能与其抑制TLR4/NF-B通路活性有关。
【关键词】雷公藤红素； β淀粉样蛋白； Tau蛋白； Toll样受体4； p-NF-B
Tau蛋白主要功能是维持神经元微管系统稳定，Tau蛋白的功能受其磷酸化状态影响。Tau蛋白有数十个可被磷酸化位点。正常成熟脑中Tau蛋白分子含2～3个磷酸基。Tau蛋白与微管蛋白结合的结构域，存在可被磷酸化的位点，这些位点(以及结合结构域以外若干个位点)被异常磷酸化后，Tau蛋白与微管蛋白的结合力下降，Tau蛋白解离，丧失维持微管稳定的作用，神经元微管结构广泛破坏[1-2]。Tau蛋白异常磷酸化所引起的神经元退行性病，包括阿尔茨海默症等(Alzheimer’s disease, AD)[3]，抑制Tau蛋白异常磷酸化，是神经元退行性病治疗领域重要研究方向之一。
研究[4]发现，天然化合物雷公藤红素能显著抑制小鼠脑神经元Tau蛋白异常磷酸化，但机制不明。雷公藤红素为核转录因子-
B(nuclear transcription factor-B, NF-B)活化抑制剂，能抑制Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)活性[5]。本研究用凝聚态Aβ1-42 作用于SH-SY5Y细胞,建立Tau蛋白异常磷酸化的细胞模型,观察雷公藤红素抑制Tau蛋白磷酸化是否通过阻断TLR4/NF-κB通路这一途径。
1.1 试剂与仪器
DMEM/F-12培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Cambrex公司。β淀粉样蛋白多肽片段1-42(Aβ1-42)购自美国Sigma公司。雷公藤红素(Cel)购自美国Sigma公司(C0869)，DMSO溶解，贮存浓度为100mmol/L，工作浓度为600nmol/L，用培养基临时配制。Tau磷酸化抗体Ser199/Ser202抗体(44768G)、Ser396抗体(44750G)均购美国Invitrogen公司。p-NF-B抗体(8242)、GAPDH抗体(2118)均购自美国Cell Signaling公司。TLR4转染试剂盒购自上海吉玛公司。NF-B抑制剂BAY11-7082、二喹啉甲酸(bicincho ninic， BCA)蛋白检测试剂盒及化学发光底物(enhanced chemiluminescent， ECL)试剂盒均购自江苏碧云天生物技术公司。辣根过氧化氢酶标记二抗购自美国eBioscience公司。化学成像发光系统购自英国Syngene公司。
1.2 细胞培养
SH-SY5Y细胞购自中科院上海细胞库。DMEM/F-12培养基，分别加入10%胎牛血清(Cambrex公司)，1%青霉素-链霉素，37℃，5% CO2培养。取对数生长期的细胞进行实验。
1.3 Tau蛋白异常磷酸化细胞模型建立
Aβ1-42用DMSO溶解，浓度为20mg/ml，溶解后加入PBS，浓度为1mg/ml。37℃孵育3d，使其成为凝集态。取贴壁生长良好的SH-SY5Y细胞，按1×106/ml种于24孔培养板中，每孔1ml。待细胞长满时，弃培养板中原有培养基，按所需浓度加入1ml Aβ1-42，继续培养6h。
1.4 细胞的药物处理
取贴壁生长良好的SH-SY5Y细胞，按1×106/ml种于24孔培养板中，每孔1ml。待细胞长满时，弃培养板中原有培养基，每孔加入1ml含雷公藤红素(终浓度为600nmol/L)或BAY11-7082(终浓度为20μmol/L)及Aβ1-42的完全培养基，对照组加入同浓度DMSO，处理6h。
1.5 siRNA转染
siRNA-TLR4及相应的control siRNA由上海吉玛公司设计合成；按Lipofecter脂质体转染试剂盒说明，将siRNA-TLR4或其相应的control siRNA转染至细胞中。
1.6 Western 印迹法检测Tau蛋白异常磷酸化
将处理好的细胞收集并用冷PBS洗1遍后，加入一定量蛋白裂解液裂解，提取蛋白，并按蛋白浓度测定试剂盒说明书进行蛋白浓度测定。取一定量蛋白按体积比5∶1，加入5×蛋白上样缓冲液于100℃煮3～5min。待样品冷却至室温后，上样至浓度为8%～10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳、转膜。膜经封闭液在室温下封闭1.5h后，与针对Tau不同磷酸化位点的抗体在4℃冰箱中孵育过夜，经洗涤液洗3次，每次10min后，将膜与相应的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗在常温下孵育1.5h，再次洗涤3次后，按照ECL试剂盒说明书进行显色，并用化学成像发光系统对条带进行获取及分析。
1.7 统计学处理
应用SPSS 17.0统计软件对资料进行统计分析,每组实验重复3次，用组间t检验对结果进行统计分析，以P<0.05为差别有统计学意义。
2.1 不同浓度Aβ1-42刺激对Tau蛋白磷酸化表达的影响
与对照组相比，用终浓度为20μmol/L凝聚态Aβ1-42处理细胞6h后，Tau蛋白pSer199/202、pSer396表达明显增加(P<0.01)。终浓度为10μmol/L 的Aβ1-42处理细胞，Tau蛋白磷酸化位点表达无明显变化，见图1。
图1 不同浓度Aβ1-42处理后SH-SY5Y细胞Tau蛋白磷酸化位点的表达
Fig.1 Aβ 1-42 induced Tau hyperphosphorylation at different concentrations in SH-SY5Y cells
对照组(con)为DMSO组。A： Western 印迹法检测条带图；B： 统计图；与对照组相比，**P<0.01
2.2 雷公藤红素对Tau蛋白磷酸化表达的影响
Aβ1-42处理细胞后，Tau蛋白pSer199/202、pSer262表达均明显增加，而同时加入雷公藤红素(终浓度为600nmol/L)及Aβ1-42(终浓度为20μmol/L)时，pSer199/202表达明显下降(P<0.01)、pSer396表达同样下调(P<0.05)，见图2。
图2 Aβ1-42刺激及用雷公藤红素干预后，SH-SY5Y细胞Tau蛋白磷酸化位点的表达
Fig.2 Effects of tripterine onAβ1-42 induced Tau hyper-phosphorylation in SH-SY5Y cells
A： Western 印迹法检测条带图；B： 统计图；与Aβ组比较，*P<0.05，**P<0.01
2.3 雷公藤红素对p-NF-B表达的影响
Aβ1-42处理细胞后，p-NF-B表达明显增加(P<0.01)，而同时加入雷公藤红素及Aβ1-42时，p-NF-B表达显著下降(P<0.01)，见图3。
图3 Aβ1-42刺激及用雷公藤红素干预后，SH-SY5Y细胞p-NF-B的表达
Fig.3 Effects of Tripterine on Aβ1-42 induced p-NF-B increasing in SH-SY5Y cells
A： Western印迹法检测条带图；B： 统计图；与Aβ组比较，**P<0.01
2.4 NF-B抑制剂BAY11-7082对Tau蛋白磷酸化表达的影响
Aβ1-42处理细胞后，Tau蛋白pSer199/202、pSer396表达均明显增加，而加入BAY11-7082干预后，pSer199/202与pSer396表达均下调(P<0.05)，见图4。
2.5 下调TLR4蛋白表达对Tau蛋白磷酸化的影响
下调TLR4蛋白表达后，用Aβ1-42处理细胞，Tau蛋白pSer199/202及pSer396表达均明显下降(P<0.05)，见图5。
2.6 下调TLR4蛋白表达对p-NF-B表达的影响
Aβ1-42处理细胞后，p-NF-B表达明显上升(P<0.01)，而下调TLR4蛋白后，p-NF-B表达下调(P<0.05)，见图6。
图4 Aβ1-42刺激及用BAY11-7082干预对SH-SY5Y细胞Tau蛋白磷酸化位点的影响
Fig.4 Effects of BAY11-7082 on Aβ1-42 induced Tau hyperphosphorylation in SH-SY5Y cells
A： Western印迹法检测条带图；B： 统计图；与Aβ组比较，*P<0.05
图5 下调TLR4蛋白对Aβ1-42处理SH-SY5Y细胞Tau蛋白各磷酸化位点的影响
Fig.5 Effects of knocking down TLR4 on Aβ1-42 induced Tau hyperphosphorylation in SH-SY5Y cells
Aβ组为用control siRNA后，加Aβ1-42处理。A： Western印迹法检测条带图；B： 统计图；与Aβ组比较，*P<0.05
图6 下调TLR4蛋白对Aβ1-42处理SH-SY5Y细胞p-NF-B的影响
Fig.6 Effects of knocking down TLR4 on Aβ1-42 induced p-NF-B increasing in SH-SY5Y cells
对照组(con)为加control siRNA后，用DMSO处理；Aβ组为用control siRNA后，加Aβ 1-42处理。A： Western印迹法检测条带图；B： 统计图；*P<0.05；**P<0.01
Tau蛋白异常磷酸化后，神经元微管结构被破坏，过度磷酸化的Tau蛋白自发聚集形成双股螺旋丝(paired helical filaments， PHF-tau)，进一步发展为神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NT)[6]。Tau蛋白Ser199/202、Ser396位点的过度磷酸化在AD发生、发展中的作用尤为重要。可溶性Aβ沉积后,聚集为AD脑中常见的淀粉样斑块,从而导致神经细胞毒性损伤及神经退行性变。Aβ在体内外能诱导Tau蛋白磷酸化，从而破坏微管的稳定性，损伤轴突转运，引起神经元死亡[7]。本研究用凝聚态Aβ1-42作用于SH-SY5Y细胞，建立Tau蛋白高度磷酸化模型。终浓度20μmol/L的Aβ1-42作用6h后，Tau蛋白磷酸化位点Ser199/202、Ser396表达均明显增加。
雷公藤红素是三萜类天然化合物，由我国科学家于20世纪30年代，首次从中药雷公藤中提取到。研究[4]发现，肝脏切除手术导致小鼠脑神经元Tau蛋白高度磷酸化，出现术后认知功能障碍，而雷公藤红素能显著抑制Tau磷酸化，改善术后认知功能。本研究结果表明，在Tau蛋白异常磷酸化的体外模型细胞中，雷公藤红素处理后，pSer199/202与pSer396表达明显下降。
TLR4是天然免疫系统识别病原微生物的主要受体，在AD、帕金森病(Parkinson disease，PD)和肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等神经变性疾病的发生发展中发挥着重要作用[8]。目前研究表明，Aβ沉积诱导的炎性反应是导致AD发病的主要机制之一[9]。TLR4/NF-B信号通路是近年来发现与抗炎免疫机制紧密相关的信号传导通路。NF-B位于TLR4下游，通过信号传导，促使NF-B从细胞质转位进入细胞核，最终导致炎症因子大量释放。本研究显示，雷公藤红素能抑制Aβ1-42导致的NF-B活化，且NF-B抑制剂BAY11-7082干预可明显降低Aβ1-42导致的Tau蛋白异常磷酸化，表明雷公藤红素降低Aβ1-42导致的Tau蛋白异常磷酸化可能与其抑制NF-B活化有关。Reed-Geaghan等[10]发现，Aβ活化NF-B通路需要TLR4参与。本研究发现，下调TLR4蛋白表达，NF-B活化同样受到抑制，Tau蛋白pSer199/202及pSer396表达均明显下降。Lee等[5]研究显示，雷公藤红素通过阻止LPS与TLR4/MD2复合体的结合，从而降低TLR4活性[5]。这表明雷公藤红素可能通过降低TLR4活性，抑制TLR4/NF-B信号通路，从而降低Aβ1-42导致的Tau蛋白异常磷酸化。
综上所述，雷公藤红素能明显抑制Aβ1-42导致的Tau蛋白异常磷酸化，其机制可能与其抑制TLR4/NF-B信号通路有关。
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Effects of Tripterine on Tau hyperphosphorylation induced by β-amyloid peptides in cultured SH-SY5Y cells
CAO Fan-fan1, XU Li-min2, WANG Ying1, PENG Bin1, ZHANG Xue1, ZHANG Deng-hai1
(1. Sino-French Cooperative Central Lab, Shanghai Gongli Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200135, China; 2. Clinical laboratory, Shanghai Gongli Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200135, China)
【Abstract】Objective To investigate the effects and mechanisms of tripterine on Tau hyperphospho-rylation induced by β-amyloid in SH-SY5Y cells. Methods The effects of tripterine on the changes of Tau hyperphosphorylation and p-NF-B induced by β-amyloid in SH-SY5Y cells were measured by Western blotting after TLR4 knocking down by siRNA. Results Compared with the control group, the expressions of Tau pSer199/202 and pSer396 were markedly increased after the induction of Aβ1-42, while the hyperphosphorylation of Tau pSer199/202 and pSer396 induced by Aβ1-42 was decreased by tripterine. The increasing of p-NF-B expression induced by Aβ1-42 was decreased after the treatment of tripterine, and NF-B inhibitor BAY11-7082 also decreased the hyperphosphorylation of Tau pSer199/202 and pSer396 induced by Aβ1-42. The hyperphosphorylation of Tau pSer199/202 and pSer396 and p-NF-B expression induced by Aβ1-42 was decreased after knocking-down TLR4. Conclusion Decreasing of Tau hyperphosphorylation by Tripterine is partially via inhibiting the TLR4/NF-B signaling pathway．
【Key words】tripterine; β-amyloid; Tau; Toll like receptor 4; p-NF-B
doi：10.16118/j.1008-0392.2016.04.007
收稿日期：2016-04-18
基金项目：上海市浦东新区卫生系统优秀青年医学人才培养计划(PWRq2013-11)；上海市青年科技英才扬帆计划(15YF1410800)
作者简介：曹帆帆(1983—)，女，主管技师，硕士.E-mail： yffs.c@163.com
通信作者：张登海.E-mail： shanghai_zhang@hotmail.com
【中图分类号】R 741
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2016)04-0036-04