表示，样本间均数比较采用方差分析和独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。杨 波1， 温晓飞2， 刘 辉1， 刘 峰1, 邓晓俊1, 廖国强1
(1. 上海健康医学院附属周浦医院泌尿外科，上海 201318； 2. 同济大学附属东方医院泌尿外科，上海 200120)
【摘要】目的 探讨miR-1721靶向抑制CD44的表达及对前列腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响。方法 构建CD44 mRNA 3′-非翻译区(3′-UTR)的荧光素酶报告载体系统，通过荧光素酶系统确定miR-1721对CD44 mRNA 3′-UTR的靶向关系；脂质体转染法将miR-1721模拟物转入前列腺癌PC-3细胞中，Western印迹法检测转染后CD44蛋白表达水平的改变；MTT法检测miR-1721mimics对PC-3细胞增殖能力的影响，Transwell小室法检测其对肿瘤细胞袭侵袭能力的影响；通过干细胞成球实验检测miR-1721mimics对前列腺癌干细胞样微球体形成的影响。结果 miR-1721能特异性地与CD44 mRNA 3′-UTR结合，抑制其荧光素酶的活性，干细胞标记基因CD44是miR-1721的靶基因。过表达miR-1721的PC-3细胞中CD44蛋白表达水平明显降低，可显著抑制PC-3细胞的侵袭能力，同时过表达CD44可负调控miR-1721对PC-3细胞增殖和侵袭能力的影响；干细胞成球实验证实，miR-1721能显著抑制前列腺癌细胞PC-3干细胞的微球体形成能力。结论 miR-1721通过靶向调控CD44的表达而抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭能力及干细胞的形成能力。
【关键词】前列腺肿瘤； CD44； 干细胞标记基因； miRNAs
近年来，人们对干细胞的研究显示肿瘤起源于肿瘤干细胞[1]。肿瘤干细胞具有自我更新能力和分化潜能，是肿瘤细胞生长、增殖和远处转移的根源[2]。肿瘤干细胞具有正常干细胞的自我保护特性，如DNA损伤修复、高表达多药耐药型膜转运蛋白、处于相对静止状态以及拥有特定的细胞微环境，均能使其逃逸现有的肿瘤治疗手段，最终导致肿瘤复发和转移[1,3]。
miRNAs是一类内源性的19～35个核苷酸的小分子物质，主要在转录后水平调控基因的表达[4]，其自我更新能力可能是肿瘤发生、耐受和复发的直接原因。Chikamatsu等[5]在胶质母细胞瘤中的研究表明，miRNAs在未分化的干细胞中存在与肿瘤细胞相似的异常表达，这些异常表达的miRNAs通过调节肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)相关通路促进其自我更新。在造血干细胞中，高表达的miR-17、miR-92激活的Hh信号通路，加速淋巴瘤的恶性发展[6]。在结直肠癌中，高表达的miR-135a、miR-136b和APC的下调使得β-catenin上调，从而激活Wnt通路，促进结、直肠癌CSCs的自我更新，导致肿瘤发展与转移[7]。
有研究显示，前列腺癌起源于前列腺基底干细胞。Maitlant等[8]首先用免疫磁珠和胶原黏附法分选出CD44+整合素α2β1+前列腺细胞，发现这些细胞具有干细胞特性。Lang等[9]证实了前列腺肿瘤干细胞的存在。前列腺干细胞和前列腺肿瘤干细胞均存在于CD44+的基底细胞内，表现增殖潜力[10]。本研究通过miR-1721靶向调控CD44的表达对前列腺癌细胞增殖和侵袭能力进行研究，探讨miR-1721在前列腺癌肿瘤干细胞中的作用及分子机制。
1.1 细胞来源
PC-3细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，用含10%胎牛血清、1%双抗的RPMI 1640培养基培养于37℃、5% CO2的培养箱中，收集对数生长期的细胞进行后续操作。分为miR-1721模拟物(mimics)组和阴性对照组。根据LipofectAMINE 2000说明书进行细胞转染。转染后72h收集细胞进行RNA和蛋白质抽提实验。待细胞生长处于对数期进行转染siRNA。
1.2 主要试剂及仪器
miR-1721模拟物(mimics)和阴性对照购自上海艾博斯生物科技有限公司产品；10%胎牛血清(Cata： C2027050)购自美国Gibco公司；双抗(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，Cata： 15140-148)购自美国Invitrogen公司；CD44兔抗人多克隆抗体购自英国Abcam公司；工作液稀释比例为1∶100。铺有基质胶的Transwell侵袭小室购自美国Biosciences公司；Cy3标记的山羊抗兔二抗、SP免疫荧光化学试剂盒购自上海市艾博斯生物科技有限公司；MTT细胞增殖检测试剂盒购自美国Promega公司;LipofectAMINE-2000购自美国Invitrogen公司；普通实验室冰箱、温育箱、温盒和恒温振荡器等均由周浦医院中心实验室提供。
1.3 CD44 mRNA 3′-UTR荧光素酶报告载体的构建
根据反转录试剂盒说明进行操作。根据CD44 mRNA 3′-UTR的序列特点，设计末端带Spe Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的特异性引物序列如下。上游引物： 5′-UUUUUCAGAUGCUUCUGGGAGAC-3′，下游引物： 5′-GUGACCAUGUUCCCAACCCUCU-3′。以正常人血细胞DNA为模板，PCR扩增CD44 mRNA 3′-UTR的部分片段(第564～570位碱基)。将PCR产物及preMIR-Report-luciferase报告载体(Promega公司)分别用限制性内切酶SpeⅠ和Hind Ⅲ双酶切处理后，通过纯化、连接和转化等常规步骤进行构建，挑取阳性克隆并测序鉴定。
1.4 荧光素酶活性的检测
将荧光素酶报告载体CD44-Wt和CD44-Mut分别与miR-1721mimics或miR-1721inhibitor两两组合共转染前列腺癌PC-3细胞，转染步骤参见LipofectAMINE-2000操作说明；miRNA-1721的终浓度为40μmol/L，转染细胞数为1×105个。转染48h后，收获细胞。按双荧光素酶活性检测试剂盒说明书处理细胞并在单光子检测仪上检测细胞荧光素酶活性。计算相对荧光素酶活性： 荧光素酶活性= 萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。
1.5 MTT法检测细胞增殖能力
取对数生长期PC-3细胞，以1×105/ml接种于96孔板中，每孔100μl。培养36h后，转染miRNA mimics和NC，转染8h后更换含10%胎牛血清培养基，分别于24、48、72、96h进行增殖活力检测(5个复孔)。药物组在转染后24h加入多胺类似物二乙基去甲精胺(DENSPM)，终止培养前每孔加入10μl的MTT溶液继续培养，同时设空白对照组(加10μl培养基)，3h后酶标仪检测490nm处吸光度值(D490)。抑制率=(对照组D490-实验组D490)/对照组D490×100%。
1.6 Transwell细胞侵袭实验检测转染后PC-3细胞侵袭能力
将铺有基质胶的Transwell小室预热至37℃，消化转染后的各组细胞，用无血清培养液洗涤细胞3次，无血清培养液重悬细胞后计数，调整细胞密度为1×105/ml。在Transwell下室加入1ml含10%胎牛血清的培养液。在Transwell上室加入300μl细胞悬液，37℃培养36h。取出Transwell小室，试纸拭去上室侧膜的细胞，PBS洗涤后，用4%的多聚甲醛溶液固定细胞10min，结晶紫染色，光学显微镜下观察细胞染色情况并照相，随机选取5个高倍视野(×100)进行细胞计数，计算平均值。
1.7 干细胞成球实验
将人前列腺癌PC-3细胞消化后计细胞数，以1×105个的细胞密度接种至6孔板中，然后加入干细胞培养液： 含2%胎牛血清、胰岛素10μg/ml、表皮生长因子(epidermal growthfactor，EGF)20ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)20ng/ml、B27 20ng/ml和氢化可的松500ng/ml。置于37℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱内培养36h，分别转染miR-1721mimics以及miR-1721inhibitor，培养72h后在倒置光学显微镜下观察干细胞成球的大小及数量(×200倍)并拍照。
1.8 Western印迹法检测相关蛋白的表达
待细胞转染72h后，收集各转染组细胞，加入RIPA裂解液抽提总蛋白，BCA法进行蛋白质定量。各取对照组和转染组总蛋白30～50μg进行SDS-PAGE电泳，转膜，5% BSA封闭1h，一抗4℃孵育过夜。加入二抗(1∶5000)，37℃孵育1h，PBS洗涤3次，Odessy分析仪上机扫膜分析。
1.9 统计学处理
应用SPSS 18.0软件进行统计学分析。实验正态分布数据以表示，样本间均数比较采用方差分析和独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 双荧光素酶报告验证miR-1721和CD44的靶向关系
将荧光素酶活性与阴性对照组进行比较，结果显示共转染pMIR-REPORT及miR-1721mimics的PC-3细胞组荧光素酶值是转染pMIR- Report及mimics NC组的PC-3细胞组荧光素酶值的43.6%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。荧光素酶活性检测结果显示，在共转染miR-1721 mimics和重组质粒的CD44-Wt或CD44-Mut的PC-3细胞中，miR-1721 mimics对突变型pCD44-Mut组中的荧光素酶活性强度无明显影响，但在野生型pCD44-Wt组中荧光素酶的活性强度差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。
图1 双荧光素酶报告系统验证miR-1721靶向抑制人前列腺癌PC-3细胞中CD44的表达结果
Fig.1 Dual luciferase reporter system show the miR-1721 validated the expression of CD44 in human prostate cancer PC-3 cell line
A： mir-1721的结合位点CD44 mRNA 3′-UTR；B： 不同组荧光素酶活性比较；与miR-1721 mimics组相比，**P<0.01
2.2 MTT法和Transwell检测细胞增殖和侵袭能力结果
分别以100nmol/L浓度的miR-1721mimics和inhibitor作用于人前列腺癌细胞株PC-3细胞24、48、72、96h后，与对照组相比较，miR-1721抑制作用一定程度上呈时间依赖性。当作用时间为96h、浓度为100nmol/L时的miR-1721mimics，对该株细胞的增殖抑制作用最强，抑制率为43.9%(P<0.05)，见图2。Transwell实验结果显示，miR-1721-mimics组穿过基质胶的PC-3细胞明显少于miR-1721 inhibitor组，差异有统计学意义(P<0.05)，这一结果说明，miR-1721对PC-3细胞的侵袭能力有显著抑制作用，见图3。
图2 miR-1721对前列腺PC-3细胞的抑制作用
Fig.2 miR-1721 inhibits PC-3 cell proliferation in time dependent
与miR-1721 inhibitor组相比，*P<0.05，**P<0.01
图3 转染miR-1721后细胞侵袭能力
Fig.3 Migration of prostate cancer PC-3 cells after transfected(×100)
与miR-1721 inhibitor组相比，*P<0.05
2.3 miR-1721负性调控CD44蛋白的表达
蛋白质免疫印迹法检测结果显示，miR-1721mimics组中CD44蛋白的表达水平较miR-1721 inhibitor组明显降低，灰度分析结果显示转染后CD44蛋白表达显著受到抑制，抑制率48.9%，见图4。
图4 转染miR-1721后PC-3细胞中CD44蛋白的表达
Fig.4 Western blotting analysis of CD44 protein levels
A： Western印迹法分析CD44蛋白水平；B： 不同组细胞CD44蛋白水平比较；与miR-1721inhibitor组相比，*P<0.05
2.4 miR-1721可显著抑制诱导PC-3干细胞的成球能力
采用干细胞培养液从前列腺癌PC-3细胞株中分离得到的PC-3成球前列腺癌肿瘤干细胞，将miR-1721mimics和miR-1721inhibitor分别转入PC-3成球干细胞中，96h后PC-3细胞成球能力显著下降，成球大小和数量显著下降，见图5。
图5 miR-1721对前列腺癌PC-3干细胞微球体细胞形成的作用
Fig.5 Effect of miR-1721 on mammosphere and the size of PC-3 stem cells
与miR-1721inhibitor组相比，*P<0.05
Reya等[11]在比较了肿瘤细胞和干细胞的特性之后，提出了“肿瘤干细胞”的概念，即在肿瘤组织中存在一小群具备自我更新和不定向分化潜能的细胞群，它们是各种肿瘤形成的起始细胞，而绝大部分肿瘤细胞只具备有限的增殖能力。
Hanlon等[12]发现超过65%的慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者中有miR-16与miR-15的高表达。随后一些研究表明，在一些重要肿瘤如乳腺癌、膀胱癌、食管癌、前列腺癌和胰腺癌中存在特异miRNAs的表达[13-14]。Blenkiron等[15]在93例乳腺癌病例中根据miRNAs表达差异将乳腺癌分为4种分子类型(腺样A，腺样B，基底样型和HER2阳性)。根据miRNAs表达差异与ER表达不同进一步将HER2阴性即基底样型分为两种亚型，HER2-/ER+和HER2-/ER-。同一种miRNA在不同的肿瘤中均具有相同生物学作用，如高表达的miR-21在头颈部肿瘤细胞系抑制癌基因的转录，在乳腺癌中增加乳腺癌细胞的致瘤性，在神经胶质瘤动物模型中敲除miR-21能抑制肿瘤细胞的致瘤性。研究表明，自我更新能力是CSCs最重要的特征，基因改变或者表观遗传学的改变导致CSCs的自我更新能力失调控。自我更新能力可能是肿瘤发生、化疗耐受、肿瘤复发的主要原因。Murata等[16]在胶质母细胞瘤中的研究表明，miRNAs在未分化的干细胞中存在与肿瘤细胞相似的异常表达，这些异常表达的miRNAs通过调节CSCs相关通路促进其自我更新能力。有研究显示，let-7负向调控RAS、HMGA2，而RAS对于维持CSCs的自我更新能力至关重要，沉默RAS将降低球囊形成率、克隆增殖以及致瘤性。此外，在白血病中miR-15a和miR-16-1低表达引起Bcl-2高表达从而抑制细胞凋亡[17]。在前列腺癌中miR-15a和miR-16-1的下调将激活Wnt通路，从而促进肿瘤细胞增殖与侵袭。Bcl-2与Wnt通路是维持CSCs的自我更新能力的必要条件[18]。
近年来，研究者已在多种实体肿瘤中鉴定出各种干细胞特异性的表面标志物，其中CD44和CD133是得到了广泛认可的标志物。本实验结果提示miR-1721可通过靶向调控CD44表达抑制前列腺癌肿瘤细胞和其干细胞的增殖和侵袭能力。利用CSCs的生物学特征，开发对其有杀伤作用的特异的药物而达到治疗作用也许会是行之有效的肿瘤靶向治疗思路。
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miR-1721 suppresses proliferation and invasion of prostate cancer cells and its stem cells by targeting CD44
YANG Bo1， WEN Xiao-fei2, LIU Hui1, LIU Feng1， DENG Xiao-jun1， LIAO Guo-qiang1
(1. Dept. of Urology, Shanghai Zhoupu Hospital, Shanghai University of Medicine & Health Sciences, Shanghai 201318, China; 2. Dept. of Ulology, East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China)
【Abstract】Objective To investigate the effect of miR-1721 on the proliferation and invasion of prostate cancer cells by targeting CD44. Methods The CD44 3′-untranslated region mRNA-luciferase reporter vector was constructed and the dual-luciferase reporter gene assay was employed to examine the effect of miR-1721 on activity of luciferase. Prostate cancer PC-3 cells were transfected with miR-1721 mimics by LipofectAMINE-2000, and the expressions level of CD44 protein was detected by Western blotting. The inhibition effects of CD44 on cell proliferation and invasion were observed after CD44 siRNA were transfected into PC-3 cells. PC-3-sc cells mammosphere assay was performed after cotransfection with miR-1721 mimics and CD44 siRNA. Results miR-1721 could bind to the 3′-UTR of CD44 and inhibited the activity of luciferase. Then CD44 protein expression was significantly down-regulated when miR-1721 was overexpressed in PC-3 cells. Overexpression of miR-1721 inhibited the invasion of PC-3 cells. Overexpression of miR-1721 antagonized a role of proliferation and invasion in PC-3 cells. Overexpression of miR-1721 reduced mammosphere number and the size of prostate cancer stem cells. Conclusion The miR-1721 expression can suppress cell proliferation and invasion by targeting CD44 in prostate cancer cells.
【Key words】prostate carcinoma; CD44; stem cell genetic marker; miRNAs
doi：10.16118/j.1008-0392.2016.04.005
收稿日期：2015-12-04
基金项目：上海市卫生和计划生育委员会科研课题(20134428)；上海市浦东新区卫生系统优秀学科带头人培养计划(PWRd2011-08)；吴阶平医学基金(320.6750.14197)
作者简介：杨 波(1971—)，男，副主任医师、副教授，博士研究生.E-mail： paulyang228@hotmail.com
【中图分类号】R 737.25
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2016)04-0025-06